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通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体

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DOI：

10.3791/51682

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2014年9月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

本文内容

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摘要

本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于<30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。

摘要

先前描述的使用差速离心和/或Ficoll梯度离心的线粒体分离方法需要60至100分钟才能完成。我们介绍一种利用商用组织解离仪和差速过滤法从哺乳动物活检组织中快速分离线粒体的方法。在此方案中，手动匀浆被组织解离仪的标准匀浆循环所取代，从而实现均匀且一致的组织匀浆，这是手动匀浆难以达到的效果。在组织解离后，匀浆液通过尼龙网滤器过滤，从而省去了重复的离心步骤。因此，线粒体分离可在30分钟内完成。该分离方案可从0.18 ± 0.04 g（湿重）的组织样本中获得约2 × 1010个具有活力且具备呼吸功能的线粒体。

引言

线粒体存在于人体除红细胞外的每个细胞中，参与大量重要的细胞和代谢过程1-4。由于具有多种功能，线粒体损伤可能产生有害影响3。为了研究线粒体功能与功能障碍，已有多种线粒体分离方法被报道。最早关于线粒体分离的文献可追溯至20世纪40年代5-8。首次有记录的尝试是通过研钵研磨肝组织，随后在盐溶液中以低速离心实现线粒体分离5,8。此后，其他研究团队在此基础上进行了改进，发展出基于差速离心的组织分级分离技术6-8。这些早期方法奠定了当前技术的基础，现代方法通常结合了匀浆和/或差速离心步骤9-15。不同实验方案中匀浆和离心步骤的数量各不相同。这些重复操作延长了线粒体分离所需时间，并最终降低其活性。此外，若操作控制不当，手工匀浆可能导致线粒体损伤并产生不一致的结果10,16。

近期，我们采用匀浆和差速离心法分离线粒体，并将其移植至心肌组织17,18。该分离过程耗时较长，约需90分钟，因此其临床应用受到限制。为了实现在线粒体在临床和外科治疗中的急性治疗用途，我们开发了一种快速的线粒体分离方法，可在30分钟内完成。

本方案的主要优势在于，标准化的组织解离可实现均匀且一致的组织匀浆，而手动匀浆难以达到这种效果。此外，采用差速过滤替代差速离心，避免了耗时且重复的离心步骤，从而能够更快速地分离出高纯度、具有活性且具备呼吸功能的线粒体。

在不到30分钟内分离出具有活性且具备呼吸功能的线粒体，使其具备临床应用价值。该分离方案有望应用于冠状动脉旁路移植术（CABG）及其他治疗性操作中。

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方案

准备

  1. 配制 1 M K-HEPES 储存液（用 KOH 调节 pH 至 7.2）。
  2. 配制 0.5 M K-EGTA 储存液（用 KOH 调节 pH 至 8.0）。
  3. 配制 1 M KH2PO4 储存液。
  4. 配制 1 M MgCl2 储存液。
  5. 配制匀浆缓冲液（pH 7.2）：300 mM 蔗糖、10 mM K-HEPES 和 1 mM K-EGTA。4 °C 保存。
  6. 配制呼吸缓冲液：250 mM 蔗糖、2 mM KH2PO4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES 缓冲液（pH 7.2）和 0.5 mM K-EGTA（pH 8.0）。4 °C 保存。
  7. 通过将 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4 和 2.4 g KH2PO4 溶解于 1 L 双蒸 H2O 中配制 10x PBS 储存液（pH 7.4）。
  8. 取 100 ml 10x PBS 加入 1 L 双蒸 H2O 中，配制 1x PBS。
  9. 通过称取 4 mg 枯草杆菌蛋白酶 A（Subtilisin A）至 1.5 ml 微离心管中配制枯草杆菌蛋白酶 A 储存液。-20 °C 保存至使用。
  10. 通过称取 20 mg 牛血清白蛋白（BSA）至 1.5 ml 微离心管中配制 BSA 储存液。-20 °C 保存至使用。

线粒体分离（图 1）

  1. 分离前立即用1 ml均质缓冲液溶解Subtilisin A。
  2. 分离前立即用1 ml均质缓冲液溶解BSA。
  3. 使用6 mm活检取样器采集两份新鲜组织样本，并将其置于盛有1x PBS的50 ml锥形离心管中，冰上保存。
  4. 将两份6 mm组织样本转移至含有5 ml冰冻均质缓冲液的解离C管中。
  5. 将解离C管安装至组织解离仪上，启动预设的线粒体分离程序（均质化60秒），对组织进行均质处理。
  6. 将解离C管转移至装有冰的容器中。
  7. 向匀浆液中加入250 μl Subtilisin A储存液，通过倒置混匀，并在冰上孵育10分钟。
    1. 若组织为纤维性组织，此步骤可选：以750 × g离心4分钟。
  8. 将40 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将匀浆液过滤至该离心管中。
  9. 向滤液中加入250 µl新鲜配制的BSA储存液，通过倒置混匀。
    注意：如需进行线粒体蛋白测定，则省略此步骤。
  10. 将40 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将滤液再次过滤至该离心管中。
  11. 将10 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将滤液过滤至该离心管中。
  12. 将滤液转移至两个预冷的1.5 ml微量离心管中，在4 ºC下以9,000 × g离心10分钟。
  13. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml冰冻呼吸缓冲液中，并合并沉淀。

ATP 检测

注意：为了测定分离线粒体的代谢活性，可使用ATP检测试剂盒进行ATP发光检测。检测试剂盒中已提供相应的实验方案、试剂和标准品。以下为该操作步骤的简要说明。

  1. 将试剂盒试剂平衡至室温。
  2. 将冻干的ATP粉末溶于1,170 µl双蒸水中，配制10 mM ATP储备液。ATP标准储备液和制备好的线粒体样品置于冰上保存。
  3. 向一管冻干底物溶液中加入5 ml底物缓冲液，轻轻混匀后避光放置。
  4. 向黑色不透光底96孔板的所有孔中加入100 µl呼吸缓冲液。 
  5. 将制备好的样品中的10 µl线粒体加入黑色不透光底96孔板的各个孔中。注意：样品需设三个复孔。设一排用于标准品，并设三个负对照孔（仅含呼吸缓冲液）。
  6. 向所有孔（包括标准品和对照孔）中加入50 µl哺乳动物细胞裂解液。
  7. 将酶标板置于37 ºC、125 rpm的振荡培养箱中孵育5分钟。
  8. 在孵育期间，用10 mM ATP储备液配制浓度分别为0.1 mM、0.05 mM、0.01 mM、0.005 mM、0.001 mM和0.0001 mM的ATP标准品溶液，标准品置于冰上保存。
  9. 孵育结束后，根据板图指示，向相应孔中加入10 µl ATP标准品溶液。注意：标准品设两个复孔。
  10. 向每个孔中加入50 µl重构后的底物溶液。
  11. 将酶标板置于37 ºC、125 rpm的振荡培养箱中继续孵育5分钟。
  12. 在连接分光光度计的计算机上打开Gen5 1.11软件。
  13. 在“创建新项目”下，点击“实验”。
  14. 点击“默认方案”，然后点击“确定”。
  15. 在左侧栏中选择“方案”，然后选择“步骤”。
  16. 选择“延迟”，设置为00:10:00，点击“确定”。
  17. 选择“读数”，从下拉菜单中选择“发光检测”，并调整其他参数如下：读数类型为终点法，积分时间0:01.00 MM:SS.ss，滤光片设置1，发射孔，光路位置为顶部，灵敏度100，顶部探针垂直偏移1.00 mm。
  18. 当酶标板准备就绪后，点击顶部的“读板”图标，然后点击“读数”。当分光光度计打开后，将酶标板放入托盘中，确保A1孔位于左上角。此时会弹出温度提示框，点击“读数”。注意：信号值越高，表明ATP水平越高，代谢活性越强。

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结果

使用组织解离和差速过滤法分离线粒体的操作步骤示意图如图所示 图1总操作时间少于30分钟。

使用6 mm活检穿孔器获取组织样本。组织重量为0.18 ± 0.04 g（湿重）。通过颗粒大小计数测定的线粒体数量显示，骨骼肌中分离得到的线粒体数量为2.4 × 1010 ± 0.1 × 1010，肝脏组织中为2.75 × 1010 ± 0.1 × 1010（图2A）。为便于比较，还使用血细胞计数板测定线粒体数量。血细胞计数板测定结果显示，骨骼肌中线粒体数量低估为0.11 × 1010 ± 0.04 × 1010，肝脏组织中为0.34 × 1010 ± 0.09 × 1010（图2A）。基于粒径分析仪测定的线粒体直径如图2B所示。代表性图谱显示，分离的线粒体集中在单一峰内，平均直径为0....

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讨论

要成功利用本方案分离线粒体，必须将所有溶液和组织样本保持在冰上，以维持线粒体的活性。即使始终置于冰上，分离得到的线粒体其功能活性也会随着时间推移而下降19。我们建议所有溶液和添加物均预先配制。我们将Subtilisin A预先称重，以4 mg分装于1.5 ml微量离心管中，于-20 °C保存。同样，将BSA预先称重，以20 mg分装于1.5 ml微量离心管中，也可在-20 °C保存。使用前，将上述分装管从-20 °C取出，分别用1 ml匀浆缓冲液溶解Subtilisin A和BSA，用于线粒体分离实验。

使用6 mm活检穿孔器从骨骼肌组织获取的两块活检样本，足以提供用于临床和外科手术治疗干预所需的线粒体17-18。为了估算线粒体数量，我们采用了两种方法：血细胞计数板法和颗粒大小计数法。推荐使用颗粒大小计数法。颗粒大小计数仪利用电阻抗技术，测量通过特定尺寸孔径的颗粒体积。尽管颗粒大小计数仪成本较高，但其提供的估算结果准确可靠，且不受操作者影响。通过血细胞计数板法估算线粒体数量则更为经济。我们的研究表明，该方法所得结果变异较大，估算值通常比颗...

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披露

所有动物均按照现行的机构指南进行处理。我们没有需要披露的竞争性财务利益。

致谢

本研究由美国国家心肺血液研究所资助项目HL-103542以及波士顿儿童医院麻醉研究基金会授予CAP的杰出开拓者奖支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔗糖Sigma Aldrich84100
HEPESSigma AldrichH4034
EGTASigma AldrichE4378
Substilsin ASigma AldrichP5380
BSASigma AldrichA7906
KH2PO4Sigma AldrichP5379
MgCl2Sigma AldrichM8266
NaClSigma AldrichS6191
KClFisher ScientificP2173
Na2HPO4Fisher ScientificS374
ATPlite 发光检测试剂系统，
1,000 次检测装		Perkin Elmer6016941
50 ml 圆锥形离心管BD352098
40 μm 尼龙滤器BD 352340
GentleMACS C 管Miltenyl Biotech120-005-331
1.5 ml Eppendorf 管Fisher Scientific05-408-129
6 mm 活检打孔器Miltex33-36
10 μm Pluristrainer 滤器Pluriselect43-500-10-03
Eppendorf 离心机 5415CMarshall ScientificEP-5415C 
GentleMACS 组织解离仪 Miltenyl Biotech130-093-235
96 孔板，组织培养处理VWR82050-732
Rotomax 120 旋转摇床Heidolph544-41200-00
Synergy H4 多功能混合型
 微孔板读板仪		BioTek
Multisizer 4 库尔特计数器Beckman CoulterA63076
Oxytherm 系统Hansatech Instruments
血细胞计数板Fisher Scientific267110

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

标签

ATP

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