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通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体

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DOI：

10.3791/51682

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2014年9月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

通讯作者： James D. McCully <james_mccully@hms.harvard.edu>

本文内容

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摘要

本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于<30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。

摘要

先前描述的使用差速离心和/或Ficoll梯度离心的线粒体分离方法需要60至100分钟才能完成。我们介绍一种利用商用组织解离仪和差速过滤法从哺乳动物活检组织中快速分离线粒体的方法。在此方案中，手动匀浆被组织解离仪的标准匀浆循环所取代，从而实现均匀且一致的组织匀浆，这是手动匀浆难以达到的效果。在组织解离后，匀浆液通过尼龙网滤器过滤，从而省去了重复的离心步骤。因此，线粒体分离可在30分钟内完成。该分离方案可从0.18 ± 0.04 g（湿重）的组织样本中获得约2 × 1010个具有活力且具备呼吸功能的线粒体。

引言

线粒体存在于人体除红细胞外的每个细胞中，参与大量重要的细胞和代谢过程1-4。由于具有多种功能，线粒体损伤可能产生有害影响3。为了研究线粒体功能与功能障碍，已有多种线粒体分离方法被报道。最早关于线粒体分离的文献可追溯至20世纪40年代5-8。首次有记录的尝试是通过研钵研磨肝组织，随后在盐溶液中以低速离心实现线粒体分离5,8。此后，其他研究团队在此基础上进行了改进，发展出基于差速离心的组织分级分离技术6-8。这些早期方法奠定了当前技术的基础，现代方法通常结合了匀浆和/或差速离心步骤9-15。不同实验方案中匀浆和离心步骤的数量各不相同。这些重复操作延长了线粒体分离所需时间，并最终降低其活性。此外，若操作控制不当，手工匀浆可能导致线粒体损伤并产生不一致的结果10,16。

近期，我们采用匀浆和差速离心法分离线粒体，并将其移植至心肌组织17,18。该分离过程耗时较长，约需90分钟，因此其临床应用受到限制。为了实现在线粒体在临床和外科治疗中的急性治疗用途，我们开发了一种快速的线粒体分离方法，可在30分钟内完成。

本方案的主要优势在于，标准化的组织解离可实现均匀且一致的组织匀浆，而手动匀浆难以达到这种效果。此外，采用差速过滤替代差速离心，避免了耗时且重复的离心步骤，从而能够更快速地分离出高纯度、具有活性且具备呼吸功能的线粒体。

在不到30分钟内分离出具有活性且具备呼吸功能的线粒体，使其具备临床应用价值。该分离方案有望应用于冠状动脉旁路移植术（CABG）及其他治疗性操作中。

方案

准备

  1. 配制 1 M K-HEPES 储存液（用 KOH 调节 pH 至 7.2）。
  2. 配制 0.5 M K-EGTA 储存液（用 KOH 调节 pH 至 8.0）。
  3. 配制 1 M KH2PO4 储存液。
  4. 配制 1 M MgCl2 储存液。
  5. 配制匀浆缓冲液（pH 7.2）：300 mM 蔗糖、10 mM K-HEPES 和 1 mM K-EGTA。4 °C 保存。
  6. 配制呼吸缓冲液：250 mM 蔗糖、2 mM KH2PO4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES 缓冲液（pH 7.2）和 0.5 mM K-EGTA（pH 8.0）。4 °C 保存。
  7. 通过将 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4 和 2.4 g KH2PO4 溶解于 1 L 双蒸 H2O 中配制 10x PBS 储存液（pH 7.4）。
  8. 取 100 ml 10x PBS 加入 1 L 双蒸 H2O 中，配制 1x PBS。
  9. 通过称取 4 mg 枯草杆菌蛋白酶 A（Subtilisin A）至 1.5 ml 微离心管中配制枯草杆菌蛋白酶 A 储存液。-20 °C 保存至使用。
  10. 通过称取 20 mg 牛血清白蛋白（BSA）至 1.5 ml 微离心管中配制 BSA 储存液。-20 °C 保存至使用。

线粒体分离（图 1）

  1. 分离前立即用1 ml均质缓冲液溶解Subtilisin A。
  2. 分离前立即用1 ml均质缓冲液溶解BSA。
  3. 使用6 mm活检取样器采集两份新鲜组织样本，并将其置于盛有1x PBS的50 ml锥形离心管中，冰上保存。
  4. 将两份6 mm组织样本转移至含有5 ml冰冻均质缓冲液的解离C管中。
  5. 将解离C管安装至组织解离仪上，启动预设的线粒体分离程序（均质化60秒），对组织进行均质处理。
  6. 将解离C管转移至装有冰的容器中。
  7. 向匀浆液中加入250 μl Subtilisin A储存液，通过倒置混匀，并在冰上孵育10分钟。
    1. 若组织为纤维性组织，此步骤可选：以750 × g离心4分钟。
  8. 将40 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将匀浆液过滤至该离心管中。
  9. 向滤液中加入250 µl新鲜配制的BSA储存液，通过倒置混匀。
    注意：如需进行线粒体蛋白测定，则省略此步骤。
  10. 将40 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将滤液再次过滤至该离心管中。
  11. 将10 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将滤液过滤至该离心管中。
  12. 将滤液转移至两个预冷的1.5 ml微量离心管中，在4 ºC下以9,000 × g离心10分钟。
  13. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml冰冻呼吸缓冲液中，并合并沉淀。

ATP 检测

注意：为了测定分离线粒体的代谢活性，可使用ATP检测试剂盒进行ATP发光检测。检测试剂盒中已提供相应的实验方案、试剂和标准品。以下为该操作步骤的简要说明。

  1. 将试剂盒试剂平衡至室温。
  2. 将冻干的ATP粉末溶于1,170 µl双蒸水中，配制10 mM ATP储备液。ATP标准储备液和制备好的线粒体样品置于冰上保存。
  3. 向一管冻干底物溶液中加入5 ml底物缓冲液，轻轻混匀后避光放置。
  4. 向黑色不透光底96孔板的所有孔中加入100 µl呼吸缓冲液。 
  5. 将制备好的样品中的10 µl线粒体加入黑色不透光底96孔板的各个孔中。注意：样品需设三个复孔。设一排用于标准品，并设三个负对照孔（仅含呼吸缓冲液）。
  6. 向所有孔（包括标准品和对照孔）中加入50 µl哺乳动物细胞裂解液。
  7. 将酶标板置于37 ºC、125 rpm的振荡培养箱中孵育5分钟。
  8. 在孵育期间，用10 mM ATP储备液配制浓度分别为0.1 mM、0.05 mM、0.01 mM、0.005 mM、0.001 mM和0.0001 mM的ATP标准品溶液，标准品置于冰上保存。
  9. 孵育结束后，根据板图指示，向相应孔中加入10 µl ATP标准品溶液。注意：标准品设两个复孔。
  10. 向每个孔中加入50 µl重构后的底物溶液。
  11. 将酶标板置于37 ºC、125 rpm的振荡培养箱中继续孵育5分钟。
  12. 在连接分光光度计的计算机上打开Gen5 1.11软件。
  13. 在“创建新项目”下，点击“实验”。
  14. 点击“默认方案”，然后点击“确定”。
  15. 在左侧栏中选择“方案”，然后选择“步骤”。
  16. 选择“延迟”，设置为00:10:00，点击“确定”。
  17. 选择“读数”，从下拉菜单中选择“发光检测”，并调整其他参数如下：读数类型为终点法，积分时间0:01.00 MM:SS.ss，滤光片设置1，发射孔，光路位置为顶部，灵敏度100，顶部探针垂直偏移1.00 mm。
  18. 当酶标板准备就绪后，点击顶部的“读板”图标，然后点击“读数”。当分光光度计打开后，将酶标板放入托盘中，确保A1孔位于左上角。此时会弹出温度提示框，点击“读数”。注意：信号值越高，表明ATP水平越高，代谢活性越强。

结果

使用组织解离和差速过滤法分离线粒体的操作步骤示意图如图所示 图1总操作时间少于30分钟。

使用6 mm活检穿孔器获取组织样本。组织重量为0.18 ± 0.04 g（湿重）。通过颗粒大小计数测定的线粒体数量显示，骨骼肌中分离得到的线粒体数量为2.4 × 1010 ± 0.1 × 1010，肝脏组织中为2.75 × 1010 ± 0.1 × 1010（图2A）。为便于比较，还使用血细胞计数板测定线粒体数量。血细胞计数板测定结果显示，骨骼肌中线粒体数量低估为0.11 × 1010 ± 0.04 × 1010，肝脏组织中为0.34 × 1010 ± 0.09 × 1010（图2A）。基于粒径分析仪测定的线粒体直径如图2B所示。代表性图谱显示，分离的线粒体集中在单一峰内，平均直径为0.38 ± 0.17 µm，与先前报道结果一致7。

通过双辛可宁酸（BCA）法测定，起始组织每克湿重的线粒体蛋白含量在骨骼肌和肝脏样本中分别为4.8 ± 2.9 mg/g（湿重）和7.3 ± 3.5 mg/g（湿重）（图2C）。

线粒体纯度通过透射电子显微镜测定，结果如图2D所示。线粒体呈电子致密，破裂或受损的比例低于0.01%。非线粒体颗粒的污染率低于0.001%。

线粒体活力通过MitoTracker Red检测，方法如前所述17,18。我们的结果表明，分离的线粒体保持了膜电位（图3A - C）。

使用发光法检测试剂盒测定ATP含量。ATP检测的孔板布局见图4。ATP标准品设双复孔，线粒体样品和阴性对照设三复孔。骨骼肌和肝脏样品的ATP含量分别为10.67±4.38 nmol/mg线粒体蛋白和14.83±4.36 nmol/mg线粒体蛋白（图3D）。

采用之前描述的克拉克型电极法评估线粒体呼吸17,18。骨骼肌和肝脏样本的线粒体耗氧速率分别为 178 ± 17 nM O2/min/mg 线粒体蛋白和 176 ± 23 nM O2/min/mg 线粒体蛋白。骨骼肌和肝脏样本制备物的呼吸控制指数（RCI）值分别为 2.45 ± 0.34 和 2.67 ± 0.17（图 3E）。这些结果与我们先前使用手动匀浆和差速离心法分离线粒体的研究报道结果相似17-18。

使用蛋白酶A和BSA步骤及离心时间线的蛋白质纯化方法示意图。
图1. 利用组织解离和差速过滤法分离线粒体的示意图。（A）将两个6 mm的活检样本打孔组织转移至解离C管中的5 ml匀浆缓冲液中，并使用组织解离仪的1分钟匀浆程序对样本进行匀浆处理。（B）向解离C管中的匀浆液中加入250 µl蛋白酶A储存液，冰上孵育10分钟。（C）将匀浆液在冰上通过预湿的40 µm网孔滤膜（置于50 ml锥形离心管中）过滤，然后向滤液中加入250 µl BSA储存液。（D）将滤液在冰上通过新的预湿40 µm网孔滤膜（置于50 ml锥形离心管中）再次过滤。（E）将滤液在冰上通过新的预湿10 µm网孔滤膜（置于50 ml锥形离心管中）再次过滤。（F）将滤液转移至1.5 ml微量离心管中，在4 °C下以9,000 × g离心10分钟。（G）弃去上清液，将线粒体沉淀物重悬于1 ml呼吸缓冲液中并合并。整个操作过程耗时少于30分钟。请点击此处查看该图的放大版本。

骨骼肌和肝脏中的线粒体分析；柱状图、折线图、蛋白质图表、电镜图像。
图2. 线粒体得率与纯度。（A） 使用血细胞计数板和颗粒大小计数器测定从0.18 ± 0.04 g组织（湿重）中分离得到的骨骼肌和肝脏线粒体数量。（B） 通过颗粒大小计数器检测的线粒体大小（mg/g）分布情况。（C） 骨骼肌和肝脏组织每克湿重的线粒体蛋白含量（mg/g）。（D） 分离线粒体的透射电子显微镜图像。标尺为100 nm。箭头指示可能存在的非线粒体颗粒污染及受损线粒体。请点击此处查看该图的放大版本。

线粒体生物能量学；显微图像和柱状图；线粒体活性比较。
图3. 线粒体活力。分离线粒体的代表性显微照片：(A) 相差照明下，以及(B 和 C) 荧光照明下，线粒体经MitoTracker Red CMXRos标记。标尺分别为25 μm (A, B) 和5 μm (C)。这些图像表明线粒体维持了膜电位。 箭头指示失去膜电位的线粒体或碎片 (D) 通过ATP检测试剂盒测定的ATP含量（nmol/mg线粒体蛋白），以及(E) 通过克拉克电极测定的呼吸控制指数（RCI，状态3/状态4）。请点击此处查看该图的放大版本。

ATP 检测板布局；ATP 标准品、线粒体样品、呼吸缓冲液；实验设置。
图 4. ATP 检测的孔板图。 该孔板图展示了 ATP 检测中标准品 (A1 - A12)、线粒体样品 (B1 - C6) 和阴性对照 (C7 - C9) 的设置方法。在检测过程中，向所有孔 (A1 - C9) 中加入 100 µl 呼吸缓冲液、50 µl 哺乳动物细胞裂解液和 50 µl 重建的底物溶液。

讨论

要成功利用本方案分离线粒体，必须将所有溶液和组织样本保持在冰上，以维持线粒体的活性。即使始终置于冰上，分离得到的线粒体其功能活性也会随着时间推移而下降19。我们建议所有溶液和添加物均预先配制。我们将Subtilisin A预先称重，以4 mg分装于1.5 ml微量离心管中，于-20 °C保存。同样，将BSA预先称重，以20 mg分装于1.5 ml微量离心管中，也可在-20 °C保存。使用前，将上述分装管从-20 °C取出，分别用1 ml匀浆缓冲液溶解Subtilisin A和BSA，用于线粒体分离实验。

使用6 mm活检穿孔器从骨骼肌组织获取的两块活检样本，足以提供用于临床和外科手术治疗干预所需的线粒体17-18。为了估算线粒体数量，我们采用了两种方法：血细胞计数板法和颗粒大小计数法。推荐使用颗粒大小计数法。颗粒大小计数仪利用电阻抗技术，测量通过特定尺寸孔径的颗粒体积。尽管颗粒大小计数仪成本较高，但其提供的估算结果准确可靠，且不受操作者影响。通过血细胞计数板法估算线粒体数量则更为经济。我们的研究表明，该方法所得结果变异较大，估算值通常比颗粒大小计数仪的结果低约一个数量级。我们还注意到，血细胞计数板法的计数结果高度依赖于操作者。因此，建议为确保估算结果的一致性，所有血细胞计数板计数应由同一人完成。

我们发现ATP检测试剂盒可用于测定线粒体功能。该试剂盒提供了所有必需的试剂，能够简便快速地测定分离线粒体的代谢活性。ATP检测结果与使用克拉克型电极获得的结果相似，因此与以往的数据分析具有可比性20-21。

本线粒体分离方案的一个主要优势在于，可在不到30分钟内获得高产量、具有呼吸活性且无污染的活线粒体。采用差速过滤替代差速离心显著缩短了操作时间。其他方案通常包含多次离心步骤，总分离时间在60至100分钟之间13-17。本方案的另一优势是组织匀浆过程实现了标准化。商用组织解离仪提供标准化的处理循环，从而获得一致且可重复的结果。这与手动匀浆形成对比，后者易受操作者差异影响，导致结果不一致。本方法通过组织解离与差速过滤实现线粒体的快速分离，其时间框架适用于临床及外科治疗干预17,18。

披露

所有动物均按照现行的机构指南进行处理。我们没有需要披露的竞争性财务利益。

致谢

本研究由美国国家心肺血液研究所资助项目HL-103542以及波士顿儿童医院麻醉研究基金会授予CAP的杰出开拓者奖支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔗糖Sigma Aldrich84100
HEPESSigma AldrichH4034
EGTASigma AldrichE4378
Substilsin ASigma AldrichP5380
BSASigma AldrichA7906
KH2PO4Sigma AldrichP5379
MgCl2Sigma AldrichM8266
NaClSigma AldrichS6191
KClFisher ScientificP2173
Na2HPO4Fisher ScientificS374
ATPlite 发光检测试剂系统，
1,000 次检测装		Perkin Elmer6016941
50 ml 圆锥形离心管BD352098
40 μm 尼龙滤器BD 352340
GentleMACS C 管Miltenyl Biotech120-005-331
1.5 ml Eppendorf 管Fisher Scientific05-408-129
6 mm 活检打孔器Miltex33-36
10 μm Pluristrainer 滤器Pluriselect43-500-10-03
Eppendorf 离心机 5415CMarshall ScientificEP-5415C 
GentleMACS 组织解离仪 Miltenyl Biotech130-093-235
96 孔板，组织培养处理VWR82050-732
Rotomax 120 旋转摇床Heidolph544-41200-00
Synergy H4 多功能混合型
 微孔板读板仪		BioTek
Multisizer 4 库尔特计数器Beckman CoulterA63076
Oxytherm 系统Hansatech Instruments
血细胞计数板Fisher Scientific267110

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

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线粒体分离线粒体纯化呼吸功能完整的线粒体ATP发光检测组织匀浆线粒体得率线粒体活力线粒体呼吸分析
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