本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于<30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。
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摘要
摘要
先前描述的使用差速离心和/或Ficoll梯度离心的线粒体分离方法需要60至100分钟才能完成。我们介绍一种利用商用组织解离仪和差速过滤法从哺乳动物活检组织中快速分离线粒体的方法。在此方案中，手动匀浆被组织解离仪的标准匀浆循环所取代，从而实现均匀且一致的组织匀浆，这是手动匀浆难以达到的效果。在组织解离后，匀浆液通过尼龙网滤器过滤，从而省去了重复的离心步骤。因此，线粒体分离可在30分钟内完成。该分离方案可从0.18 ± 0.04 g（湿重）的组织样本中获得约2 × 1010个具有活力且具备呼吸功能的线粒体。
引言
线粒体存在于人体除红细胞外的每个细胞中，参与大量重要的细胞和代谢过程1-4。由于具有多种功能，线粒体损伤可能产生有害影响3。为了研究线粒体功能与功能障碍，已有多种线粒体分离方法被报道。最早关于线粒体分离的文献可追溯至20世纪40年代5-8。首次有记录的尝试是通过研钵研磨肝组织，随后在盐溶液中以低速离心实现线粒体分离5,8。此后，其他研究团队在此基础上进行了改进，发展出基于差速离心的组织分级分离技术6-8。这些早期方法奠定了当前技术的基础，现代方法通常结合了匀浆和/或差速离心步骤9-15。不同实验方案中匀浆和离心步骤的数量各不相同。这些重复操作延长了线粒体分离所需时间，并最终降低其活性。此外，若操作控制不当，手工匀浆可能导致线粒体损伤并产生不一致的结果10,16。
近期，我们采用匀浆和差速离心法分离线粒体，并将其移植至心肌组织17,18。该分离过程耗时较长，约需90分钟，因此其临床应用受到限制。为了实现在线粒体在临床和外科治疗中的急性治疗用途，我们开发了一种快速的线粒体分离方法，可在30分钟内完成。
本方案的主要优势在于，标准化的组织解离可实现均匀且一致的组织匀浆，而手动匀浆难以达到这种效果。此外，采用差速过滤替代差速离心，避免了耗时且重复的离心步骤....
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方案
准备
- 配制 1 M K-HEPES 储存液（用 KOH 调节 pH 至 7.2）。
- 配制 0.5 M K-EGTA 储存液（用 KOH 调节 pH 至 8.0）。
- 配制 1 M KH2PO4 储存液。
- 配制 1 M MgCl2 储存液。
- 配制匀浆缓冲液（pH 7.2）：300 mM 蔗糖、10 mM K-HEPES 和 1 mM K-EGTA。4 °C 保存。
- 配制呼吸缓冲液：250 mM 蔗糖、2 mM KH2PO4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES 缓冲液（pH 7.2）和 0.5 mM K-EGTA（pH 8.0）。4 °C 保存。
- 通过将 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4 和 2.4 g KH2PO4 溶解于 1 L 双蒸 H2O 中配制 10x PBS 储存液（pH 7.4）。
- 取 100 ml 10x PBS 加入 1 L 双蒸 H2O 中，配制 1x PBS。
- 通过称取 4 mg 枯草杆菌蛋白酶 A（Subtilisin A....
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结果
使用组织解离和差速过滤法分离线粒体的操作步骤示意图如图所示 图1总操作时间少于30分钟。
使用6 mm活检穿孔器获取组织样本。组织重量为0.18 ± 0.04 g（湿重）。通过颗粒大小计数测定的线粒体数量显示，骨骼肌中分离得到的线粒体数量为2.4 × 1010 ± 0.1 × 1010，肝脏组织中为2.75 × 1010 ± 0.1 × 1010（图2A）。为便于比较，还使用血细胞计数板测定线粒体数量。血细胞计数板测定结果显示，骨骼肌中线粒体数量低估为0.11 × 1010 ± 0.04 × 1010，肝脏组织中为0.34 × 1010 ± 0.09 × 1010（图2A）。基于粒径分析仪测定的线粒体直径如图2B所示。代表性图谱显示，分离的线粒体集中在单一峰内，平均直径为0........
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讨论
要成功利用本方案分离线粒体，必须将所有溶液和组织样本保持在冰上，以维持线粒体的活性。即使始终置于冰上，分离得到的线粒体其功能活性也会随着时间推移而下降19。我们建议所有溶液和添加物均预先配制。我们将Subtilisin A预先称重，以4 mg分装于1.5 ml微量离心管中，于-20 °C保存。同样，将BSA预先称重，以20 mg分装于1.5 ml微量离心管中，也可在-20 °C保存。使用前，将上述分装管从-20 °C取出，分别用1 ml匀浆缓冲液溶解Subtilisin A和BSA，用于线粒体分离实验。
使用6 mm活检穿孔器从骨骼肌组织获取的两块活检样本，足以提供用于临床和外科手术治疗干预所需的线粒体17-18。为了估算线粒体数量，我们采用了两种方法：血细胞计数板法和颗粒大小计数法。推荐使用颗粒大小计数法。颗粒大小计数仪利用电阻抗技术，测量通过特定尺寸孔径的颗粒体积。尽管颗粒大小计数仪成本较高，但其提供的估算结果准确可靠，且不受操作者影响。通过血细胞计数板法估算线粒体数量则更为经济。我们的研究表明，该方法所得结果变异较大，估算值通常比颗.......
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披露
所有动物均按照现行的机构指南进行处理。我们没有需要披露的竞争性财务利益。
致谢
本研究由美国国家心肺血液研究所资助项目HL-103542以及波士顿儿童医院麻醉研究基金会授予CAP的杰出开拓者奖支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite 发光检测试剂系统， 1,000 次检测装 | Perkin Elmer | 6016941 | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | BD | 352098 | |
| 40 μm 尼龙滤器 | BD | 352340 | |
| GentleMACS C 管 | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 ml Eppendorf 管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm 活检打孔器 | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer 滤器 | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf 离心机 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS 组织解离仪 | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96 孔板，组织培养处理 | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 旋转摇床 | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 多功能混合型 微孔板读板仪 | BioTek | ||
| Multisizer 4 库尔特计数器 | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm 系统 | Hansatech Instruments | ||
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 267110 |
参考文献
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
