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体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

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DOI：

10.3791/51683

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2014年9月4日

 ,  , 
1Department of Life Science and Facility for Imaging by Light Microscopy, Imperial College London, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

本文内容

摘要

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体 标记的HSPCs归巢至骨髓区域，追踪其相互作用与移动。

摘要

通过静息与增殖、自我更新与分化后代生成之间的精细平衡，造血干细胞（HSCs）维持着所有成熟血细胞谱系的更新。HSCs 命运的复杂信号协调依赖于 HSCs 与复杂的骨髓微环境之间的相互作用，而这一机制目前仍知之甚少[1-2]。

我们介绍如何通过将一种新开发的用于稳定动物定位的样本支架与多步共聚焦和双光子显微成像技术相结合 体内 成像技术，可以获得包含造血干细胞和祖细胞（HSPCs）及其周围微环境的高分辨率三维图像序列，并通过多时间点延时成像对它们进行长期监测。高分辨率成像能够实现对 离体 标记的骨髓内造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。此外，采用更快的采集参数获得的多点时间延时三维成像，可准确提供有关HSPC迁移及其与基质细胞之间相互作用的信息。

以GFP阳性成骨细胞为参照追踪HSPCs是该方法的一个示例性应用。该技术可用于在小鼠颅骨骨髓腔内追踪任何适当标记的造血细胞或基质细胞。

引言

尽管干细胞微环境已被认识数十年3，并在许多组织中得到了充分表征，例如嗅球、肌纤维、毛囊隆突区或中枢神经系统室管膜下区4-7，但由于难以透过骨骼直接观察单个细胞，以及骨髓组织本身具有高度动态的特性，造血干细胞（HSCs）与骨髓微环境（BM）之间的相互作用仍远未被充分阐明。已有大量功能研究表明，通过在HSCs或微环境中的基质细胞内特异性地敲除或过表达某些基因，揭示了多种细胞类型与调控信号之间构成的复杂网络，共同调控HSCs静息、增殖、扩增与分化之间的精细平衡1-2。只有通过直接观察，才能深入理解HSCs与其微环境之间的相互作用。得益于先进成像技术的发展，结合现有的显微镜技术、样品固定装置以及图像采集软件，这一目标已成为可能。

对移植的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）在小鼠颅骨骨髓腔内进行单细胞分辨率的活体成像显示，定植的HSPCs定位于表达SDF-1和VCAM-1的血管附近8-9，而更原始的细胞则多分布于距GFP阳性成骨细胞15–20微米范围内（Col2.3-GFP转基因小鼠品系，其中成骨细胞特异性的胶原1α启动子驱动GFP表达），其子代细胞则位于更远的位置10。类似结果也在解剖并骨折的股骨11以及变薄处理的胫骨12中观察到。颅骨骨髓的成像仍是实现对HSPCs在其天然微环境中直接可视化最微创的方法。

在任何活体样本成像过程中，都必须尽可能保持样本静止，以避免因样本移动而产生不必要的伪影。小鼠呼吸会引起头部的振荡性运动，在对颅盖骨骨髓进行成像时需要消除这种干扰。传统的立体定位固定装置（常用于脑部成像和电生理学研究）并不适用于颅盖骨成像，因为它们会遮挡额骨区域。基于一种在活体成像和电生理学研究中用于减轻小鼠应激反应的动物固定装置13，我们开发了一种由两个部件组成的固定装置：一个小型部件固定于小鼠头部，形成一个成像窗口，并连接至一个带有重型底板的较大支撑臂，该底板可牢固地固定在显微镜载物台上，确保稳定固定。将头部组件固定于小鼠颅骨上，可在允许自由呼吸的同时有效固定头部，充分消除由呼吸引起的运动。头部组件与主体支架之间采用“锁-钥”式连接机制，可最小化成像窗口尺寸并提高定位精度，从而简化手术操作；同时，底板与显微镜载物台的匹配设计也有助于实现准确对位。为了精确监测运动性细胞，设计了多点时间序列成像方案，以每5分钟一个时间点的间隔对细胞进行长时间追踪。在此方案中，将DiD标记的造血干细胞（HSCs）注射入col2.3GFP成骨细胞报告小鼠10,14，约20小时后进行成像。本文详细描述了所设计的动物固定装置以及在数小时内对相同区域进行快速多点时间序列成像所需的成像参数设置。

方案

所有涉及动物使用的操作均根据当地法律法规进行。我们的工作已获得英国政府内政部以及帝国理工学院伦理审查委员会的批准。允许的操作在项目许可证文件中有详细说明，并遵循始终确保动物福利的指导原则。务必遵守工作所在国家关于动物实验的法律法规。

1. HSPC 的标记与注射：

  1. 按照 Lo Celso 的方法收获细胞14-15。
  2. 将细胞重悬于 PBS 中，调整浓度至 106 个细胞/ml。注意：使用血细胞计数板或细胞分选仪提供的数据进行细胞计数；需标记并注射的细胞数量因细胞类型而异（例如，标记 10,000 - 20,000 个 HSCs，或 100,000 - 300,000 个 HPCs）；若细胞数量少于 105 个，则重悬于 100 µl PBS 中；必须使用不含血清的 PBS 重悬细胞，因为血清会抑制染色效果。
  3. 向细胞悬液中加入 DiD，使其终浓度为 5 µM，并立即涡旋混匀，以防止染料沉淀，确保细胞有效标记。
  4. 在 37 °C 下孵育 10 分钟，随后以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适合静脉注射的体积中（约 100 - 150 µl）。
  5. 将细胞重悬于 200 µl PBS 中，并吸入胰岛素注射器内。注意：推荐使用胰岛素注射器而非常规注射器，因其针头无死腔，可确保将全部细胞悬液注入小鼠体内。
  6. 通过尾静脉注射将细胞注入经致死剂量照射的小鼠体内。注意：照射对骨髓微环境（包括造血和基质成分）具有已知且显著的影响，且该影响随时间发展。因此，必须严格控制照射、细胞注射（最佳植入时间为照射后 4 至 24 小时）和成像的时间间隔。本实验中，照射在注射前 6 小时进行，成像在注射后 20 小时进行。
    1. 将小鼠置于 37 °C 的温育舱中，直至尾静脉明显扩张。
    2. 将小鼠转移至固定器中，小心地将针头插入尾静脉。
    3. 将细胞注入静脉，注射时不应遇到明显阻力。
    4. 让小鼠过夜饲养，以允许细胞迁移至骨髓腔隙。

2. 准备用于成像的小鼠

  1. 使用前将一对精细镊子、一对精细剪刀以及一个头件进行高压灭菌，并存放于无菌环境中。
  2. 尽可能新鲜配制麻醉剂（0.38 ml 氯胺酮 + 0.25 ml 美托咪啶 + 4.47 ml 水）。注意：其他经批准的麻醉剂，包括异氟烷及其他注射用麻醉剂，同样有效。所述混合麻醉剂应按每10 g体重0.1 ml的剂量腹腔注射，每45分钟至1小时追加30–50 µl。
  3. 如需使用双光子激光器，请先开启激光器，然后启动显微镜及软件，并在提示时校准载物台。开启激光器并使其预热稳定，同时准备用于成像的小鼠。
  4. 通过腹腔注射使用已配制的麻醉混合液（步骤2.2）对小鼠实施麻醉。通过足底反射监测深度麻醉的起效情况，并在整个实验过程中定期检查。注意：整个操作过程中必须密切监测小鼠，若发现麻醉深度变浅（通常在45–60分钟后），应追加麻醉剂量（详见步骤2.2）。不同年龄和性别的小鼠之间可能存在个体差异。重要的是应与本地兽医官员讨论麻醉方案，以确保采取充分措施保障小鼠福利。
  5. 用蘸有70%乙醇的纸巾擦拭小鼠头皮顶部，注意避免乙醇进入小鼠眼睛。
  6. 使用无菌镊子和剪刀，小心移除头皮中央部分，暴露待成像的颅骨区域：用镊子提起耳间后部皮肤，做一小切口。在提起皮肤的同时，将剪刀插入皮下，沿预期成像区域外缘轻轻剪开。
  7. 用蘸有无菌PBS的无菌棉签擦拭暴露的颅骨，以保持其湿润。
  8. 将金属头件固定于小鼠颅骨上，准备进行成像。
    1. 在称量舟中混合适量牙科水泥，直至形成糊状，迅速涂抹于头件底部将与颅骨接触的表面。
    2. 在水泥凝固前，将头件放置于小鼠颅骨上，注意避免牙科水泥沾染成像区域，然后等待其固化。
    3. 涂抹少量Intrasite保湿凝胶以保持颅骨湿润。
  9. 将头件装入固定夹持器中，并用螺丝固定，确保夹持器凹槽与头件卡口完全吻合。
  10. 在转移至显微镜前，用无菌棉签去除颅骨上的凝胶，并用无菌PBS清洁。
  11. 将夹持器插入显微镜载物台，将加热垫置于小鼠身下，插入直肠温度探头，并用胶带将所有部件牢固固定在载物台上。
  12. 在小鼠眼部涂抹少量眼用软膏，防止其在麻醉期间眼睛干燥。注意：麻醉期间的小鼠在成像过程中任何时候均不得无人看管。

3. 体内成像：高分辨率图像序列与延时采集

  1. 通过目镜聚焦观察颅骨。
    1. 用纯化且无菌的水填充成像窗口，并使用水浸物镜，将其缓慢下降至接触水滴。
    2. 使用显微镜目镜聚焦于颅骨顶部，以外部光源灯作为照明光源。
    3. 将成像区域置于颅顶中线缝合处，并向头部后方移动，以找到冠状缝合作为起始位置。
  2. 设置显微镜，以有效激发并检测激发和发射光谱表中指定的相关荧光染料。注：此处使用的是配备传统振镜扫描头并运行LAS-AF软件平台的Leica SP5直立共聚焦显微镜，但该操作流程可轻松应用于其他显微镜/软件平台。此处使用的物镜为Leica HCX IRAPO L 25x W/0.95 N.A.，但其他厂商也提供具有合适放大倍数和高数值孔径（N.A.）的等效物镜。
    1. 将软件设置为同时采集XY图像和三维Z轴层扫模式，成像速度设为400 Hz，分辨率为512 × 512像素。注意：此处的装置与硬件配置产生的视场为620 µm，其他平台可能有所不同。
    2. 将软件设置为能够同时采集多个通道/轨迹，并确保采集方法设置为尽可能在各层间切换设置，或至少在各帧间切换。建立三个独立的采集设置，在每层采集结束时关闭激光照明。注意：本实验需要三个通道，以减少通道间的串扰。
    3. 设置双光子SHG骨信号的第一序列扫描参数（激发波长840 nm；发射波长400–440 nm）；打开多光子激光器的快门，确保多光子增益和偏移设置正确，激光功率为12.5–25%，并开启激光器。  选择合适的PMT作为唯一检测器，并将颜色更改为白色。  注意：若有条件，应使用配备适当滤光片的NDD检测器进行骨组织检测，以获得更明亮、更深邃的信号。
    4. 在第二组扫描设置中，使用两个合适的PMT，针对GFP通道所用的相同步骤，重复进行通道设置，以同时检测自发荧光（543 nm激发；560–600 nm发射）和DiD信号（633 nm激发；650–720 nm发射）。  将自发荧光的通道颜色更改为绿色，DiD 的通道颜色更改为红色。  注意：使用绿色作为自发荧光通道，可在两个通道叠加时更易于检测DiD阳性细胞——由于自发荧光细胞同时存在于两个通道中，呈现黄色或橙色，而DiD细胞仅存在于DiD通道中，因此仅显示为红色。自发荧光通道仅用于此比较，不参与任何最终分析；但若用户需要，可为避免与GFP通道混淆，将该通道显示颜色更改为其他颜色。
    5. 最后，设置第三个也是最后一个扫描通道用于GFP（488 nm激发；500 - 530 nm发射）；根据需要确保快门已打开，将488 nm激光线的激光功率设置为约15%或所用激光器的适当水平，选择一个合适的PMT作为唯一激活的检测器，并将其伪彩色更改为绿色。
    6. 激活“实时”成像模式，开始对所选通道进行预览扫描，并调节探测器的增益（Gain）和偏移（Offset）以获得最佳曝光效果。在序列窗口中对每次扫描重复此操作。
    7. 保存这些多通道扫描的设置，以便轻松重复使用。注意：此操作允许用户在后续会话中重新加载设置。
  3. 启动多位置采集功能（在演示软件中称为“Mark and Find”），并重置坐标点。
  4. 从矢状缝与冠状缝的交点开始扫描骨成像区域，使用自发荧光（伪彩为绿色）和DiD染料（伪彩为红色）以复合图像模式扫描骨髓区域的深度。注意：自发荧光细胞在两个通道中均可见，在复合图像中呈现橙色/黄色；而DiD标记的细胞在复合图像中仅呈现红色。
  5. 当检测到细胞时，在“标记与查找”工具中点击该窗口左侧的“添加新位置”图标，将此标记为一个新的坐标位置（x、y 和 z）。
  6. 当完成当前视野的观察后，将载物台向左、右、下或上移动一个视野的距离。重复此过程，逐个视野依次检查，逐步覆盖中央缝线左侧整个成像窗口区域，并向小鼠鼻部方向移动。一旦看到中央缝线分叉处，移至缝线右侧，并以相反方向重复上述操作，扫描左侧区域（即，朝向冠状缝）。使用“标记与查找”工具标记任何新感兴趣细胞的坐标。
  7. 成像窗口扫描完成后，使用“标记与查找”工具检查各点位（选择目标点位并逐一查看）。针对每个位置的细胞，设置Z轴堆栈的顶部和底部范围（许多软件平台支持为每个位置独立设置Z轴堆栈，从而减少对空白区域的采集）。对每个点位，上下调节焦距，设定用于三维Z轴堆栈采集的Z轴上下限位置，并在“标记与查找”中更新对应点位。将Z轴堆栈间隔设为5 µm，对每个连续扫描通道的平均采集质量设置为适当的模式：线平均或帧平均。注意：增加平均扫描次数会延长采集时间。
  8. 对每个感兴趣区域，通过启动完整的扫描程序（通常称为“Start”而非“Capture”）获取高质量的参考图像序列。注意：该扫描可作为未来高速成像的参考。
  9. 完成高质量扫描后，启动时间序列设置以进行图像采集。
  10. 在延时设置中，将时间间隔设为 5 min，总运行时间设为所需时长（例如，5 小时）。将这些参数应用于整体扫描。注意：为了缩短扫描时间以实现 5 分钟的时间间隔，可能需要减少用于平均的扫描次数，将分辨率限制为 512 × 512 像素，将扫描模式改为双向扫描（需进行相应的相位校正以对齐两个扫描方向），和/或提高扫描速度至 600 Hz 或更高（超过 600 Hz 会导致所演示软件平台的成像区域被放大）。还需注意，尽管最初采用顺序成像模式获取高质量的图像序列，但在时间序列成像过程中为提高速度而采用同时采集模式——这可能导致通道间出现轻微串扰，因此在初始阶段准确分离参考图像序列的采集尤为重要。
  11. 开始成像（如前所述，通过点击演示软件中的“Start”按钮）。注意：根据需要给予额外的小剂量麻醉剂，以维持适当的麻醉水平，注意避免对小鼠过量麻醉；定期补充水以确保物镜不干燥；在整个过程中持续监测生命体征和加热垫温度。
  12. 实验结束后，将物镜从支架上抬起，然后将支架从显微镜载物台上取下，注意避免损伤直肠探头和加热垫的导线。
  13. 从支架上拧下头件，并小心取出小鼠。通过颈椎脱臼处死小鼠，然后将金属头件从颅骨上折下移除。将数据保存至磁盘，并转移至服务器以供后续分析。注意：头件理想清洁方法是将其浸入丙酮中数小时，最后擦去残留的粘固剂。

结果

定制的高精度小鼠固定装置包含颅骨成像窗口，可用于对经流式细胞术分选并标记后注射到致死剂量辐照受体小鼠中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行长时间成像（图1A）。通常在注射1.5万至2万个标记细胞后，次日在颅骨骨髓成像区域内可识别出8至15个细胞。本文展示了如何获取包含HSPCs的骨髓区域的单细胞分辨率三维图像序列，成像厚度约为90–120 µm（图1B），随后对所识别的HSPCs进行四维延时成像（图1C及视频）。

如果牙科水泥未得到充分制备，则可能获得次优结果，例如水可能从未密封的区域渗漏，即使可以从持片器顶部补充水分，但在任何一段时间内若镜头未浸入水中，都会导致出现黑帧。由于小鼠固定装置材料的热膨胀，图像中不可避免地会出现一定程度的漂移，但若水泥粘附不佳，会加剧漂移，导致小鼠逐渐脱离；此外，成像系统的扰动也可能导致延时成像过程中焦点突然跳跃。在多点延时成像过程中，当重新访问先前成像位置时，载物台移动不准确也可能引起漂移。延时成像序列中的漂移和跳跃伪影可通过使用图像配准算法进行校正。

表1. 激发和发射参数设置。

荧光通道激发波长发射波长
GFP488 nm500 - 530 nm
自发荧光543 nm560 - 610 nm
DiD633 nm640 - 700 nm
SHG840 nm (MP)400 - 450 nm

HSPC transplantation process; diagram, 3D imaging of labeled cells in bone marrow; microscopy analysis.
图1. 在体 小鼠颅骨中HSPC的4D成像。（A） 实验流程概述。 （B - C） 获得的结果示例。 （B） 来自3D图像堆栈的2D切片（总深度为 114 μm)，包含骨胶原信号（白色）、DiD标记细胞（红色）、自发荧光细胞（黄色）和成骨细胞（绿色）。比例尺： 100 μm. (C) 来自4D延时电影的2D切片，显示DiD标记的造血干细胞（红色）在成骨细胞（绿色）附近迁移。虚线突出显示细胞的位移。比例尺： 50 μm （B） 和 100 μm (C)注意：从延时采集获得的视频 (C) 在视频文章中展示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

取得了什么成果？

该方案采用延时多维成像技术来监测经FACS纯化的细胞的迁移过程， 离体 小鼠颅骨骨髓中标记并移植的造血干细胞。已成功实现单个移植细胞的识别，并以高精度对其进行了长时间（小时级）的持续监测。通过减少呼吸引起的运动伪影，实现了对细胞在长时间过程中的重复成像。

未来的研究方向是什么？

该技术的进一步发展可推进至恢复实验，以实现一周或更长时间内多日连续成像，并可使用气体麻醉剂（如异氟烷）来缩短和简化小鼠的恢复过程（注意：恢复实验需要严格的无菌手术条件，并给予适当的镇痛剂）。开发更丰富的彩色调色板 体内 染料以及对造血细胞进行高效的遗传标记也将促进多重标记实验，有助于更深入地了解骨髓内的细胞间相互作用，并为未来开展更复杂的实验提供可能。此外，对多个骨髓结构及基质成分进行同步标记，将更全面地揭示造血干细胞和祖细胞（HSPC）微环境中所发生的事件。通过在图像采集前进一步稳定显微镜系统并尽量减少样品中的温度梯度，以及在采集后应用图像配准算法，可提高延时成像视频的图像稳定性。

局限性：

所述技术存在一些局限性。小鼠在注射麻醉剂后的存活情况难以预测，且由于个体对麻醉剂的反应不同，很容易出现并发症。通常情况下，成像时间越长，小鼠从麻醉中恢复的难度就越大，因此必须仔细规划是否需要让小鼠恢复，理想情况下应尽量缩短延时成像的持续时间。使用注射类麻醉剂限制了每次成像会话的持续时长。尽管可以通过追加较小剂量的麻醉剂来延长麻醉时间，但准确实施这一操作较为困难，而过量麻醉是导致实验提前终止的最常见原因之一。 体内 成像。气体麻醉的毒性较低，可允许更长的初始成像时间，但小鼠在麻醉后恢复较快 >2小时长时间给予异氟烷通常难以成功。该技术的另一局限性在于，由于需要快速获取图像，多点延时成像所获得的图像分辨率受限。这一问题，加上焦平面漂移或视野跳动（如上所述），可能导致细胞追踪困难。

与替代方法的比较：

HSPC通常使用亲脂性染料DiD进行标记，但DiR和DiI染料是等效的替代选择，其他细胞染料只要亮度足够也可使用，相关综述见[16]。尽管 离体 用DiD标记细胞已被证明不会影响造血干细胞（HSCs）的长期功能，但其局限性在于DiD（或其他化学染料）会在细胞分裂过程中被稀释。由于HSCs在移植后的最初几天内会增殖，这些细胞的信噪比迅速下降。通过基因操作使细胞内源性表达荧光蛋白是一种可行的替代方法，前提是荧光蛋白的表达水平足够高，能够产生可穿透颅骨被检测到的信号。目前有多种可用于骨髓腔内造血干细胞和祖细胞（HSPCs）成像的技术，每种技术均有其优势与局限性。植入基于光纤的成像装置可实现对长骨中骨髓重建过程的成像[8]，而通过手术暴露胫骨并使用外科钻头磨薄骨釉质后进行共聚焦成像[12] 生成了长骨外周区域定居的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的详细图像。然而，这些方法的侵入性远高于本文所述方法，因此无法在同一只小鼠中对同一骨髓区域进行重复成像。此外，由于这些技术不可避免地会对周围组织造成广泛损伤，可能引发组织反应，从而影响所观察细胞的状态。此前已有研究通过在切除并骨折的股骨上覆盖盖玻片，对HSPCs进行短时间成像[11]然而，这种对组织的严苛处理方式对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的影响尚不明确，且该技术仅被用于获取单个时间点的观察结果。已将固定的骨骼切成连续切片，染色后对获得的图像重建为三维模型，从而提供出色的三维分辨率，尤其是在使用血管铸型时。[17]，最近，激光扫描细胞术（LaSC）已被用于获取关于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的定量数据 原位，通过免疫染色标记[18] 但无法提供有关细胞行为的时间信息。本新方法所描述的技术结合了良好的三维分辨率、足以实现四维细胞监测的时间采样能力，并且具有相对较低的侵入性，因此为长期监测造血干/祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间的相互作用提供了理想方案。

致谢

成像在伦敦帝国理工学院 FILM 设施内的正置 Leica SP5 共聚焦显微镜上进行，该设施由 Martin Spitaler 博士管理。

样本支架和头件由伦敦帝国理工学院化学工程系合作制造，并得到Samuel Jones和Simon Schultz博士的指导。

Nicola Ruivo、Francisco Diaz 以及帝国理工学院的 CBS 工作人员在小鼠饲养方面提供了重要的帮助和建议。 Mark Scott 由 HFSP 和 FILM 资助，Olufolake Akinduro 由 CRUK 资助，Cristina Lo Celso 由 CRUK、KKLF、BBSRC 和 HFSP 资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮（Narketan 100 mg/ml）Vetoquinol407575 0107 C可使用其他麻醉剂替代此药物。
美托咪啶（Domitor 1 mg/ml）Elanco134800-2可使用其他镇痛药替代此药物。
Vibrant DiD 细胞标记溶液Roche Products Ltd.V22887可根据需要选用其他颜色。
Lacrilube 眼科软膏Allergann/a需由当地兽医处方获取
Kemdent "Diamond Carve" 玻璃离子水门汀经 Kemdent 由 Associated Dental Products Ltd. 提供SUN527我们使用 A3 色号，但也可使用其他任何色号的水门汀。
PBS多种等效产品
胰岛素注射器Terumo Medical CorporationSS10M31091 ml，31 G
小鼠固定器Harvard Apparatus340031锥形（小型）
高压灭菌的镊子和剪刀Agar ScientificAGT577
AGT5034		虹膜剪 - 90 mm；Dumont HP 镊子（尖端 0.06 mm）
称量皿和水门汀搅拌棒VWR611-1996/231-03705 ml 称量皿（黑色）/ 木质压舌板
配备电动载物台和双光子激光器的 Leica SP5 直立共聚焦显微镜Leica Microsystems请询价
25倍水浸物镜（数值孔径 N.A. = 0.95）Leica Microsystems11506323HCX IRAPO L 镜头
定制小鼠固定装置Imperial College 工程车间详见图1
带直肠温度探头的加热垫BASi InstrumentationFHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502加热垫/ 控制箱/ 温度探头

参考文献

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