显微解剖已广泛用于组织内DNA、RNA和蛋白质的检测。激光捕获显微切割（LCM）是最常用的方法，但一种新的研磨技术——中解剖（mesodissection）最近也已出现。我们展示了从中解剖的结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis肉芽肿福尔马林固定石蜡包埋组织切片中提取RNA的方法。
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摘要
摘要
显微解剖技术已用于组织在DNA、RNA和蛋白质水平的检测超过十年。目前最常用的显微解剖技术是激光捕获显微切割（LCM）。该技术利用激光局部熔化覆盖在脱水组织切片上的热塑性膜1，随后将组织切片复合物从膜上提起并分离。尽管该技术可用于成功的组织分析，但其过程耗时且成本较高。此外，使用该技术完成操作需要依赖激光设备，从而限制了其广泛应用。一种新型、更经济且实用的显微解剖方法——中尺度解剖（mesodissection），可能是克服LCM局限性的可行方案。该技术采用MESO-1/MeSectr系统，通过对载玻片上的组织样本进行铣削，以获取目标组织，同时通过液体的分配与抽吸，将目标组织收集至可消耗的铣头中。在解剖过程开始前，操作者需将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片与苏木精-伊红染色（H&E）的参考切片对齐。随后，操作者标注所需的解剖区域，并进行相应区域的解剖。系统会自动生成解剖过程的存档图像。中尺度解剖的主要优势在于解剖过程耗时短，在本实验中，从准备到样本获取平均仅需十分钟。此外，该系统成本显著更低，且更易于操作。其轻微的缺点是精确度不及激光捕获显微切割。在本文中，我们演示了如何利用中尺度解剖技术从由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis (Mtb)）引起的FFPE肉芽肿切片中提取RNA。
引言
传统上，样本是通过针和手术刀从完整组织或切片上进行手工显微解剖获得的。这种方法要求目标组织切片与周围组织切片之间具有清晰的界限2。随着分子谱型分析技术的不断进步，人们对在细胞水平上评估组织的需求日益增加。由于手工显微解剖存在局限性，因此发展了包括激光捕获显微切割（LCM）在内的技术，以实现更高精度的分离。该技术使研究人员能够从多种细胞和切片类型中分离出特定的细胞群体，随后可用于基因表达谱分析等下游检测。尽管LCM在下游检测中非常有效，但它也存在一些局限性。首先，LCM是一种成本高昂且耗时较长的过程。此外，由于RNA本身的不稳定性，通常很难从LCM样本中获得高质量的RNA2。鉴于LCM存在的这些缺点，仍需进一步发展新的显微解剖技术，以更经济、更高效的方式使更多研究人员能够便捷地开展相关研究。
目前可用的显微解剖技术中，一种此类进步被称为中等解剖（mesodissection）。该技术利用一台仪器对标注出的目标组织切片区域进行研磨，并将其吸入一次性研磨钻头中3。随后，可将该样本吸入收集管中，用于后续应用。该系统的优点在于成本显著降低，且对时间的敏感性较小。根据我们的经验，该系统可在十分钟内完成一个肺肉芽肿组织切片的解剖。相比之下，传统的激光捕获显微切割（LCM）可能需要数小时才能完成相同过程。该系统允许操作者加载一张参考玻片，用作比对以及标注的工具。此外，系统会生成一份报告，详细列出已解剖的玻片区域。中等解剖技术主要有两个缺点：尽管在提取多个细胞方面效果良好，但分离单个细胞仍具挑战性；此外，所生成图像的精度不如使用其他成像显微镜时清晰。
结核病（TB）是全球范围内导致人类死亡的主要传染病之一，由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起。在大多数暴露于Mtb气溶胶的个体中，感染处于潜伏状态并被限制。但每年至少有1000万人发展为活动性结核病4。在潜伏感染期间，Mtb被限制在肺部称为肉芽肿的病理性病灶内。因此有观点认为，Mtb感染的结局是在肉芽肿水平上决定的5。
本文展示了如何利用中等解剖技术对由Mtb引起的肉芽肿进行显微解剖。所用切片来自感染的恒河猴的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织。在本演示中，我们将完整地解剖整个肉芽肿。我们还证明，可以从获取的组织中提取RNA。该技术可应用于来自其他多种样本的组织，并可用于多种下游检测。
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方案
1. 使用 2iD 成像软件校准显微解剖仪器
在本文的其余部分，2iD成像软件将简称为软件或程序。此步骤对于正确追踪图像以及对齐多个载玻片帧至关重要。
- 打开仪器和计算机。
- 启动软件并选择“校准仪器”。
- 使用操纵杆校准载物台移动范围。将载物台移至左上位置，在程序中第一步下方点击“设置”按钮。
- 将载物台移至右下位置，在程序中第二步下方点击“设置”按钮。
- 首先按下“Z按钮”升起头部组件，进行吸液校准。持续按下操纵杆上的“吸液脉冲”按钮和“解剖”按钮，直到活塞控制杆到达顶部位置，然后在程序第三步下方点击“设置”按钮。
- 按下“吸液复位”按钮。当活塞停止在底部位置后，在第四步中点击“设置”按钮。
- 点击“标尺”选项卡。
- 将校准尺放置在空白侧。
- 如有需要，调节显微镜焦距。
- 使用鼠标在两个标尺线之间画一条线。
- 在标记为第二步的输入框中输入距离，然后点击“计算”按钮。
- 点击“十字线”选项卡。将电机速度调至1。
- 将xScisor插入头部组件中。按下“z轴”按钮，将头部组件降至z轴就位位置。注：头部组件是解剖仪器顶部的大型结构。在本文其余部分中，xScisor将被称为一次性使用的微型钻头（consumable mill bit）。
- 按下操纵杆上的“解剖启动”按钮。注：该按钮位于操纵杆顶部。
- 通过视觉确定旋转中心。为此，请使用程序中第一步定义的参数，将十字线中心移至旋转中心上。使用“x轴”和“y轴”栏中的上下箭头调节像素，使十字线对齐。点击“完成”选项卡。
- 点击“回原点”图标。注：该图标为位于右上角的房屋图像。
2. 创建参考图像
- 将H&E切片放置于载物台上。在切片上方放置不透明盖板。通过移动操纵杆，将仪器移动至H&E切片的指定区域。保存生成的图像。注意：可使用“capture reference”选项卡或“dissect”选项卡完成此步骤。
3. 对组织进行切片对齐
- 在主屏幕上点击“解剖组织”选项。
- 在“设置”标签页中填写“操作者”、“解剖样本编号”、“参考图像编号”、“xScisor条形码编号”、“解剖液批号”、“xScisor尺寸”和“描述”。
- 点击“查找组织”标签页。
- 导入先前保存的参考图像。
- 将一张未染色的5微米厚FFPE切片放置在载物台上。移动载物台至与参考图像中相同的位置。点击“插入图像”标签页。
- 点击“对齐”标签页。使用鼠标和相关箭头将参考图像与未染色图像进行对齐。
4. 标注幻灯片
- 点击“annotate”标签。
- 使用鼠标在载玻片上需要进行显微切割的区域周围画出一个圆圈。
5. 安装耗材铣刀头
- 通过多次上下平稳抽拉活塞，用所需的缓冲液（此处为PKD缓冲液）填充一次性研磨头。确保排除气泡。
- 按下“Z轴按钮”升高Z轴。
- 将一次性研磨头装入仪器。操作时，将一次性研磨头滑入仪器顶部，使仪器上的白线与一次性研磨头上的黑线对齐。按下“吸液复位”按钮，使活塞下降至正确位置。注意：一次性研磨头应能轻松滑入。若不能，请确保卡槽已正确对齐。
- 再次按下“Z轴”按钮，降低Z轴。
6. 解剖组织（图4）
- 打开“解剖”选项卡。
- 将电机速度和吸液速度调至1。
- 勾选“显示追踪”复选框。注意：此操作可让用户在解剖过程中实时观察已解剖区域。
- 准备开始解剖时，持续按住“启动”按钮和“吸液”按钮，同时将操纵杆沿逆时针方向移动以进行组织解剖。
- 继续沿逆时针方向解剖，直至“吸液满”标签变为红色。
7. 清空并移除耗材铣刀头
- 将一个 0.5 µl 微离心管置于一次性研磨头的尖端下方。
- 快速按压“吸液”控制杆，将样品排入微离心管中。
- 施加更大的力按压，以弹出已使用过的一次性研磨头。
- 通过回拉活塞冲洗组织碎片，再向前推动活塞，将残留样品排入一次性研磨头中。此时组织碎片将被保留在微离心管内。
8. 使用蛋白酶K消化结合热处理裂解样本
- 向回收的组织样本中加入70 µl含有5 µg蛋白酶K的TE缓冲液（pH 8.5）。
- 将样本放入可编程加热振荡仪中。
- 使用可编程加热振荡仪按以下条件完成消化：60 ˚C、1,500 rpm振荡30分钟；82 ˚C、1,500 rpm振荡15分钟；25 ˚C、450 rpm振荡1分钟。样本现可进行后续实验操作。
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结果
上述方案展示了如何使用一种新的显微解剖技术从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中提取RNA。该方案的有效性通过感染结核分枝杆菌（Mtb）并处于不同感染阶段的非人灵长类动物（NHP）肺部肉芽肿的FFPE切片得以验证。图1-3为仪器的图像。图4展示了显微解剖过程以及软件生成的结果图像。表1显示了从处于各个感染阶段的NHP肉芽肿中提取RNA的结果。RNA经扩增和纯化后，通过RT-PCR检测到16s序列（表2-4）。表4证实了显微切割样品中存在Mtb核糖体亚基16s，从而确认了Mtb的存在。
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讨论
间质解剖是一种可用于从由多种病原体引起的病理病变切片中提取RNA的技术。操作者必须追踪图像并正确对齐图像，这是必要的步骤。为实现这一点，必须按照成像软件的说明对仪器进行校准。在解剖过程中，如果切片与目标区域未能对齐，操作者必须重新校准仪器。解剖过程中的另一个关键步骤是以无气泡的方式装载耗材铣削钻头（步骤5.1）。我们发现气泡的存在会降低解剖得率。为解决此问题，我们建议多次推动和排出活塞。用户可按照制造商建议，在练习缓冲液中加入食用色素以观察气泡，从而进行练习。一旦掌握有效方法，用户即可进入常规解剖操作。最后的关键步骤是以逆时针方向进行样本解剖。由于仪器本身以逆时针方向铣削，我们发现以逆时针方向操纵操纵杆做环形运动可提高组织得率，因为前缘切割比后缘更干净6。另一种提高组织得率的方法是降低解剖过程的速度。我们发现，将吸液速率和电机速度设为最低，同时将载物台速度设为“低”，可获得最高的组织得率。该显微解剖方法存在两个主要局限性。第一个局限性在于，由于解剖过程中需要以逆时针方向操纵操纵杆画圈，点状解剖变得非常困难。第二个局限性是仪器上的摄像头所生成的图像缺乏高级显微镜所生成图像的细胞细节。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢以下美国国立卫生研究院（NIH）资助项目/子项目对本研究的支持：R01HL106790、R01HL106790-S1、R01HL106786、R01AI089323、R21AI091457、R21RR026006、P20RR020159、C06RR017563、8T32OD011124-08 和 P51OD011104。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | 中部分离器 | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | 提供其他尺寸 | |
| THOR | AvanSci Bio | 可编程加热振荡仪 | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE 提取试剂盒 | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE 系统 | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
