重组纤维素酶Cel5A从表达里氏木霉在烟草

Summary

烟草植物被用于生产真菌纤维素酶，TrCel5A，通过一个瞬时表达系统。的表达可以用荧光融合蛋白进行监测，并且该蛋白质的活性进行了表征后表达。

Abstract

纤维素降解酶，纤维素酶，是研究和产业利益的目标。这些酶在难以培养微生物，如菌丝建设真菌和厌氧菌的优势，加快了在这一领域的使用重组技术。植物表达的方法是理想的系统，用于大规模生产的酶和其它工业上有用的蛋白质。本文中，对于真菌内切葡聚糖酶， 里氏木霉 Cel5A，在烟草中的瞬时表达方法被证实。成功的蛋白表达被示出，使用的mCherry-酶融合蛋白的荧光监测。此外，一组基本的测试是用来检查瞬时表达T的活动里氏木霉 Cel5A，包括SDS-PAGE，Western印迹，酶谱，以及荧光和基于染料的基质降解试验。这里所描述的系统可以被用来产生活性细胞ulase在很短的时间周期，从而通过组成型或诱导型表达系统，以评估植物中用于进一步的生产潜力。

Introduction

木质纤维素生物质，其转化为液体燃料的退化已经被设想为一个方法，以减少对化石燃料依赖。在建立经济上可行的生物处理系统中的一个显著障碍是在纤维素和半纤维素¹的酶促降解。植物表达系统显示为酶在工业规模上生产的巨大潜力。农业系统收获植物经济和体积都已经建立起来，因为他们已经数千年之久。纤维素酶在植物中的生产是可取的，由于像易于自动水解^2，以及用于最大限度地通过增加植物细胞壁¹消化率使用较低的酶水平的潜在因素。最后，厂房系统允许重组蛋白的靶向植物细胞的特定区域，并能翻译后修饰酶在有需要时^3。

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烟草 （烟草）是很常用的植物模式生物的外源蛋白表达的研究，由于其快速增长和生物量的积累功能^4。重组蛋白的瞬时表达是一种技术，它允许在短的时间周期⁵蛋白的生产，同时保持柔韧性，以定位和由此所选择的蛋白， 即纤维素酶的翻译后修饰。这使得生产的纤维素酶（S）的基本分析，同时也奠定了在植物中进一步表达策略。使用这样的瞬时表达的策略，从糖基水解酶家族5，Cel5A，从真菌宿主里氏木霉 （ 红褐肉座菌 ）衍生的⁶内切葡聚糖酶的产生（以下简称为TrCel5A）。 TrCel5A是一个42 kDa蛋白被糖化本身，是路政署高度活跃roylzing....

Protocol

1，生长野生型普通烟草植物

1. 成长N.烟草 L。 CV。对土壤佩蒂特哈瓦那SR1植物，放置在合适的花盆装满正常的盆栽土壤发芽烟草种子。 2周之后，苗转移至个别盆。孵育恒22°C（黑暗时期）或25℃（光周期）在温室中的植物和70％的相对空气湿度。在八分之一十六小时的光/暗周期提供照明（ 如飞利浦IP65 400瓦灯泡; 180微摩尔·秒^-1·米^-2，λ= 400〜700 nm）和水，每天。

TrCel5A和TrCel5A-mCherry的蛋白质2。瞬时表达

1. 在无菌条件下，挑Agarobacterium癌农杆菌含有两种pTRAkc-ER-TrCel5A或pTRAkc-ER-TrCel5A-的mCherry并转移到含有10ml酵母提取物锥形瓶中单菌落（GV3101 :: pMP90RK GMR，KMR，RIFR）肉汤（YEB，制备成每制造商的规格）介质和卡那霉素（50毫克/毫升），利福平（50毫克/毫升），和羧苄青霉素（100毫克/毫升）以供选择。孵育36-40小时，在26℃和180转。注意：适当的结构来表达设计是本文的范围，但作为指导，可遵循的结构设计麦克莱恩等^[13]和芒罗和Pellham ¹⁴的方法。
2. 取200μl的各培养物接种到20....

Results

TrCel5A和TrCel5A-的mCherry采用的瞬时表达系统（ 图1A和1B）中成功表达在烟草植物中。检查TrCel5A-的mCherry融合蛋白的表达模式的揭示健康的叶子（ 图1C），这下绿光（ 图1D）显示广泛的蛋白表达。

对烟草植物的叶子有包含被执行的总可溶性蛋白质的提取的瞬时表达TrCel5A蛋白和SDS-PAGE显示了大量的各种蛋白质的人出席（ 图2A，泳道1）。从TrCel5A表达的植物和从NTEPs衍生的总可溶性蛋白样品的总可溶蛋白样品，在55℃下孵育10分钟TrCel5A保持稳定和活性在55℃，而许多其他（天然烟草）的蛋白质是不稳定在此温度下。因此，许多非essenti人蛋白通过该处理沉淀，留下TrCel5A的部分纯化的样品。在这之后的热沉淀步骤，一个强大的蛋白条带，观察到〜40kDa的（ 图2A，泳道1）。这很可能是催化结构域的TrCel5A的（CD），其.......

Discussion

纤维素酶的重组表达是非常关注的一个领域，因为更有效的生物燃料生产系统¹的愿望。植物提供了许多可能性，成功的纤维素酶生产，具有的功能，如经济采伐技术和自动水解方法是非常理想的特性进行大规模的生物燃料生产。另外，使用不同的本地化的用于生产蛋白质允许（如果需要），翻译后修饰^20。改变的植物，以使纤维素酶的组成型表达，同时提供明显的好处，是其可能或可能不会成功一个耗时的方法。技术，如蛋白质表达和诱导型表达机制的封存增加成功的纤维素酶生产厂的可能性，但这些仍需要数月时间来建立。这里，瞬时表达方法被证明，以说明特定的纤维素酶的潜在要通过工厂系统在几天之内的事情产生。

融合与荧光蛋白的mCherry在这里被用来证明的瞬时表达方法的成功。 TrCel5A-的mCherry清楚地分布在大部分已经渗透与含载体的农杆菌叶。定位于内质网使所表达的蛋白质的翻译后修饰。一种表达系统，以使例如糖基化的能力，对于那些被最初来源于真菌生物的纤维素酶，如T.特别重要.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-甲基伞形基&β;-D-纤维二糖苷	SIGMA-ALDRICH	M6018
醋酸	ROTH	3738
乙酰丁香酮（浓缩）	ROTH	6003
抗生素 - 卡那霉素	ROTH	T832
抗生素 - 利福平	ROTH	4163
抗生素 - 羧苄青霉素	ROTH	6344
抗体 - 兔抗 His（6） pAb	ROCKLAND	600-401-382
抗体 - 山羊抗兔 AP， FC pAb	DIANOVA	111-055-008
偶氮羧甲基纤维素	MEGAZYME	S-ACMC
β-环糊精	SIGMA-ALDRICH	C4805
氯化钙二水合	物SIGMA-ALDRICH	C5080
羧甲基纤维素	ROTH	3333.1
纤维素酶来自 木霉 ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
刚果红	SIGMA-ALDRICH	75768
考马斯亮蓝 G 250	ROTH	9598.2
D（+）-葡萄糖	ROTH	8337
乙醇	ROTH	K928
滤纸 - Rotilabo 印迹纸	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES 缓冲液	ROTH	4256
甲醇	ROTH	8388
柠檬酸钠	ROTH	3580
十二烷基硫酸钠	SERVA	20765
氢氧化钠	ROTH	6771
土壤，Einheitserde 经典	PATZER GMBH
光谱仪 - Infinite M200	TECAN
蔗糖	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-羟基苯肼酰肼	SIGMA-ALDRICH	H9882
磷酸盐缓冲盐水	ROTH	1058
紫外光源 - BLAK RAY	UVP
振动切片机 - VT1000S	Leica