利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶 TrCel5A。可通过荧光融合蛋白监测其表达，并在表达后对蛋白活性进行表征。
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方法文章
在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
纤维素降解酶（纤维素酶）是科研与工业领域共同关注的目标。由于这类酶大多存在于难以培养的生物体中，例如形成菌丝的真菌和厌氧细菌，因此推动了重组技术在该领域的应用。植物表达系统是大规模生产酶及其他具有工业价值蛋白质的理想体系。本文展示了在烟草（ Nicotiana tabacum ）中瞬时表达丝状真菌 Trichoderma reesei Cel5A内切葡聚糖酶的方法。通过mCherry-酶融合蛋白的荧光检测，证实了蛋白质的成功表达。此外，还采用一系列基础实验检测瞬时表达的 T. reesei Cel5A酶活性，包括SDS-PAGE、Western印迹、酶谱分析，以及 基于荧光和染料标记底物的降解活性检测。本文所述系统可在短时间内获得具有活性的纤维素酶，从而评估其通过组成型或诱导型表达系统在植物中进一步规模化生产的潜力。
引言
木质纤维素生物质的降解及其转化为液体燃料被视为减少对化石燃料依赖的一种方法。建立经济可行的生物质处理系统面临的一个重要障碍是纤维素和半纤维素的酶解降解1。植物表达系统在工业规模酶的生产方面展现出巨大潜力。用于经济、大规模收获植物的农业系统早已建立，并已有数千年历史。在植物中生产纤维素酶具有诸多优势，例如易于实现自水解2，以及通过提高植物细胞壁的可消化性，最大限度地利用较低水平的酶1。最后，植物系统能够将重组蛋白靶向至植物细胞的特定区域，并在需要时对酶进行翻译后修饰3。
Nicotiana tabacum （烟草）由于其生长迅速和生物量积累快的特点，常被用作植物中异源蛋白表达研究的模式生物4瞬时表达重组蛋白是一种能够在短时间内实现蛋白质生产的实验技术。5，同时保持所选蛋白质的定位灵活性，从而实现翻译后修饰的多样性 即 纤维素酶。这不仅能够实现纤维素酶的生产以用于基础分析，同时也为在植物中进一步开展表达策略奠定了基础。利用这种瞬时表达策略，可从真菌宿主中获得属于糖苷水解酶家族5的内切葡聚糖酶Cel5A。 Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina)6 产生（下文简称 TrCel5A）。TrCel5A 是一种天然糖基化的 42 kDa 蛋白，在水解纤维素链方面具有高活性7.
此处描述的瞬时表达技术基于一种相对常用的系统，即通过浸润植物叶片进行 农杆菌 在合适的表达载体中携带目的基因。以实现对成功转化的快速分析 在植株中 表达，TrCel5A 也可与 mCherry 融合表达为融合蛋白，mCherry 是一种最初来源于 Discosoma sp. 蛋白 DsRed8，C末端融合了六个额外的组氨酸残基（His标签）（TrCel5A-mCherry）。因此，可通过绿色光照射观察mCherry的分布，从而在植株生长过程中监测异源融合蛋白TrCel5A-mCherry的表达。如有需要，可对植物材料进行切片，并在显微镜下用绿色光观察，以确定该蛋白的特异性定位。本研究中，载体构建时包含了信号肽和转运肽序列，以引导异源蛋白向内质网的定向转运与分泌9.
为了分析植物表达的纤维素酶（包括 TrCel5A）的活性，可进行多种纤维素酶活性检测。在提取植物总可溶性蛋白后，可采用热孵育技术对 TrCel5A 进行部分纯化。通过 SDS-PAGE 并结合 Western 印迹法确定蛋白质的分子量。可利用酶谱法分析其对底物的酶活性。 例如 经过羧甲基化处理的纤维素（生成羧甲基纤维素：CMC），以提高其溶解性10纤维素酶和葡萄糖苷酶活性可通过与β-D-纤维二糖苷结合的荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）进行检测（二者合称4-MUC）。另一种评估内切葡聚糖酶活性的方法涉及对羧甲基纤维素（CMC）进行分光光度分析。 与偶氮染料（Remazol Brilliant Blue R）相连11此外，可通过糖分析检测方法（如 p对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）测定12这些技术可用于阐明和定量分析目标表达纤维素酶的活性。
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方案
1. 野生型N. tabacum 植株的培养
- 培养 N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 植株的土壤培养：将烟草种子置于装有常规盆栽土的适当花盆中以促进萌发。2 周后，将幼苗移栽至单独的花盆中。在温室中培养植株，保持恒定环境条件：黑暗期 22 °C，光照期 25 °C，相对空气湿度 70%。光照周期设为 16 小时光照 / 8 小时黑暗 hr 光照/黑暗循环（例如 飞利浦 IP65 400 W 灯；180 μmol·sec⁻¹·m⁻²-1·m-2；λ = 400–700 nm）以及水，每天一次。
2. TrCel5A 和 TrCel5A-mCherry 蛋白的瞬时表达
- 在无菌条件下，挑取单个菌落 Agarobacterium tumefaciens (GV3101::pMP90RK GmR, KmR, RifR) 菌株，分别含有 pTRAkc-ER-TrCel5A 或 pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry，转移至含有 10 ml 液体培养基的三角烧瓶中 酵母提取物肉汤（YEB，按制造商说明配制）培养基，以及用于筛选的卡那霉素（50 mg/ml）、利福平（50 mg/ml）和羧苄青霉素（100 mg/ml）。在26 °C、180 rpm条件下培养36–40小时。注意：蛋白表达用适当载体的设计不在本文范围之内，但可参考Maclean等人的方法作为指导。 等.13 和 Munro 与 Pellham14 可遵循该流程进行载体构建设计。
- 取 200 µl 每种培养物接种20 ml 在含有上述抗生素浓度的YEB培养基中培养，并在与之前相同的条件下孵育。
- 36–40 小时后，通过加入 2 µl 进行预诱导培养 乙酰丁香酮（终浓度 200 µM），100 µl 40% (w/v) 葡萄糖溶液和 200 µl 1 M MES 缓冲液（pH 5.6）中，过夜孵育。
- 准备 100 ml 2×浸润缓冲液（100 g/L蔗糖，3.6 g/L葡萄糖，8.6 g/L Murashige和Skoog基础盐，用氢氧化钾调节pH至5.6）
- 测量 OD600 用1:5的比例稀释培养物，直至其OD值达到600 5-6。计算获得30 ml所需的培养液体积 OD下的浸润培养基600加入15 ml 加入2倍体积的渗透缓冲液，然后加入去离子H2O，加缓冲液至30 ml。
- 从温室中取出植物，使用移液器吸头在第3片叶的远轴面划出小切口rd 至 5th 从顶部叶片开始，以利于渗透。
- 使用移液器吸头在叶片的远轴面划出小切口，以促进渗透。
- 用浸润介质填充注射器，将注射器（不带针头）置于先前制作的切口之一上，用手指在叶片近轴面支撑注射器。小心地将介质压入叶脉间区域的组织中。注意：浸润后，将植株置于温室中培养，条件与上述描述相同。同时，在相同条件下设置相同比例的未处理、非瞬时表达植株（NTEPs）作为对照。
3. 植物叶片中 TrCel5A-mCherry 表达的评估
- 接种含有携带 pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry 质粒的农杆菌（A. tumefaciens）后 4–6 天，将植株从温室中取出，置于暗室中进行荧光分析。
- 为观察表达 TrCel5A-mCherry 的叶片组织中的荧光，使用发射波长为 515 nm 的便携式绿光光源照射植株，并配合红光滤光片（620–750 nm）。注意：可通过振动切片机对叶片进行薄切片，并在明场和荧光显微镜下观察，从而对植物叶片中蛋白的表达进行深入表征。具体操作步骤如下：
- 从已接种的叶片上切取约 5 × 5 mm 的小片组织，将其包埋于溶于 50 mM 磷酸缓冲液（pH 5.7）的 4% 琼脂糖中。
- 使用振动切片机从包埋的叶片中切下 80–90 µm 厚的切片，将切片置于显微镜载玻片上，加入缓冲液或加盖盖玻片，然后在显微镜下以 10X 倍放大倍数结合荧光检测器进行观察，激发光波长和滤光片参数同上所述。
4. 从烟草叶片中提取 TrCel5A
- 从植株上剪取烟草叶片，每份约重 1 g 感染了 A. tumefaciens 加入 pTRAkc-ER-TrCel5A 并置于经液氮预冷的研钵中。向样品中加入适量液氮，用预冷的研杵将叶片研磨成粉末。
- 加入 2 ml 加入含有1 mM苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液（PBS）至研磨后的叶片材料中，混匀直至大部分叶片物质呈悬浮状态。4 °C下以15,000 × g离心20分钟，收集含蛋白的上清液。
- 在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心提取物 20 分钟，小心吸取含有蛋白质的上清液，避免扰动沉淀。弃去沉淀。
- 通过将含蛋白质的上清液在 55 °C 下孵育 10 分钟，对 TrCel5A 进行部分纯化。室温下静置 10 分钟后，在 15,000 x 4 °C下孵育10分钟。对未浸润的植物重复上述部分纯化步骤，以获得对照样品。将这些样品用于后续所有实验。注意：蛋白溶液可在4 °C保存最多1周，或在-20 °C保存最多3个月。
- 对未浸润的植物重复部分纯化过程，以获得对照样品。将这些样品用于后续所有实验。注意：蛋白质溶液可在4 °C下保存最多1周，或在-20 °C下保存最多3个月。
5. TrCel5A-mCherry 的 SDS-PAGE、Western 印迹及 Azo-CMC 酶谱分析
- 根据既定方法购买或制备12%（w/v）SDS-PAGE凝胶15.
- 溶解CMC 在水中配制成1.5%（w/v）的溶液。制备CMC-SDS-PAGE凝胶时，用1 ml替代 1.5% CMC 溶液，每 1 ml 10 ml 水 SDS-PAGE 凝胶混合液，最终配制成含 0.1% (w/v) CMC 和 12% (w/v) SDS-PAGE 的凝胶混合液。按常规方法倒入凝胶。注意：在配制凝胶溶液前，务必通过搅拌并加热至 40 °C 的方式，确保原始溶液中的 CMC 完全溶解（在配制凝胶溶液前需再次重复此步骤）。
- 在 SDS 存在下通过煮沸使样品变性，具体操作参照既定方法12. 作为阳性对照，使用市售纤维素酶混合物，按1:500稀释 T. reesei，例如 T. reesei ATCC 26921。作为阴性对照，使用来自未浸润叶片的类似制备的蛋白质溶液（NTEPs）。
- 按照常规方案进行电泳操作15, 例如 使用200 V电泳约50分钟，当染料前沿迁移至凝胶底部时停止电泳。
- 使用0.1%（w/v）考马斯亮蓝对一块SDS-PAGE凝胶进行染色，并用甲醇/冰乙酸混合液进行脱色。注意：可通过轻微加热染色液和脱色液以实现快速染色和脱色。 即 使用微波炉加热约15秒，使染色液和脱色液依次温热（但不沸腾），脱色10分钟后或溶液冷却后更换脱色液，并更换新的脱色液重复进行。
- 使用既定方案对一个SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹（Western blotting）16,17使用以下抗体：一种针对a的兔多克隆抗体 His标签（一抗）和与碱性磷酸酶偶联的多克隆山羊抗兔抗体Fc区（二抗）。注意：应选择能够通过氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3′-吲哚磷酸对甲苯胺盐（NBT/BCIP）显色的二抗，具体方法如所述18.
- 在室温下，将0.15%（w/v）CMC SDS-PAGE凝胶置于含1.5%（w/v）β-环糊精和20 mM磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 6.5）的溶液中，轻轻振荡孵育15分钟，进行凝胶内蛋白质复性。19.
- 弃去β-环糊精溶液，用H短暂洗涤凝胶2O. 在50 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.8）中室温孵育额外15分钟。将复性后的含0.15%羧甲基纤维素（CMC）的SDS-PAGE凝胶置于30 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.8）中，于50 °C孵育20分钟，进行CMC酶谱分析。
- 使用重折叠的0.15%（w/v）CMC SDS-PAGE凝胶进行CMC酶谱分析，将凝胶置于30 mM醋酸钠缓冲液中孵育 （pH 4.8）下 50 °C 反应 20 分钟。
- 将凝胶染色10分钟 使用0.1%（w/v）刚果红溶液染色10分钟，然后用1 M NaCl脱色30分钟或直至观察到清晰条带。用0.3%（v/v）乙酸洗涤凝胶以获得更清晰的成像效果。
6. TrCel5A 的 4-MUC 活性测定
- 配制10 mM 4-MUC的储备液，溶剂为50% (v/v) 甲醇，避光保存于室温。
- 在进行检测前立即配制4-MUC工作液（2×浓度），其中含1 mM 4-MUC和60 mM醋酸钠，pH 4.8。
- 对以下样品进行检测：分别含有100 μl叶片蛋白（诱导或不诱导表达TrCel5A）、100 μl商业来源的里氏木霉（T. reesei）纤维素酶混合物（1:1,000稀释）以及纯H2O的样品。每个样品设三个重复。
- 将100 μl 4-MUC工作液加入96孔板的不同孔中，然后向每孔加入100 μl相应样品。
- 使用荧光光谱法测定4-MU荧光的0分钟时间点，激发波长为360 nm，发射波长为465 nm。
- 将96孔板在50 °C孵育20分钟，加盖密封膜以防止蒸发。通过冷冻终止反应（或在另一块96孔板中将100 μl 0.15 M甘氨酸缓冲液（pH 10.0）与100 μl样品混合以终止反应） 。
- 使用荧光光谱法测定4-MU荧光的终点值（20分钟），激发波长为360 nm，发射波长为465 nm。用终点（20分钟）荧光值减去0分钟荧光值，得到荧光变化量。
7. TrCel5A 的偶氮-羧甲基纤维素活性测定
- 配制1.5%（w/v）Azo-CMC储备液，于室温保存；另配制沉淀溶液，含18 mM乙酸锌、0.5 M乙酸钠（pH 5）和80%乙醇（v/v），室温保存。
- 在进行检测前立即配制Azo-CMC 2倍工作液，成分为1%（w/v）Azo-CMC（溶于H2O）和60 mM乙酸钠（pH 4.8）。
- 在1.5 ml 离心管中加入50 μl样品和50 μl工作液。
- 检测样品包括：含50 μl叶片蛋白（瞬时表达TrCel5A或未表达）的样品；100 μl来自T. reesei的商品化纤维素酶混合物（1:1,000稀释）；以及纯H2O。所有样品和标准品均设三个重复。
- 50 °C孵育20分钟。加入250 μl沉淀溶液终止反应，每管剧烈涡旋振荡10秒，确保溶液充分混匀。
- 室温孵育10分钟后再次涡旋振荡。以1,000 × g离心10分钟，小心吸取200 μl 上清液转移至96孔板，避免扰动沉淀。
- 在590 nm波长下使用吸光度光谱法进行检测。
8. TrCel5A 的 PAHBAH 测定
- 使用打孔器从滤纸上切下一个圆形（直径约5.5 mm）。加入100 μl 60 mM NaAc，pH 4.8，以及 100 μl 样品，包含叶蛋白（可诱导表达或不表达TrCel5A）或商用 T. reesei 纤维素酶混合物按1:1,000稀释，与滤纸圆片在50 °C、300 rpm振荡条件下孵育20小时。每个含滤纸孵育的样品均需设置一个不含滤纸的平行溶液作为单独的样品对照。
- 配制 330 mM p-羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）溶液A：将PAHBAH溶解于H中2O，加入5 ml 浓盐酸，加至总体积 100 ml 溶液，并在室温下保存。注意：将盐酸加入较少量的PAHBAH浆液中可获得最佳效果， 即 30 ml，于一定温度下搅拌以促进溶解，再定容至 100 ml 与 H2O.
- 配制含有50 mM柠檬酸钠、10 mM氯化钙和500 mM NaOH的PAHBAH溶液B 储存 室温下
- 在进行检测前立即配制1 ml的1.5倍工作液 将PAHBAH试剂加入9 ml 缓冲液，置于冰上保存直至使用（4小时内使用完毕）。
- 在耐热的 0.2 或 0.5 ml 离心管中制备样品 离心管。将5 μl每种与滤纸孵育后的溶液（步骤8.1）与45 μl H2O 和 100 μl PAHBAH 工作溶液。样品对照（未加入滤纸孵育的样品）应使用相同浓度进行操作（5 μl 样品，45 μl H2O，100 μl PAHBAH 工作溶液）。同时检测5种标准品（5 μl），其中葡萄糖浓度范围为0至0.2 g/L，以及纯H2O. 样品和标准品均设三个重复孔进行检测。
- 将样品在100 °C下准确孵育10分钟，随后在室温下准确冷却10分钟。用移液器将溶液转移至96孔板中，在410 nm波长下进行分光光度测定。从样品中减去各自的对照样本（未加滤纸孵育）的数值，以获得最终结果。
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结果
利用瞬时表达系统，TrCel5A 和 TrCel5A-mCherry 在烟草植株中成功表达（图1A 和 图1B）。对 TrCel5A-mCherry 融合蛋白表达模式的观察显示，健康叶片中蛋白表达广泛（图1C），在绿光下可见明显的荧光信号（图1D）。
从表达瞬时TrCel5A蛋白的烟草植株叶片中提取总可溶性蛋白，SDS-PAGE结果显示存在多种蛋白（图2A，第1道）。将表达TrCel5A植株的总可溶性蛋白样品与来自NTEPs的总可溶性蛋白样品分别在55 °C下孵育10分钟。TrCel5A在55 °C时仍保持稳定且具有活性，而许多其他（天然烟草）蛋白在此温度下不稳定。因此，该处理使许多非必需蛋白发生沉淀，从而获得部分纯化的TrCel5A样品。经过这一热沉淀步骤后，在约40 kDa处观察到一条明显的蛋白条带（图2A，第1道）。该条带很可能是TrCel5A的催化结构域（CD），此前已有研...
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讨论
由于人们希望开发出更高效的生物燃料生产系统，纤维素酶的重组表达成为一个备受关注的研究领域1。植物为成功生产纤维素酶提供了多种可能性，其具备经济的收获技术和自水解方法等特性，非常适合大规模生物燃料生产。此外，利用不同的蛋白质定位策略可在需要时实现翻译后修饰20。虽然通过改造植物实现纤维素酶的组成型表达具有明显优势，但该方法耗时较长，且成功率不确定。诸如蛋白质区隔化和诱导型表达等技术可提高在植物中成功生产纤维素酶的可能性，但这些方法仍需数月时间才能建立。本文展示了瞬时表达方法，以说明在数天之内即可利用植物系统生产特定纤维素酶的潜力。
此处使用与荧光蛋白 mCherry 的融合来验证瞬时蛋白表达方法的成功。TrCel5A-mCherry 明显分布于已浸润含载体的绝大多数叶片中 农杆菌. 定位于内质网可实现表达蛋白的翻译后修饰。表达系统能否实现这一能力 例如 糖基化对于这些纤维素酶尤为重要 最初来源于真菌类生物体，例如 T. ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）研究倡议项目“生物能源2021——生物质利用研究”以及“来自生物质的定制燃料”卓越集群资助，后者通过德国联邦和州政府的卓越计划资助，旨在促进德国大学的科学研究。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-甲基伞形基 β-D-纤维二糖苷 | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| 乙酸 | ROTH | 3738 | |
| 乙酰丁香酮（浓缩液） | ROTH | 6003 | |
| 抗生素 - 卡那霉素 | ROTH | T832 | |
| 抗生素 - 利福平 | ROTH | 4163 | |
| 抗生素 - 羧苄西林 | ROTH | 6344 | |
| 抗体 - 兔抗 His(6) 多克隆抗体 | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| 抗体 - 山羊抗兔碱性磷酸酶，FC多克隆抗体 | DIANOVA | 111-055-008 | |
| 偶氮-羧甲基纤维素 | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-环糊精 | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| 二水合氯化钙 | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| 羧甲基纤维素 | ROTH | 3333.1 | |
| 来自的纤维素酶 Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| 刚果红 | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| 考马斯亮蓝 G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-葡萄糖 | ROTH | 8337 | |
| 乙醇 | ROTH | K928 | |
| 滤纸 - Rotilabo 印迹纸 | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES缓冲液 | ROTH | 4256 | |
| 甲醇 | ROTH | 8388 | |
| 柠檬酸钠 | ROTH | 3580 | |
| 十二烷基硫酸钠 | SERVA | 20765 | |
| 氢氧化钠 | ROTH | 6771 | |
| 土壤，Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| 光谱仪 - Infinite M200 | TECAN | ||
| 蔗糖 | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-羟基苯甲酰肼 | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| 磷酸盐缓冲液 | ROTH | 1058 | |
| 紫外光源 - BLAK RAY | UVP | ||
| 振动切片机 - VT1000S | Leica |
参考文献
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
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