在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

摘要

利用瞬时表达系统，以烟草植物生产了一种真菌纤维素酶 TrCel5A。可通过荧光融合蛋白监测其表达，并在表达后对蛋白活性进行表征。

摘要

纤维素降解酶（纤维素酶）是科研与工业领域共同关注的目标。由于这类酶大多存在于难以培养的生物体中，例如形成菌丝的真菌和厌氧细菌，因此推动了重组技术在该领域的应用。植物表达系统是大规模生产酶及其他具有工业价值蛋白质的理想体系。本文展示了在烟草（ Nicotiana tabacum ）中瞬时表达丝状真菌 Trichoderma reesei Cel5A内切葡聚糖酶的方法。通过mCherry-酶融合蛋白的荧光检测，证实了蛋白质的成功表达。此外，还采用一系列基础实验检测瞬时表达的 T. reesei Cel5A酶活性，包括SDS-PAGE、Western印迹、酶谱分析，以及 基于荧光和染料标记底物的降解活性检测。本文所述系统可在短时间内获得具有活性的纤维素酶，从而评估其通过组成型或诱导型表达系统在植物中进一步规模化生产的潜力。

引言

木质纤维素生物质的降解及其转化为液体燃料被视为减少对化石燃料依赖的一种方法。建立经济可行的生物质处理系统面临的一个重要障碍是纤维素和半纤维素的酶解降解¹。植物表达系统在工业规模酶的生产方面展现出巨大潜力。用于经济、大规模收获植物的农业系统早已建立，并已有数千年历史。在植物中生产纤维素酶具有诸多优势，例如易于实现自水解²，以及通过提高植物细胞壁的可消化性，最大限度地利用较低水平的酶¹。最后，植物系统能够将重组蛋白靶向至植物细胞的特定区域，并在需要时对酶进行翻译后修饰³。

Nicotiana tabacum （烟草）由于其生长迅速和生物量积累快的特点，常被用作植物中异源蛋白表达研究的模式生物⁴瞬时表达重组蛋白是一种能够在短时间内实现蛋白质生产的实验技术。⁵，同时保持所选蛋白质的定位灵活性，从而实现翻译后修饰的多样性 即 纤维素酶。这不仅能够实现纤维素酶的生产以用于基础分析，同时也为在植物中进一步开展表达策略奠定了基础。利用这种瞬时表达策略，可从真菌宿主中获得属于糖苷水解酶家族5的内切葡聚糖酶Cel5A。 Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina)⁶ 产生（下文简称 T....

方案

1. 野生型N. tabacum 植株的培养

1. 培养 N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 植株的土壤培养：将烟草种子置于装有常规盆栽土的适当花盆中以促进萌发。2 周后，将幼苗移栽至单独的花盆中。在温室中培养植株，保持恒定环境条件：黑暗期 22 °C，光照期 25 °C，相对空气湿度 70%。光照周期设为 16 小时光照 / 8 小时黑暗 hr 光照/黑暗循环（例如 飞利浦 IP65 400 W 灯；180 μmol·sec⁻¹·m⁻²^-1·m^-2；λ = 400–700 nm）以及水，每天一次。

2. TrCel5A 和 TrCel5A-mCherry 蛋白的瞬时表达

1. 在无菌条件下，挑取单个菌落 Agarobacterium tumefaciens (GV3101::pMP90RK GmR, KmR, RifR) 菌株，分别含有 pTRAkc-ER-TrCel5A 或 pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry，转移至含有 10 ml 液体培养基的三角烧瓶中 酵母提取物肉汤（YEB，按制造商说明配制）培养基，以及用于筛选的卡那霉素（50 mg/ml）、利福平（50 mg/ml）和羧苄青霉素（100 mg/ml）。在....

结果

利用瞬时表达系统，TrCel5A 和 TrCel5A-mCherry 在烟草植株中成功表达（图1A 和 图1B）。对 TrCel5A-mCherry 融合蛋白表达模式的观察显示，健康叶片中蛋白表达广泛（图1C），在绿光下可见明显的荧光信号（图1D）。

从表达瞬时TrCel5A蛋白的烟草植株叶片中提取总可溶性蛋白，SDS-PAGE结果显示存在多种蛋白（图2A，第1道）。将表达TrCel5A植株的总可溶性蛋白样品与来自NTEPs的总可溶性蛋白样品分别在55 °C下孵育10分钟。TrCel5A在55 °C时仍保持稳定且具有活性，而许多其他（天然烟草）蛋白在此温度下不稳定。因此，该处理使许多非必需蛋白发生沉淀，从而获得部分纯化的TrCel5A样品。经过这一热沉淀步骤后，在约40 kDa处观察到一条明显的蛋白条带（图2A，第1道）。该条带很可能是TrCel5A的催化结构域（CD），此前已有研.......

讨论

由于人们希望开发出更高效的生物燃料生产系统，纤维素酶的重组表达成为一个备受关注的研究领域¹。植物为成功生产纤维素酶提供了多种可能性，其具备经济的收获技术和自水解方法等特性，非常适合大规模生物燃料生产。此外，利用不同的蛋白质定位策略可在需要时实现翻译后修饰²⁰。虽然通过改造植物实现纤维素酶的组成型表达具有明显优势，但该方法耗时较长，且成功率不确定。诸如蛋白质区隔化和诱导型表达等技术可提高在植物中成功生产纤维素酶的可能性，但这些方法仍需数月时间才能建立。本文展示了瞬时表达方法，以说明在数天之内即可利用植物系统生产特定纤维素酶的潜力。

此处使用与荧光蛋白 mCherry 的融合来验证瞬时蛋白表达方法的成功。TrCel5A-mCherry 明显分布于已浸润含载体的绝大多数叶片中 农杆菌. 定位于内质网可实现表达蛋白的翻译后修饰。表达系统能否实现这一能力 例如 糖基化对于这些纤维素酶尤为重要 最初来源于真菌类生物体，例如 T. .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-甲基伞形基 β-D-纤维二糖苷	SIGMA-ALDRICH	M6018
乙酸	ROTH	3738
乙酰丁香酮（浓缩液）	ROTH	6003
抗生素 - 卡那霉素	ROTH	T832
抗生素 - 利福平	ROTH	4163
抗生素 - 羧苄西林	ROTH	6344
抗体 - 兔抗 His(6) 多克隆抗体	ROCKLAND	600-401-382
抗体 - 山羊抗兔碱性磷酸酶，FC多克隆抗体	DIANOVA	111-055-008
偶氮-羧甲基纤维素	MEGAZYME	S-ACMC
β-环糊精	SIGMA-ALDRICH	C4805
二水合氯化钙	SIGMA-ALDRICH	C5080
羧甲基纤维素	ROTH	3333.1
来自的纤维素酶 Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
刚果红	SIGMA-ALDRICH	75768
考马斯亮蓝 G 250	ROTH	9598.2
D(+)-葡萄糖	ROTH	8337
乙醇	ROTH	K928
滤纸 - Rotilabo 印迹纸	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES缓冲液	ROTH	4256
甲醇	ROTH	8388
柠檬酸钠	ROTH	3580
十二烷基硫酸钠	SERVA	20765
氢氧化钠	ROTH	6771
土壤，Einheitserde classic	PATZER GMBH
光谱仪 - Infinite M200	TECAN
蔗糖	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-羟基苯甲酰肼	SIGMA-ALDRICH	H9882
磷酸盐缓冲液	ROTH	1058
紫外光源 - BLAK RAY	UVP
振动切片机 - VT1000S	Leica