稳定肝细胞表型采用优化合成表面

Summary

本文将重点发展聚合物涂层表面进行长期，干细胞的培养稳定来源的人肝细胞。

Abstract

目前，细胞生物学的主要限制之一是维持分化的细胞表型。生物基质通常用于培养和维持原代和多能干细胞来源的肝细胞。虽然生物基质很有用，但它们允许肝细胞的短期培养，限制了它们的广泛应用。我们试图使用合成聚合物涂层来克服这些限制。聚合物是最广泛的生物材料类别之一，具有广泛的机械、物理和化学特性，可以根据用途进行微调。重要的是，此类材料可以扩展到质量保证标准，并显示批次间的一致性。如果要扩增细胞以进行药物检测行业的高通量筛选或基于细胞的治疗，这一点至关重要。聚氨酯 （PU） 是一类在细胞培养中显示出前景的材料。介绍并讨论了我们在优化聚氨酯涂层表面以长期培养显示稳定表型的人肝细胞方面的最新进展。

Introduction

生物材料已经被广泛用于多能干细胞¹的维持和分化。同时使这些生物基质通常包含未定义了大量元器件。基质胶是一种常用的基质干细胞的培养和分化。不幸的是，它的可变成分影响细胞功能和表型。虽然各种各样的替代方案中，更明确的生物基质已用于^2-7，其动物来源或可扩展性差，使它们不适合的候选用于工业制造。因此合成的替代品，具有固定的成分，性能可靠的鉴定，是干细胞研究的主要目标。

在克服不确定的细胞培养基质的限制的尝试，化学和生物学的交叉学科的合作已经确定了合成材料，以支持细胞表型的能力。合成器客位基板具有可扩展性，成本效益和可制造成复杂的三维结构，模仿体内环境。由于这些特性的合成底物已被广泛使用，以支持和驱动许多细胞类型^8-10的分化。

先进的高通量检测提供了便利合成材料的快速筛选，从大型图书馆，并提供新的材料，具有灵活的特性，在生物医药研究和开发^11-13广泛的应用。利用高通量，聚合物微阵列筛选技术，我们迅速确定了一个简单的聚氨酯（PU134），适用于维护人类干细胞衍生的肝细胞。该聚合物被认为是优于动物源性底物对于肝细胞的分化和功能^14-16。我们随后优化的涂覆条件，地形和灭菌过程来访问效果在稳定肝细胞的功能和寿命聚合物的性能。这有针对了解肝细胞生物学细胞建模和再生医学应用基础显著影响。

此处所描述的技术代表了如何由合成聚合物的表面可以进行优化，以保持细胞的表型的实例。我们认为，这种技术提供了高效的无血清肝细胞分化方案的组合有可能提供一种可伸缩的生产肝细胞在体外模型和再生医学中使用。

Protocol

1，合成PHNGAD（聚[1,6-hexanodiol /新戊二醇/二（乙二醇）-alt - 己二酸]二醇）的

方案1：PHNAGD合成 PHNAGD的合成的示意图。 PHNAGD制备的1,6-Hexanodiol的反应中，二甘醇，neoppentyl乙二醇和己二酸。 PHNAGD，聚[1,6-hexanodiol /新戊二醇/二（乙二醇）-alt - 己二酸]二醇。

1. 适用于热处理的单体1,6 - 己二醇，二（乙二醇）和新戊二醇，在40℃下进行48小时的真空炉中，以除去任何残余的水。允许冷至室温下真空。
2. 加入22毫摩尔的各单体和己二酸（55毫摩尔）到两颈圆底烧瓶配有搅拌棒并连接到一个Dean-Stark装置。
3. 放置在真空下整机组装，轻轻加热GLAssware在40℃下6小时，以避免在加入化学品向烧瓶中的任何湿气的吸收。
4. 添加经由注射器，一滴一滴，0.0055摩尔的催化剂的钛（Ⅳ）丁醇。
5. 搅拌该反应混合物在180℃下，N ₂气氛下进行24小时，并在Dean-Stark分水器收集残留的水。使产物冷却至室温。

2，合成PU134的

方案2：PU134合成聚氨酯134的PU134的制备是在1.0当量ÂPHNGAD与2.0当量4,4'--亚甲基双（异氰酸苯酯）的反应合成的示意图，接着加入1.0。当量的1,4 - 丁二醇扩链剂。

1. 混一当量的多元醇PHNGAD的（锰〜1800道尔顿，3.2毫摩尔）与两个当量的4'4-亚甲基双（苯基异氰酸酯）（6.4毫摩尔）在无水N，N二甲基甲酰胺（12毫升）中。
2. 搅拌反应混合物，在70℃，N ₂气氛下。
3. 添加经由注射器逐滴催化剂的钛（Ⅳ）叔丁醇钾（0.8％重量）。
4. 1小时后，加入一当量的增链剂1,4丁二醇（3.2毫摩尔）。增加，在90℃的温度和N ₂气氛下搅拌24小时。
5. 以下的反应中，（也可以用己烷或水），加入乙醚收集的聚氨酯通过沉淀，直至出现沉淀逐滴加入到反应溶液中。
6. 离心溶液以5300×g离心5分钟。
7. 倒出上清液并擦干，在40℃的真空烘箱中，直到溶剂蒸发。
   注意：为了确保反应的最终产物具有对于对分子量分布的正确参数，功能GROU的聚合物，熔点和玻璃化转变温度的PS，各种分析技术和方法都可以使用，如凝胶渗透色谱法或FITR光谱。

3，准备PU134解决方案

1. 称取200毫克PU134到一个玻璃瓶。
2. 比为1：四氢呋喃，及组合四氢呋喃和dicloromethane在1比1，稀释：PU134到2％的终浓度在许多溶剂：氯仿，氯仿和甲苯中的1的组合。
   注意：根据要使用的聚合物上的合适的溶剂的选举而变化。不同的溶剂具有不同的沸点，可以影响聚合物的溶解。
3. 摇使用振动器的溶液剧烈20分钟，在室温以200 MOT /分钟的速度，直到溶液变得均匀，没有沉淀物观察到的。

4，镀膜玻璃幻灯片与PU134的

1. 将一个柔第二15毫米²盖玻片上的旋涂机。
2. 适用于50微升的PU134的解决方案给每个使用吸液管。调整PU134溶液的体积相应于所要求的盖玻片大小保持表面比成比例的量。
3. 旋转每个盖玻片7秒，23×g的。
4. 空气干燥的盖玻片，在室温下灭菌前至少24小时。

5，辐射盖玻片

1. 通过将10灰色的剂量使用实验室照射12分钟伽玛辐照聚合物涂层的盖玻片。
2. 紫外用30瓦紫外线灯16分钟每侧照射聚合物涂层的盖玻片。
3. 根据滑动大小将聚合物涂覆的盖玻片在合适的组织培养板中。

6，扫描电子显微镜

1. 通过在5×10 ^-1毫巴的压力的气氛中溅射为200秒黄金涂层聚合物的盖玻片。
2. 捕捉微克使用扫描电子显微镜以20千伏在二次电子成像模式的加速电压，聚合物涂覆的盖玻片的raphs。

7，原子力显微镜观察

1. 扫描20的聚合物表面的×20微米的区域。
2. 设置的扫描率从1.32 Hz至1.60赫兹。
3. 设置在扫描区域为512×512像素的分辨率。
4. 计算均方根涂层的方（RMS或RQ）通过利用从平均影像数据平面截取的高度偏差的平均值，表示为：
   
   其中Z是当前Z值，而N是在给定区域内的点的数量。
5. 7.5计算的偏差或平均表面粗糙度（Ra）使用图像的
   
   其中Z（x）是一个描述吨的功能他表面轮廓的高度（Z）和该样品在评价长度“L”的位置（x）来分析。 Ra表示的表面相对于中心面的平均值。

8，细胞培养和分化

1. 培养并如干草¹⁷所述的分化的人类胚胎干细胞系（人类胚胎干细胞）H9。
2. 分离用的解离试剂的细胞和replate他们到PU134包被的载玻片，在分化过程的第9天，在无血清培养基中的存在，作为描述在Szkolnicka ^18,19。
   注意：使用的酶的细胞解离的优选物理小区脱离。

9，细胞色素P450功能分析

1. 测量CYP3A活性按照制造商的说明进行操作。
2. 培育人类胚胎干细胞衍生的肝细胞在13日或19日，和媒体没有细胞 - 作为阴性对照，用适当的SUBSTR连吃5小时，在37℃。
3. 收集细胞和培养基的上清液，进行该测定按照生产商的说明进行操作。
4. 测量CYP活性和归一化的相对的表面面积（cm ^2）的水平。

10，免疫染色

1. 洗涤胚胎干细胞衍生的肝细胞用PBS，1分钟，重复2次。
2. 添加冰冷的100％甲醇中固定细胞，置于-20℃下进行10分钟。
3. 用PBS进行5分钟清洗细胞，并重复两次。
4. 孵育细胞用PBS / T（0.1％吐温）/ 10％BSA进行1小时，在室温。
5. 吸出的PBST溶液并加入稀释在PBS / T（0.1％吐温）/ 1％BSA中的相应的第一抗体，孵育在4℃下温和搅拌O 2 / N。
6. 洗涤细胞，用PBS / T（0.1％吐温）/ 1％BSA中进行5分钟，重复三次。
7. 稀释在PBS / T（0.1％吐温）/ 1％BSA中的相应抗体，加入到细胞中，并孵育在黑暗中在RT下1小时，轻轻摇动。
8. 用PBS进行5分钟清洗细胞，并重复三次。
9. 添加MOWIOL 488（含DAPI 1:1,000）到每个孔中，加盖玻片轻轻以减少气泡的数目。储存固定的细胞在4°C黑暗。观察用显微镜适当的过滤器和荧光灯染色。优化的第一和第二抗体都列在表1中 。

Results

聚合物溶剂影响聚合物涂覆的表面的形貌

聚氨酯134溶解在氯仿中，无论是单独使用或与甲苯或四氢呋喃或二氯甲烷中，并在载玻片上旋涂一层的不同制剂的组合。扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）进行了表征的聚合物涂层的物理性能（ 图1）。使用甲苯或氯仿中得到的涂层不是均匀的，这表明一个不均匀的涂层与PU134沉淀（ 图1A）。与此相反，四氢呋喃是一种合适的溶剂，允许一个更均匀的表面（ 图1A）的旋涂。表面形貌是使用均方根（RMS），平均粗糙度（Ra）用AFM测得的。 PU134溶于四氢呋喃展出粗糙度的降低相比40％为the其他溶剂（ 图1B和1C）。这些数据表明，使用四氢呋喃作为溶剂，提供PU134的生物应用的更均匀的涂层。

聚合物形貌对肝功能的影响显著

Discussion

许多用于产生从干细胞的肝细胞的现有方法依赖于动物来源的未定义的矩阵。这些基材可以是昂贵的，充满变数，影响细胞的功能和稳定性，较显著障碍中的应用。因此，我们进行了一个屏幕的量支持的干细胞衍生的肝细胞培养的合成材料。我们已经确定了，一个简单的聚氨酯（PU134），通过聚合PHNGAD，MDI和一个扩展，在结合强大的肝细胞分化的方式形成，稳定肝细胞的表型，当与基质胶¹⁵相比提高了细胞的功能。

处理现有的生物基质，培养中常用的分化干细胞，如玻连蛋白^22，层粘连蛋白521 ²³或基质胶的，是有效的短期内维修。相比之下，PU134涂层表面提供了优越的底hepatocy德文化。此外，表面形貌与聚合物灭菌的优化导致了电池的性能，在提供人类肝模型在规模和可靠的性能的关键因素进一步改进。

扩链剂与异氰酸苯酯的性质表示该过程的关键步骤之一;为消除或更换任何部件会显著损害聚合物表面的，因此，细胞附着和干细胞衍生的肝细胞功能活性。该聚合物的组合物将影响物理参数，如弹性和湿润性^2...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
聚合物PU134涂层盖玻片的合成、制备、包被和表征
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
辐照器	CIS Biointernational	IBL 637
旋涂机	专业涂层系统	P-6708
扫描电子显微镜	飞利浦	XL30CPSEM
原子力显微镜	DimensionV 纳米镜，VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
紫外线灯泡	ESCO
NanoScope 分析软件	VEECO		1.20 版
荧光显微镜	奥林巴斯	TH45200	使用 Volocity 4 软件
组织培养板	康宁，英国	3527
载玻片	科学实验室用品	MIC3308
二甘醇	Sigma–Aldrich	93171
1,6-己二醇	Sigma–Aldrich	240117
新戊二醇	Sigma–Aldrich	408255
己二酸	Sigma–Aldrich	9582
无水 N，N-二甲基甲酰胺	Sigma–Aldrich	227056
二乙醚	Sigma–Aldrich	676845
丁醇钛 （IV）	西格玛–Aldrich	244112
1,4-丁二醇	西格玛–Aldrich	493732
真空烘箱	Thermoscientific
4,4'-亚甲基双（苯基异氰酸酯）	Sigma–Aldrich	101688
四氢呋喃	Sigma–Aldrich	401757
溅射镀膜机	Bal-Tec SCD 050
<强>免疫染色
>磷酸盐缓冲盐水（-MgCl2， -CaCl2）	Gibco	10010031	在室温下储存
PBST，PBS 由 0.1% 吐温 20  制成	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
甲醇	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich， UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	钙生化学	475904	根据制造商说明由 Tris HCl 和甘油组成
细胞培养和功能测定CYP3A 活性 pGLO 试剂盒 Promega V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013