本文将重点介绍用于干细胞来源的人肝细胞长期稳定培养的聚合物包被表面的开发。
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摘要
摘要
目前，细胞生物学的主要局限之一是维持分化细胞的表型。生物基质常用于培养和维持原代肝细胞及多能干细胞来源的肝细胞。尽管生物基质具有一定效用，但仅支持肝细胞的短期培养，限制了其广泛应用。我们尝试采用一种合成聚合物涂层来克服这些局限。聚合物是生物材料中最广泛的一类，具有多种多样的机械、物理和化学特性，可根据特定用途进行精细调控。尤为重要的是，这类材料可实现标准化生产，确保质量可靠，并具有批间一致性。这对于在药物测试行业中用于高通量筛选或细胞治疗的细胞扩增至关重要。聚氨酯（PUs）是一类在细胞培养中展现出前景的材料。本文介绍并讨论了我们在优化聚氨酯涂层表面方面取得的最新进展，该表面可用于长期培养具有稳定表型的人肝细胞。
引言
生物材料已广泛应用于多能干细胞的维持和分化1。尽管这些生物基质具有促进作用，但通常含有大量未明确的成分。Matrigel 是干细胞培养和分化中常用的一种基质，然而其成分的不稳定性会影响细胞功能和表型。尽管已有多种替代性的、成分更为明确的生物基质被使用2-7，但这些基质的动物来源或可扩展性差使其不适合工业化生产。因此，开发具有明确成分和稳定性能的合成替代物，是干细胞研究中的关键目标。
为了克服未定义细胞培养基质的局限性，化学与生物学领域的跨学科合作已开发出能够支持细胞表型的合成材料。合成基质具有可扩展性、成本效益高，并可被制造成复杂的三维结构，模拟 体内 环境。由于这些特性，合成基质已被广泛用于支持和促进多种细胞类型的分化 8-10.
先进且高通量的检测方法促进了从大量文库中快速筛选合成材料，并已成功开发出具有灵活特性的新型材料，广泛应用于生物医学研究与开发11-13。利用高通量聚合物微阵列筛选技术，我们快速鉴定出一种适用于维持人干细胞来源肝细胞的简单聚氨酯材料（PU134）。该聚合物在肝细胞分化和功能方面优于动物来源的基质14-16。随后，我们进一步优化了涂层条件、表面形貌及灭菌工艺，以评估其对聚合物在稳定肝细胞功能和延长细胞寿命方面性能的影响。该研究对于理解肝细胞生物学基本机制，以及在基于细胞的建模和再生医学应用方面具有重要意义。
此处描述的技术代表了如何优化合成聚合物表面以维持细胞表型的一个实例。我们相信，将该技术与高效的无血清肝细胞分化方案相结合，有望实现肝细胞的规模化生产，用于 体外 建模与再生医学
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方案
1. PHNGAD（聚[1,6-己二醇/新戊二醇/二乙二醇-交替-己二酸]二醇）的合成
方案 1：PHNAGD 的合成。 PHNAGD 合成过程的示意图。PHNAGD 由 1,6-己二醇、二乙二醇、新戊二醇和己二酸反应制得。PHNAGD，即聚[1,6-己二醇/新戊二醇/二(乙二醇)-交替-己二酸]二醇。
- 对单体1,6-己二醇、二乙二醇和新戊二醇进行热处理 40 °C 在真空烘箱中干燥48小时以去除任何残留水分。在真空条件下冷却至室温。
- 将每种单体各22 mmol以及戊二酸（55 mmol）加入装有搅拌子并连接Dean-Stark装置的双颈圆底烧瓶中。
- 将整个装置置于真空环境中，并温和加热玻璃器皿 40 °C 6 小时，以避免在将化学品加入烧瓶时吸收水分。
- 用注射器逐滴加入0.0055 mol催化剂钛酸四丁酯。
- 搅拌反应混合物 180 °C，在 N2 在大气条件下反应24小时，并用迪安-斯塔克装置收集残留水分。让产物冷却至室温。
2. PU134的合成
方案 2：PU134 的合成。 聚氨酯 134 合成过程的示意图。PU134 通过 1.0 当量的 PHNGAD 与 2.0 当量的 4,4′-二苯基甲烷二异氰酸酯反应制备，随后加入 1.0 当量的 1,4-丁二醇链延伸剂。
- 将一当量的多元醇 PHNGAD（Mn ~1,800 Da，3.2 mmol）与两当量的 4,4'-二苯基甲烷二异氰酸酯（6.4 mmol）溶于无水溶剂中混合 N,N- 二甲基甲酰胺（12 ml）
- 搅拌反应混合物 70 °C，在 N2 大气
- 使用注射器逐滴加入催化剂钛酸四丁酯（0.8% 质量分数）。
- 反应1小时后，加入一当量的扩链剂1,4-丁二醇（3.2 mmol）。升高温度至 90 °C 并置于氮气氛围下搅拌24小时2 大气
- 反应结束后，通过沉淀法收集聚氨酯：将乙醚（也可使用己烷或水）逐滴加入反应溶液中，直至沉淀产生。
- 在 5,300 × g 条件下离心溶液 5 分钟。
- 弃去上清液并干燥 40 °C 在真空烘箱中干燥至溶剂完全蒸发。
注意：为了确保反应最终产物在分子量分布、聚合物官能团以及熔点和玻璃化转变温度等方面具有正确的参数，可采用多种分析技术和方法，例如凝胶渗透色谱法或傅里叶变换红外光谱法。
3. PU134 溶液的制备
- 称取 200 mg PU134 置于玻璃瓶中。
- 将 PU134 溶解于若干种溶剂中，配制成终浓度为 2% 的溶液：氯仿、氯仿与甲苯按 1:1 比例混合的溶剂、四氢呋喃，以及四氢呋喃与二氯甲烷按 1:1 比例混合的溶剂。
注意：合适溶剂的选择取决于所用聚合物的种类。不同溶剂具有不同的沸点，可能影响聚合物的溶解性。 - 将溶液在室温下使用摇床以 200 mot/min 的速度剧烈振荡 20 分钟，直至溶液变为均一且无沉淀物可见。
4. 使用 PU134 包被玻片
- 将一个直径15 mm2的圆形盖玻片放置在旋涂仪上。
- 使用移液器向每个盖玻片上加入50 μl PU134溶液。根据所需盖玻片的尺寸按比例调整PU134溶液的体积，保持体积与表面积的比例恒定。
- 以23 × g的转速旋转每个盖玻片7秒。
- 在灭菌前于室温下空气中干燥至少24小时。
5. 盖玻片的照射
- 使用实验室辐照仪，以10 Gy的剂量对聚合物涂层盖玻片进行γ射线辐照，持续12分钟。
- 使用30 W的紫外灯，对聚合物涂层盖玻片每面进行16分钟的紫外辐照。
- 根据玻片尺寸，将聚合物涂层盖玻片放入合适的组织培养板中。
6. 扫描电子显微镜
- 在气压为 5 x 10-1 毫巴的环境中，通过溅射法对聚合物盖玻片镀金 200 秒。
- 使用扫描电子显微镜，在 20 kV 加速电压下的二次电子成像模式下，采集镀有聚合物的盖玻片的显微图像。
7. 原子力显微镜观察
- 扫描聚合物表面 20 x 20 μm 的区域。
- 设置扫描速率为 1.32 Hz 至 1.60 Hz。
- 在扫描区域内设置分辨率为 512 x 512 像素。
- 通过使用从平均图像数据平面获取的高度偏差的平均值，计算涂层的均方根粗糙度（RMS 或 Rq），表达式如下：
其中 Zi 为当前 Z 值，N 为给定区域内数据点的数量。 - 使用以下公式计算图像的偏差或平均表面粗糙度（Ra）：
其中 Z(x) 为描述在评定长度“L”范围内样品高度（Z）与位置（x）关系的表面轮廓函数。Ra 表示相对于中心平面的表面高度的平均值。
8. 细胞培养与分化
- 按照 Hay 17 中所述方法培养并分化人胚胎干细胞系（hESC）H9。
- 在分化过程的第9天，使用解离试剂将细胞解离，并在无血清培养基条件下将其重新接种至PU134包被的载玻片上，具体操作参见 Szkolnicka 18,19。
注意：建议使用酶法细胞解离，而非物理方法进行细胞脱离。
9. 细胞色素p450功能测定
- 按照制造商说明书测定CYP3A活性。
- 将第13天或第19天由hESC分化而来的肝细胞与不含细胞的培养基（作为阴性对照）在37 °C下，与相应的底物共同孵育5小时。
- 收集细胞和培养基的上清液，按照制造商说明书进行检测。
- 测定CYP活性水平，并相对于表面积（cm2）进行归一化处理。
10. 免疫染色
- 用 PBS 清洗由 hESC 分化而来的肝细胞，每次 1 分钟，重复两次。
- 加入预冷的 100% 甲醇以固定细胞，置于 -20 °C 环境中 10 分钟。
- 用 PBS 清洗细胞，每次 5 分钟，重复两次。
- 在含 0.1% Tween 的 PBS/T 缓冲液（含 10% BSA）中室温孵育细胞 1 小时。
- 吸除 PBST 溶液，加入用 PBS/T（0.1% Tween）/1% BSA 稀释的适当一抗，于 4 °C 轻柔振荡条件下过夜孵育。
- 用 PBS/T（0.1% Tween）/1% BSA 清洗细胞，每次 5 分钟，重复三次。
- 将适当的二抗用 PBS/T（0.1% Tween）/1% BSA 稀释后加入细胞中，于室温避光、轻柔振荡条件下孵育 1 小时。
- 用 PBS 清洗细胞，每次 5 分钟，重复三次。
- 向每孔加入 MOWIOL 488（含 DAPI，1:1,000），轻轻盖上盖玻片以减少气泡产生。将固定后的细胞置于 4 °C 避光保存。使用配备适当滤光片和荧光灯的显微镜观察染色结果。优化后的一抗和二抗列于 表 1 中。
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结果
聚合物溶剂影响聚合物涂层表面的形貌
将聚氨酯134（PU134）溶于氯仿中，单独使用或与甲苯、四氢呋喃或二氯甲烷混合使用，并将不同配方溶液旋涂于玻璃载片上。采用扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）对聚合物涂层的物理性质进行表征（图1）。使用甲苯或氯仿所得的涂层不均匀，显示出涂层表面不平整并伴有PU134析出（图1A）。相比之下，四氢呋喃是一种合适的溶剂，可实现更为均匀的表面旋涂（图1A）。通过原子力显微镜（AFM）测定表面形貌，采用均方根粗糙度（RMS）和平均粗糙度（Ra）进行量化。与其它溶剂相比，PU134溶于四氢呋喃所得涂层的粗糙度降低了40%（图1B和图1C）。这些数据表明，使用四氢呋喃作为溶剂可获得更均匀的PU134涂层，适用于生物学应用。
聚合物形貌对肝细胞功能具有显著影响
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讨论
目前许多将干细胞诱导为肝细胞的方法依赖于来源动物且成分未定义的基质。这些基质可能成本高昂且批次间差异大，会影响细胞功能和稳定性，从而成为实际应用中的重要障碍。因此，我们筛选了能够支持干细胞来源肝细胞培养的合成材料。我们鉴定出一种简单的聚氨酯（PU134），由PHNGAD、MDI与扩链剂聚合而成。结合稳健的肝细胞分化方案，该材料相较于Matrigel15能够稳定肝细胞表型并改善细胞功能。
常用的生物基质（如玻连蛋白22、层粘连蛋白52123或基质胶）在干细胞培养和分化中应用广泛，适用于短期维持。相比之下，PU134包被的表面为肝细胞培养提供了更优越的基底。此外，表面形貌的优化和聚合物灭菌方法的改进进一步提升了细胞性能，这是实现可重复、规模化人肝模型构建的关键因素。
扩链剂和苯基异氰酸酯的性质是该工艺的关键步骤之一；若消除或替换其中任一组分，将显著损害聚合物表面，从而影响干细胞来源肝细胞的黏附及功能活性。聚合物的组成会影响其弹性、润湿性等物理参数24
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披露
D.C.H. 是 FibromEd Products Ltd. 的首席科学官、董事、创始人及股东。M.B. 和 J.P.I. 是 FibromEd Products Ltd. 的创始股东。
致谢
D.C.H.、M.B. 和 F.K. 获得英国工程与物理科学研究委员会后续基金（EPSRC Follow on Fund）的支持。B.L-V 和 D.S. 各自获得英国医学研究理事会（MRC）博士生奖学金的支持。K.C. 获得英国再生医学平台资助的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚合物PU134包被盖玻片的合成、制备、包被及表征 | |||
| 摇床 | Edmun Bühler | KS-15 | |
| 辐照仪 | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| 旋涂仪 | Specialty Coating System | P-6708 | |
| 扫描电子显微镜 | Philips | XL30CPSEM | |
| 原子力显微镜 | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| 紫外灯泡 | ESCO | ||
| NanoScope分析软件 | VEECO | 版本 1.20 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | TH45200 | 使用 Volocity 4 软件 |
| 组织培养板 | Corning, UK | 3527 | |
| 玻璃载片 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| 二甘醇 | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-己二醇 | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| 新戊二醇 | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| 己二酸 | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| 无水N,N-二甲基甲酰胺 | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| 乙醚 | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| 四丁氧基钛 | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-丁二醇 | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| 真空烘箱 | Thermoscientific | ||
| 4,4’-亚甲基双(苯基异氰酸酯) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| 四氢呋喃 | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| 溅射镀膜仪 | Bal-Tec SCD 050 | ||
| 免疫染色 | |||
| 磷酸盐缓冲液（不含MgCl2，不含CaCl2） | Gibco | 10010031 | 室温保存 |
| PBST（含0.1% TWEEN 20的PBS） | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| 甲醇 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | 按照生产商说明书用Tris HCl和甘油配制 |
| 细胞培养与功能检测 | |||
| CYP3A活性pGLO试剂盒 | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 |
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