体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

摘要

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。

摘要

胰腺是一个重要的器官，可调节葡萄糖稳态并分泌消化酶。关于胰腺胚胎发育的研究已推动了从干细胞生成胰腺细胞的方案的建立¹。整个胚胎期的胰腺可在多个发育阶段进行体外培养^2-4。这些培养方法已被用于药物测试以及发育过程的成像研究。然而，器官的扩展能力非常有限，且由于器官趋于扁平化，其形态发生过程无法被真实地重现。

我们提出了一种三维（3D）培养条件，可有效扩增解离的小鼠胚胎胰腺前体细胞。通过调控培养基的成分，可生成两种结构：一种主要是由处于初始状态的胰腺前体细胞扩增形成的中空球状结构；另一种则是更为复杂的类器官，其中前体细胞进一步发育为更成熟的扩增状态，并分化为内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞，且能自发地自组织，形态上类似于胚胎期的胰腺。

我们在此展示，体外过程重现了天然胰腺发育的诸多方面。该培养系统通过将初始复杂性简化为少数前体细胞，适用于研究细胞如何协同形成器官。该模型可再现胰腺的三维结构，因而可用于研究形态发生过程，包括上皮结构的极化和分支形成。同时，该系统也适用于评估细胞对微环境机械信号（如刚度）的响应及其对细胞张力完整性的影响。

引言

器官培养提供了一种有用的研究模型，可弥合复杂但高度相关的体内环境与简化但相关性较低的体外系统之间的差距 体内 研究以及细胞系模型的便捷但近似的模拟。在胰腺研究中，目前尚无与胰腺前体细胞完全等同的细胞系，尽管存在一些可模拟内分泌和外分泌细胞的永生化细胞系。成年完整胰腺无法进行体外培养；分离的内分泌胰岛可在无细胞增殖的情况下维持数周，而组织切片也可被保存 体外 几小时 ⁵胚胎胰腺培养不仅被广泛用于研究其发育过程，还被用于探究上皮-间充质相互作用。 ^4,6,7，以成像观察过程 ⁸ 或与它们发生化学干扰 ⁹. 主要采用两种器官培养方法：第一种是在纤维连接蛋白包被的培养板上培养胰腺芽 ²，这有利于成像；第二种方法是在滤膜上于气液界面培养器官 ^3,4 最有利于保持形态发生。尽管这些方法非常有用，但会导致一定程度的扁平化；与正常发育相比，前体细胞的扩增极为有限，且起始细胞群体组成复杂，包含所有类型的胰腺细胞和间充质细胞。

培养和扩增分散的原代细胞的能力对于研究谱系关系以及揭示分离细胞类型的内在特性具有重要意义¹⁰。Sugiyama 等.¹¹ 能够在饲养层上将胰腺前体细胞和内分泌前体细胞维持培养3-5天，并保留部分功能特征。胰腺球（pancreatospheres）....

方案

本方案旨在培养源自小鼠E10.5期解离的胰腺上皮细胞的胰腺类器官。

该方案需要获得动物实验的伦理批准。

1. 从小鼠E10.5胚胎中分离背侧胰腺芽

1. 在胚胎第 (E) 10.5 天处死定时妊娠的小鼠，用剪刀打开腹部，取出两侧子宫角，并将其置于盛有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）或达尔伯克改良必需培养基（DMEM）的 10 cm 培养皿中。从处死动物到细胞接种的整个实验过程需在 60–90 分钟内完成，以避免细胞损伤。
2. 使用小剪刀将子宫分离成单个胚胎片段。将一个胚胎转移至含有冷 PBS 的 35 mm 培养皿中，并在解剖显微镜下以上部照明观察。用解剖镊子去除周围的肌肉、蜕膜和卵黄囊，暴露胚胎。将胚胎放回冷 DMEM 培养基中。可使用 3 ml 塑料移液管/滴管轻松转移胚胎。以类似方式逐个分离每个胚胎后再继续操作。
3. 将一个胚胎放入盛有 PBS 的洁净 35 mm 培养皿中。
   1. 使用细镊子（0.05 mm 宽度）去除前肢。将镊子轻轻插入开口处，以分离消化道与脊髓区域（图 1）。可选：为更方便观察胃部，可去除胚胎上半身至心脏处，并去除卵黄柄下方的尾部区域。
   2. 定位胃、肝和肠。用镊子将胃至肠段的消化道分离出来，并置于冰上预冷的 DMEM 中（图 1）。背胰芽位于....

结果

E10.5 时期的背侧胰腺前体细胞经解离后接种于三维 Matrigel 中，可重现胰腺发育过程。使用荧光报告基因可最简便地追踪这些前体细胞。在本实验中，我们采用了一种转基因小鼠，该小鼠在无他莫昔芬存在的情况下，由 Pdx1 启动子驱动表达核定位的 GFP 蛋白（Pdx1-Ngn3-ER^TM-nGFP）（视频 1），因此不会激活 Neurog3⁴（图 2）。

使用类器官培养基后，细胞小簇在最初几小时内开始发生初始聚集成团。在前4天内，可通过细胞簇的增大观察到其扩张（图2A）。从第5天起，在体积最大的20%类器官中开始形成分支。单个细胞不会扩张，并且会失去Pdx1的表达，而较大的细胞簇则保持Pdx1的表达²⁸。

在这些条件下，前体细胞会经历显著的形态发生过程，形成分支状的上皮结构。该过程仅在前.......

讨论

功能性β细胞的大规模生产 体外 仍然无效 ¹在此具有挑战性的背景下，发育生物学研究有助于解析功能性β细胞分化所必需的精确信号。本方案可用于胚胎胰腺前体细胞的维持、扩增与分化 体外包括形成能够产生胰岛素且不共表达其他内分泌激素的β细胞，这些细胞具有高水平的Pdx1，表达可使胰岛素成熟的前体转化酶，并含有经过加工的成熟胰岛素 ²⁸系统中的关键因素包括FGF信号通路（通过添加肝素增强的外源性FGF刺激）、Notch信号通路（内源性）以及Y-27632对ROCK的抑制作用：若缺乏这些因素，则无法生成或仅能生成极少量的类器官和球状结构。 ²⁸. FGF 和 Notch 信号活性的必要性可基于其在胰腺发育中的重要作用而得以理解 体内 ²⁸ROCK抑制剂可被blebbistatin替代，从而揭示出在细胞解离后微丝动态的过度激活会导致细胞死亡增加、前体细胞转录因子Pdx1受到强烈抑制以及细胞扩增能力丧失。有趣的是，类器官培养基中的许多其他组分被证明各自并非必需，但若共同缺失则会导致上皮分支结构的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
青霉素-链霉素	Gibco	15070-063	储存于 -20 °C
KnockOut 血清替代物（添加剂）	Gibco	10828-028	储存于 -20 °C
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	3148-25ML	储存于 4 °C
佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）	Calbiotech	524400-1MG	储存于 -20 °C
Y-27632（ROCK 抑制剂）	Sigma Aldrich	ab120129	储存于 -20 °C。注意！稳定性/来源常导致问题。
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	储存于 -80 °C
重组人 R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	储存于 -80 °C
重组小鼠 R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	储存于 -80 °C
重组人 FGF1（aFGF）	R&D	232-FA-025	储存于 -80 °C — 不可添加以增加β细胞产量
肝素（Liquemin）	Drossapharm		储存于 4 °C
重组人 FGF10	R&D	345-FG-025	储存于 -80 °C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
青霉素-链霉素	Gibco	15070-063	储存于 -20 °C
B27 ×50（添加剂）	Gibco	17504-044	储存于 -20 °C
重组人 FGF2（bFGF）	R&D	233-FB-025	储存于 -80 °C
Matrigel	Corning	356231	储存于 -20 °C
0.05% 胰蛋白酶	Gibco	25300-054	储存于 4 °C
RNAlater — RNA 稳定试剂	Qiagen	76104	室温保存
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	工作浓度：1.25 mg/ml。储存于 -20 °C
用于重悬的 BSA	Milipore	81-068	用于细胞因子的重悬  — 储存于 -20 °C
胎牛血清（FCS）	Gibco	16141079	储存于 -20 °C
60 孔 MicroWell 培养板	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4 孔板	Thermo Scientific	176740
96 孔 F 型底板	Greiner Bio	6555180
玻璃底板	Ibidi	81158
一次性玻璃微量移液管	Blaubrand	708745
显微镜			配备 Hamamatsu ORCA ER B7W 相机以及 Ludin Cube 和 Box 的 Cell® 成像系统（电动倒置 Olympus IX81 显微镜台） 配备 Leica DFC365 FX 相机和 AF6000 Expert/Matrix 软件控制界面的 Leica DMI6000 B 显微镜台，周围配有 Ludin Cube 和 Box。
物镜			Olympus UPLAN FL NA 0.30 空气 9.50 mm 10X 长工作距离； Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 空气 11.0 mm 10X 长工作距离