航天飞行血液诊断技术需要创新。目前公开发表的关于在轨飞行和微重力环境下健康诊断技术的演示研究较少。本文介绍一种用于构建和运行抛物线飞行测试平台的方法，该平台适用于一种便携式即时检测流式细胞仪原型的设计，其组件和制备策略可适配于其他实验装置。
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方法文章
微缩流式细胞仪原型机及其配套微流控混合技术在减重力环境中的硬件演示
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
直到最近，宇航员的血液样本都是在飞行过程中采集，通过航天飞机运回地球，并在地面实验室中进行分析。如果人类要前往近地轨道以外的空间，就必须转向适用于太空环境的即时检测（POC）技术。此类检测需要具备全面性，能够在微重力环境下简便操作，并且不受发射及太空飞行过程中各种应力的影响。尽管已开发出无数POC设备以模仿实验室规模的仪器，但大多数设备应用范围狭窄，且极少有设备被证明可在飞行中微重力环境下实际使用。事实上，目前在微重力条件下开展的生物医学诊断演示极为有限，这使得在测试新技术时，组件选择以及某些后勤挑战难以应对。为填补这一空白，我们提出一种模块化方法，用于构建和操作一种原型血液诊断设备及其配套的抛物线飞行测试平台，该平台符合在抛物线飞行微重力飞机上进行飞行测试的标准。该方法首先聚焦于测试平台的组装，用于在飞行中微重力环境下对流式细胞仪及配套的微流控混合芯片进行测试。组件设计可适配其他设备，其中一些定制组件，如微量样本加载器和微混合器，可能具有特别的参考价值。随后，该方法转向飞行前准备工作，提供相关指南和建议，以确保飞行测试的成功，涵盖用户培训、标准操作程序（SOP）的制定以及其他相关事项。最后，本文描述了针对我们演示实验的在轨实验操作流程。
引言
当前适用于太空环境的健康诊断技术的不足，已成为制约载人深空探索进一步发展的限制因素。理想的诊断技术应具备全面性、易于在微重力环境下使用，并且相对不受发射及太空飞行过程中各种应激因素的影响（例如，高g力、振动、辐射、温度变化和舱内压力变化）。即时检测（POCT）领域的进展有望通过更小的患者样本量（例如，指尖采血）、更简单和更小型化的流体控制系统（即，微流控技术）以及更低的电力需求等优势，转化为适用于太空飞行的有效解决方案。 流式细胞术是一种具有吸引力的在轨即时检测（POC）方法，因其技术用途广泛，可用于细胞计数和生物标志物定量分析，同时具备显著的小型化潜力。此前与太空应用相关的流式细胞仪包括：利用弧光灯诱导荧光与电子体积（库尔特体积）同步测量的“核包装效率”（NPE）仪器1-4；一种相对小型的台式流式细胞仪，实现了“在零重力条件下首次实时获取流式细胞术数据”5；一种“无鞘流微流式细胞仪”，可对经预处理的5 µl全血样本进行4项和5项白细胞（WBC）分类计数6-9；以及一种“基于光纤的”流式细胞仪，最近已在国际空间站内进行在轨测试10。
评估适用于太空环境的诊断技术通常在减重力飞机上进行，此类飞机通过近似抛物线飞行轨迹来模拟特定程度的失重状态（例如，零重力，火星重力） 11
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方案
本方案中使用的人类血液样本是在获得机构审查委员会（IRB）批准后，采用微创方法采集的（参见致谢部分）。
1. 装置组装
- 组装用于微重力条件下的简易流式细胞仪系统的原型组件（流体、光学、控制/数据采集电子器件）
- 制备一种重量轻、功耗低的压力系统，用于驱动流体控制系统
- 将微型气泵连接至差压传感器。
- 使用脉宽调制并通过自定义控制软件中的比例-积分-微分控制器调节占空比，以控制泵的输出，从而维持恒定的驱动压力（步骤 1.1.7）。
- 组装一个可无空气滞留加载液体的液体源容器（参见步骤 3.4）
- 安装一个刚性塑料小瓶（图1A带有乳胶隔膜、可牢固密封的瓶盖以及位于小瓶底部的进气管（使用光学胶密封连接）。
- 确保泵在无空气或液体泄漏的情况下对小瓶加压，压缩隔膜以驱动液体从帽出口管路流出。
- 设计一个液体废液容器，用于收集废液，同时避免产生背压，以免影响液体流动
- 采用瓶中瓶胶粘设计（图1B用于双重防护。
- 用带有固定泡沫海绵窗的瓶盖封住小瓶，该泡沫海绵窗可截留漂浮废物，同时允许瓶内外气压与舱内环境平衡。
- 制备一种重量轻、功耗低的压力系统，用于驱动流体控制系统
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结果
显微混合器演示的代表性结果如图7所示，该图像由体视显微镜配备的CCD相机拍摄。可在螺旋通道的任意位置以及出口通道中对混合效果进行视觉评估，实验涉及两组流体：血液/生理盐水和蓝色/黄色染料。对二维图像的定量分析可包括测定通道不同区域宽度方向上的颜色均匀性，具体方法见其他文献38-40。更多细节请参见补充图1。微流控芯片处理气泡的演示结果见补充图2。
光学模块和样品加载器演示中颗粒检测的结果如图所示 图7C 和 D分别。荧光标记白细胞的光学阻断检测 (图7C) 从约1.5 g过渡到接近零重力时，样品表现相对稳定，且在返回1.5 g的过程中持续保持稳定。样品加载器数据显示，样品已成功加载（此处为月球重力条件下），并到达光学模块以进行检测 (图7D
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讨论
本文所述方法在2010年FAST抛物线飞行期间，有效验证了主要技术组件（样品加载、微流控混合和光学检测），其结果与地面测试相当。文中描述的培训和标准操作程序（SOP）方法尤为有效，有助于明确在练习演示中所依赖的工具及其他“辅助手段”，而这些在抛物线飞行任务中将无法使用。
需要改进的方面包括密闭性和布局设计。定制的丙烯酸组件在密闭性方面可能不够坚固。在飞行过程中经历重力转变时，“手套箱”被一名乘客碰撞，随后在飞机剧烈着陆时散开。在蓝黄染料混合演示期间，连接至微流控芯片的管路脱开，导致食用染料短暂泄漏到客舱环境中。这一问题需要在高重力（高-g）时段内修复，而该时段尤其困难，因为重新连接微孔管路需要操作者具备较高的灵巧性和稳定性。在布局方面，将笔记本电脑置于站立高度操作位置，使得在高-g时段内操作变得困难。操作人员在高-g阶段尝试站立时可能会感到头晕。采用中等高度的计算机可能是更好的替代方案，但这需要重新调整原型子组件的位置。其他研究人员在其抛物线飞行实验装置中加入了座椅，以稳定测试操作人员26，但这需要额外的空间，而抛物线飞行中的可用空间十分有限。
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披露
Eugene Y. Chan、Candice Bae 和 Julia Z. Sharpe 是通过商业实体 DNA Medicine Institute 提交的相关技术专利的发明人。
致谢
硬件开发由美国国家航空航天局（NASA）小型企业创新研究（SBIR）合同 NNX09CA44C 和 NNX10CA97C 提供支持。光学模块和样本加载器演示的数据分析由 NASA 第三阶段合同 NNC11CA04C 提供资助。人血采集操作依据 NASA 国际审查委员会（IRB）方案编号 SA-10-008 进行。控制与数据采集软件由美国国家仪器公司（National Instruments）医疗设备资助项目提供。微芯片模具在约翰斯·霍普金斯大学微加工设施和哈佛大学纳米系统中心制作完成。Otto J. Briner 和 Luke Jaffe（DNA医学研究所）于2010年夏季协助完成了机架组装。NASA 飞行周期间的视频资料由 NASA 飞行视频团队提供。Carlos Barrientos（DNA医学研究所）提供了摄影与图表制作协助。特别感谢2010年技术太空环境便捷获取计划（Facilitated Access to the Space Environment for Technology 2010 Program）、NASA 减重力办公室（Reduced Gravity Office）、人类适应与对抗措施部门（Human Adaptation and Countermeasures Division）、NASA 格伦研究中心（Glenn Research Center）、ZIN 技术公司（ZIN Technologies）以及人类研究计划（Human Research Program）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型气泵 | Smart Products, Inc. | AP-2P02A | 最大压力 = 6.76 psi；1.301” x 0.394” x 0.650”，0.28 oz (8 g)；可直接从 Smart Products 购买 |
| 差压传感器 | Honeywell International, Inc. | ASDX015D44R | 量程 为 0–15 psi；0.974" x 0.550" x 0.440"，0.09 oz (2.565 g)；供应商包括 Digi-Key 和 Mouser Electronics |
| 硬质塑料小瓶（小号） | Loritz & Associates, Inc. | 55-05 | 聚苯乙烯材质；内径 0.81" (20.6 mm)，瓶高 2.06" (52.4 mm)；可直接从 LA Container Inc. 购买；Dynalab Corp. 提供类似产品 |
| 乳胶检查手套 | dynarex corporation | 2337 | 用于液体源小瓶中的乳胶隔膜的中指部分。 其他品牌（例如，Aurelia ® Vibrant ™）亦可接受。 |
| 光学胶 | Norland Products | NOA 88 | 低放气粘合剂；可直接从 Norland 购买；Edmund Optics Inc. 亦有供应 |
| 三通电磁阀 | The LEE Company | LHDA0531115H | 气体阀门，但也可用于液体；长 1.29"，直径 0.28"。 该产品已停产。 The LEE Company 提供类似产品。 |
| 容积式水流量计 | OMEGA Engineering inc. | FLR-1602A | 强烈推荐使用非接触式流量计。 我们推荐 SENSIRION LG16 OEM 液体流量传感器，适用于从 nl/min 到 5 ml/min 的流量范围。 |
| PCD-mini 光子探测器 | Sensl | PCDMini-00100 | 用于荧光检测；可直接从 Sensl 购买 |
| 加速度计 | Crossbow Technology, Inc. | CXL02LF3 | 三维力检测。 由 NASA 提供给 DMI。 Vernier Software & Technology, LLC 提供类似产品。 |
| 体视显微镜 | AmScope | SE305R-AZ-E | |
| CCD 相机 | Thorlabs | DCU223C | 1,024 x 768 分辨率，彩色，USB 2.0；可直接从 Thorlabs 购买 |
| CCD 相机用 USB 和触发线缆（输入/输出） | Thorlabs | CAB-DCU-T1 | 可直接从 Thorlabs 购买 |
| 微孔管 | Saint-Gobain Corporation | AAD04103 | Tygon®；内径 0.02"，外径 0.06"，长度 500 ft，壁厚 0.02"。供应商：VWR，Thermo Fisher Scientific Inc. |
| 空心钢针 | New England Small Tube | (定制) | 外径 0.025"，内径 0.017"，长度 0.500”，304 型不锈钢管，经切割、去毛刺和钝化处理；用于连接微孔管和芯片管路 |
| 滑动夹 | World Precision Instruments, Inc. | 14042 | 可直接从 World Precision Instruments 购买 |
| 鲁尔接头配件 | World Precision Instruments, Inc. | 14011 | 可直接从 World Precision Instruments 购买 |
| 硅片 | Addison Engineering, Inc. | 直径 6"；用于 SU-8 模具制造 | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体固化剂 | Dow Corning | 3097358-1004 | 供应商：Global Industrial SLP, LLC |
| 针头（23 号），斜面尖端 | Terumo Medical Corporation | NN-2338R | 超薄壁；23 G x 1.5"；22 G 也可使用；供应商：Careforde, Inc.， Port City Medical |
| 分配针头（23 号），钝头 | CML Supply | 901-23-100 | 23 G x 1"； 可从 CML Supply 购买 |
| 盖玻片 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-518-105E | Gold Seal™ 无腐蚀性硼硅酸盐玻璃；用于 PDMS 芯片盖片；24 x 60 mm；可从 Thermo Fisher Scientific, Inc. 购买 |
| 真空泵 | Mountain | MTN8407 | 用于 PDMS 脱气；供应商： Ryder System, Inc. |
| 真空腔室 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5311-0250 | Nalgene™ 透明聚碳酸酯；可从 Thermo Fisher Scientific, Inc. 购买 |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| 手持放大镜 | Mitutoyo | 183-131 | 反向使用以实现约 15" 处的观察。 |
| 乙醇 | CAROLINA | 861283 | 用于芯片清洗。使用超纯水稀释至 70%。 |
| 水纯化系统 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | D11901 | 可直接从 Thermo Fisher Scientific, Inc. 购买 |
| 光学机械平移台 | Thorlabs | K6X | 六轴运动学光学支架；该产品已停产；Thorlabs 提供新型号（K6XS） |
| 笔记本电脑 | Hewlett-Packard | VP209AV | 运行 Windows 7 系统的 HP Pavilion 笔记本电脑 |
| 笔记本电脑托盘（弹簧加载） | National Products, INC. | RAM-234-3 | RAM Tough-Tray™。可容纳 10 至 16 英寸宽的笔记本电脑。 |
| USB 分线器 | Connectland Technology Limited | 3401167 | |
| USB 数据采集卡（8 个模拟输入，12 个数字 I/O） | National Instruments | NI USB-6008 | 12 位，10 kS/s 低成本多功能数据采集卡 |
| USB 数据采集卡（16 个模拟输入，32 个数字 I/O） | National Instruments | NI USB-6216 | 16 位，400 kS/s 隔离 M 系列多功能 I/O 数据采集卡，总线供电 |
| 控制/采集软件 | National Instruments | LabVIEW 2009 | 定制编写的 National Instruments (NI) LabVIEW |
| 三维实体建模软件 | Dassault Systèmes SolidWorks Corp. | SolidWorks 2011 | |
| 二维建模软件 | AUTODESK | AutoCAD LT 2008 | |
| 垂直设备机架 | (NASA 提供) | N/A | |
| 实心铝制光学面包板 | Thorlabs | MB2424 | 24" x 24" x 1/2"，1/4"-20 螺纹孔；可直接从 Thorlabs 购买 |
| 工业级钢质环氧胶及硬化剂 | The J-B Weld Company | J-B Weld 钢增强型环氧胶 | |
| 微量血细胞比容毛细管 | Fisher Scientific | 22-362-574 | 内径 1.1 至 1.2 mm |
| 1 ml 注射器 | Henke-Sass, Wolf | 4010.200V0 | NORM-JECT®；供应商：Grainger, Inc. |
| 人红细胞 | Innovative Research | IPLA-WB3 | 经供应商检测，对以下项目呈阴性：HBsAg、HCV、HIV-1、HIV-2、HIV-1Ag 或 HIV 1-NAT、ALT 以及梅毒（采用 FDA 批准的方法）。 由于任何检测方法均无法 100% 确保无感染性病原体存在，因此人源性产品应按照美国卫生与公共服务部《微生物和生物医学实验室生物安全手册》中关于潜在感染性人血清或血液标本的建议进行处理 |
| 磷酸盐缓冲液浓缩液 | P5493 | SIGMA | 10x；稀释至 1x |
| 吐温 | P9416 | SIGMA | TWEEN® 20 |
| 离心机 | LW Scientific | STRAIGHT8-5K | 8 位摆动转子离心机。 可通过授权经销商购买。 其他型号离心机可直接从 LW Scientific 购买。 |
| 高清视频记录仪 | Sony | MHS-CM5 | |
| 橙色荧光核酸染料 | Invitrogen | S-11364 | SYTO® 83 橙色荧光核酸染料。 溶于 DMSO 溶剂中储存。始终佩戴推荐的个人防护装备。无需特殊处理 建议。 |
| 荧光计数微球 | Invitrogen | MP 36950 | CountBright™ 绝对计数微球。 始终佩戴推荐的个人防护装备。无需特殊处理建议。 |
参考文献
- Thomas, R. A., Krishan, A., Robinson, D. M., Sams, C., Costa, F. NASA/American Cancer Society High-Resolution Flow Cytometry Project-I. Cytometry. 43, 2-11 (2001).
- Wen, J., Krishan, A., Thomas, R. A.
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