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一种用于从水中浓缩病毒的小体积方法

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DOI：

10.3791/51744

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2015年2月3日

 , 
1U.S. EPA

本文内容

摘要

本研究建立了一种利用人腺病毒加标来确定小体积水样中最佳病毒浓度条件的方法。文中所述技术可用于确定其他病毒目标物的浓缩参数，并可应用于大规模病毒浓缩实验。

摘要

小规模病毒浓缩（样品体积为1–10 L，此处以加标100 ml水样模拟）是一种高效且经济的方法，可用于确定病毒浓缩的最佳参数。可通过过滤法（正电性、负电性、玻璃棉或尺寸排阻）从水中浓缩病毒，随后使用牛肉提取液进行二级浓缩以将病毒从滤膜表面洗脱，最终获得5–30 ml体积的病毒浓缩液。为确定最佳浓缩流程，本研究评估了两种不同的正电性滤膜（玻璃/纤维素滤膜[1MDS]和纳米氧化铝/玻璃滤膜[NanoCeram]）以及不同的二级浓缩技术；其中对硅藻土法进行了评估，比较了三种不同粒径的硅藻土颗粒（细、中、粗），并进一步将该方法与成熟的有机絮凝法进行对比。此外，还评估了多种洗脱添加剂在增强腺病毒（AdV）颗粒从滤膜表面释放方面的效果。当在二级浓缩过程中加入病毒样本时，细颗粒硅藻土回收的AdV40和AdV41水平与成熟的有机絮凝法相当。与纳米氧化铝/玻璃纤维滤膜相比，玻璃/纤维素滤膜对AdV40和AdV41的回收率更高。尽管差异无统计学意义，但与未修饰的牛肉提取液相比，添加0.1%焦磷酸钠的牛肉提取液洗脱液可多回收10%的AdV颗粒。

引言

人类肠道病毒是水源性疾病的重要致病因子1-3，但在受污染的环境水体中通常浓度较低，若不经过浓缩则难以检测。用于病毒浓缩的常规方法通常包括过滤步骤，随后进行滤膜洗脱，以及对洗脱液的二次浓缩。一种常见的过滤方法依赖于带电膜的使用，例如带正电荷的滤膜（近期已有综述4,5）。这类滤膜通过滤膜表面（带正电荷）与目标病毒颗粒（带负电荷）之间的静电相互作用来捕获水中悬浮的病毒。目前市面上有两种基于该技术的带正电荷滤膜，分别为玻璃/纤维素滤膜和纳米氧化铝/玻璃纤维滤膜。玻璃/纤维素滤膜的成本最高可达纳米氧化铝/玻璃纤维滤膜的10倍，这限制了其在常规病毒监测中的应用。近期研究表明，这两种滤膜在从环境水中回收肠道病毒方面的效果差异微小6,7，因此使用成本更低的替代滤膜是合理的。其他滤膜选项（如带负电荷滤膜和玻璃棉滤膜）也已被研究，但前者需要对源水进行预处理（带负电荷滤膜），而后者则尚未商业化（玻璃棉滤膜）。病毒浓缩方法的开发主要集中在优化初级浓缩技术（即滤膜）以提高病毒从水中的回收率。然而，二次浓缩步骤（通常将洗脱液体积从1 L减少至毫升级别）同样对病毒回收率具有显著影响8。

肠道病毒的二次浓缩通常依赖于絮凝剂，例如某些类型的牛肉提取物（有机絮凝）或脱脂乳絮凝9-12，以从滤膜表面回收病毒颗粒。最近，另一种结合使用牛肉提取物和硅藻土（细颗粒）的二次浓缩方法在腺病毒、肠道病毒和诺如病毒的回....

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方案

1. 玻璃器皿和滤器外壳的准备

  1. 除非另有说明，所有玻璃器皿、滤器外壳和溶液均在 121 °C 下灭菌 15 分钟。为确保无菌，灭菌前使用铝箔或胶带固定的纸张覆盖所有开口或暴露表面。
  2. 将滤器外壳（47 mm 直径）连接至 1 L 侧臂锥形瓶，组装过滤装置。准备所需的滤膜：47 mm 直径的正电/负电圆盘滤膜。
  3. 通过将 15 g 牛肉浸膏溶解于 1 L 去离子水中，并加入 3.75 g 甘氨酸，配制 1 L 含 0.05 M 甘氨酸的 1.5% 牛肉浸膏溶液（絮凝型：当溶液 pH 降至 3.5 时产生絮状颗粒；非絮凝型：在 pH 3.5 时不发生聚集）。
    注：非絮凝型牛肉浸膏在三级浓缩前需添加硅藻土。
  4. 向牛肉浸膏中加入终浓度为 0.1% 的洗脱添加剂六偏磷酸钠。
  5. 逐滴加入 1 M 盐酸溶液，调节混合牛肉浸膏溶液至所需 pH 值。将牛肉浸膏溶液在 121 °C 下高压灭菌 15–30 分钟。
  6. 称取 0.1 g 细、中或粗颗粒硅藻土（仅用于非絮凝型牛肉浸膏）。
  7. 将合适的导管连接至锥形瓶侧臂和真空出口，建立真空/抽吸系统。

2. 溶液与病毒原液的制备

  1. 配制1升1 M HCl。
    2. ....

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结果

Celite 的选择

在选定表现最佳的变体之前，测试了三种不同类型的硅藻土。使用颗粒较细至中等的硅藻土可获得最高的腺病毒回收率。使用较大颗粒的硅藻土则导致AdV40和AdV41的回收率降低（范围为32%–100%）（图1）。腺病毒40型的平均回收率分别为：细颗粒硅藻土144% ± 52%，中等颗粒硅藻土115% ± 28%，大颗粒硅藻土82% ± 53%；AdV41的回收率分别为：细颗粒硅藻土132% ± 39%，中等颗粒硅藻土83% ± 25%，大颗粒硅藻土50% ± 11%。单因素方差分析表明，优化后的硅藻土技术回收AdV40（P = 0.7920）和AdV41（P = 0.1439）的水平与有机絮凝法无统计学差异，后者回收率分别为75% ± 19%和109% ± 16%。图1展示了不同二次浓缩技术之间以及AdV类型之间的差异。

滤膜类型评估

采用褶皱玻璃/纤维素滤.......

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讨论

带正电荷的滤膜可用于浓缩水中的病毒；然而，这些滤膜在结构和组成上可能存在差异，进而影响其浓缩效果。更为复杂的是，不同病毒株的衣壳结构和电荷各不相同，因此需要针对特定病毒优化浓缩方法以确保最佳回收率15。通过对现有浓缩技术（例如，带正电荷滤膜、牛肉提取物洗脱）进行简单改进，可更有效地浓缩目标病毒16,17。

迄今为止，相关研究通常集中于通过改进初始浓缩（滤膜）步骤来提高病毒回收率，但对后续的浓缩步骤关注较少，而这些步骤同样可能影响病毒的回收效率18。已有研究表明，不同的二级浓缩技术会影响病毒的回收率6,13,19,20。从多种基质中回收病毒的效果来看，硅藻土浓缩法与其他二级浓缩方法相比具有相似的回收水平8,14，同时其样品处理过程更加快速简便。

由于外层衣壳结构不同，某些病毒可能会在滤膜基质中发生物理滞留21，因此需要评估不同添加剂对滤膜洗脱方案的影响。例如，在初次浓缩过程中，添加.......

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披露

不存在竞争性财务利益。

本文所表达的观点仅为作者个人观点，不一定反映美国环境保护局的观点或政策。提及商品名称或商业产品并不构成对该产品使用之认可或推荐。

致谢

我们感谢 Nicholas J. Ashbolt 博士和 G. Shay Fout 博士对本文手稿的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺病毒40型毒株ATCCVR-931
腺病毒41型毒株ATCCVR-930
硫代硫酸钠Fluka Chemical Co.72051
Celites #577Fluka Chemical Co.22142
NanoCeram 47 mmArgonideN/A
1MDS 47 mm3M6408502
AP-20 预过滤器 47 mmMillipore Corp.AP2004700
甘氨酸 Sigma50046-1KG
聚磷酸钠Acros Organics390930010
胰蛋白酶Gibco25200
PBSSigmaP5368
盐酸FisherA481-212
BBL 牛肉提取物BD Biosciences212303
Difco 牛肉提取物BD Biosciences211520
ABI 7900 实时荧光定量 PCR 系统ABIN/A
不锈钢滤器外壳Millipore Corp.XX2004720
血液DNA提取试剂盒Qiagen 51104
EPA MPN 计算器http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html

参考文献

  1. Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
  2. WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
  3. Westrell, T., et al.

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