一种用于从水中浓缩病毒的小体积方法

摘要

本研究建立了一种利用人腺病毒加标来确定小体积水样中最佳病毒浓度条件的方法。文中所述技术可用于确定其他病毒目标物的浓缩参数，并可应用于大规模病毒浓缩实验。

摘要

小规模病毒浓缩（样品体积为1–10 L，此处以加标100 ml水样模拟）是一种高效且经济的方法，可用于确定病毒浓缩的最佳参数。可通过过滤法（正电性、负电性、玻璃棉或尺寸排阻）从水中浓缩病毒，随后使用牛肉提取液进行二级浓缩以将病毒从滤膜表面洗脱，最终获得5–30 ml体积的病毒浓缩液。为确定最佳浓缩流程，本研究评估了两种不同的正电性滤膜（玻璃/纤维素滤膜[1MDS]和纳米氧化铝/玻璃滤膜[NanoCeram]）以及不同的二级浓缩技术；其中对硅藻土法进行了评估，比较了三种不同粒径的硅藻土颗粒（细、中、粗），并进一步将该方法与成熟的有机絮凝法进行对比。此外，还评估了多种洗脱添加剂在增强腺病毒（AdV）颗粒从滤膜表面释放方面的效果。当在二级浓缩过程中加入病毒样本时，细颗粒硅藻土回收的AdV40和AdV41水平与成熟的有机絮凝法相当。与纳米氧化铝/玻璃纤维滤膜相比，玻璃/纤维素滤膜对AdV40和AdV41的回收率更高。尽管差异无统计学意义，但与未修饰的牛肉提取液相比，添加0.1%焦磷酸钠的牛肉提取液洗脱液可多回收10%的AdV颗粒。

引言

人类肠道病毒是水源性疾病的重要致病因子^1-3，但在受污染的环境水体中通常浓度较低，若不经过浓缩则难以检测。用于病毒浓缩的常规方法通常包括过滤步骤，随后进行滤膜洗脱，以及对洗脱液的二次浓缩。一种常见的过滤方法依赖于带电膜的使用，例如带正电荷的滤膜（近期已有综述^4,5）。这类滤膜通过滤膜表面（带正电荷）与目标病毒颗粒（带负电荷）之间的静电相互作用来捕获水中悬浮的病毒。目前市面上有两种基于该技术的带正电荷滤膜，分别为玻璃/纤维素滤膜和纳米氧化铝/玻璃纤维滤膜。玻璃/纤维素滤膜的成本最高可达纳米氧化铝/玻璃纤维滤膜的10倍，这限制了其在常规病毒监测中的应用。近期研究表明，这两种滤膜在从环境水中回收肠道病毒方面的效果差异微小^6,7，因此使用成本更低的替代滤膜是合理的。其他滤膜选项（如带负电荷滤膜和玻璃棉滤膜）也已被研究，但前者需要对源水进行预处理（带负电荷滤膜），而后者则尚未商业化（玻璃棉滤膜）。病毒浓缩方法的开发主要集中在优化初级浓缩技术（即滤膜）以提高病毒从水中的回收率。然而，二次浓缩步骤（通常将洗脱液体积从1 L减少至毫升级别）同样对病毒回收率具有显著影响⁸。

肠道病毒的二次浓缩通常依赖于絮凝剂，例如某些类型的牛肉提取物（有机絮凝）或脱脂乳絮凝^9-12，以从滤膜表面回收病毒颗粒。最近，另一种结合使用牛肉提取物和硅藻土（细颗粒）的二次浓缩方法在腺病毒、肠道病毒和诺如病毒的回收中显示出良好前景^8,13,14。硅藻土浓缩的原理与有机絮凝法相似，即通过调节悬浮液的pH值，使病毒颗粒附着于颗粒物（絮状物或硅藻土）并随后从其上解离。这两种二次浓缩技术在 spiked 腺病毒（AdV）40型和41型的回收效率方面已有比较评估⁸。该研究得出结论：两种二次浓缩技术在腺病毒回收率方面在统计学上无显著差异。然而，有机絮凝法需要在pH 3.5条件下孵育30分钟，而硅藻土法仅需在pH 4.0条件下孵育10分钟。此外，有机絮凝法在三级浓缩过程中需要使用昂贵的实验设备（如离心机）来收集絮状物，而硅藻土法则仅需使用基础实验设备（如真空过滤装置）即可将硅藻土颗粒从悬浮液中分离。

某些滤膜与二次洗脱技术的组合也可能影响病毒的回收率。一项研究得出结论，初级浓缩技术（带正电荷滤膜）与二次浓缩技术（硅藻土法或有机絮凝法）的特定组合对腺病毒的回收率具有显著影响¹³。这些发现表明，在使用这些技术时，为从特定水样基质中最佳地回收目标病毒，有必要进行优化。优化过程耗时且繁琐，许多研究人员倾向于避免，因为需要评估的变量众多（滤膜类型/品牌、洗脱液pH值、硅藻土法/有机絮凝法）。

本研究建立了一种利用加标的人腺病毒40型和41型从水中浓缩病毒的优化条件鉴定方法。由于每种病毒类型具有独特的衣壳形态和特定的衣壳电荷，因此可能需要针对每种目标病毒优化浓缩方案，以实现最佳的病毒回收率。本研究针对腺病毒40型和41型的浓缩提供了以下研究方案：1）采用带正电荷的滤膜圆盘评估自来水中病毒的回收效率；2）比较已有的有机絮凝法与硅藻土（celite）技术作为二次浓缩方法的效果；3）评估不同洗脱缓冲液在三级浓缩中的表现。

方案

1. 玻璃器皿和滤器外壳的准备

1. 除非另有说明，所有玻璃器皿、滤器外壳和溶液均在 121 °C 下灭菌 15 分钟。为确保无菌，灭菌前使用铝箔或胶带固定的纸张覆盖所有开口或暴露表面。
2. 将滤器外壳（47 mm 直径）连接至 1 L 侧臂锥形瓶，组装过滤装置。准备所需的滤膜：47 mm 直径的正电/负电圆盘滤膜。
3. 通过将 15 g 牛肉浸膏溶解于 1 L 去离子水中，并加入 3.75 g 甘氨酸，配制 1 L 含 0.05 M 甘氨酸的 1.5% 牛肉浸膏溶液（絮凝型：当溶液 pH 降至 3.5 时产生絮状颗粒；非絮凝型：在 pH 3.5 时不发生聚集）。
   注：非絮凝型牛肉浸膏在三级浓缩前需添加硅藻土。
4. 向牛肉浸膏中加入终浓度为 0.1% 的洗脱添加剂六偏磷酸钠。
5. 逐滴加入 1 M 盐酸溶液，调节混合牛肉浸膏溶液至所需 pH 值。将牛肉浸膏溶液在 121 °C 下高压灭菌 15–30 分钟。
6. 称取 0.1 g 细、中或粗颗粒硅藻土（仅用于非絮凝型牛肉浸膏）。
7. 将合适的导管连接至锥形瓶侧臂和真空出口，建立真空/抽吸系统。

2. 溶液与病毒原液的制备

1. 配制1升1 M HCl。
2. 配制1升1 M NaOH溶液。
3. 配制1× PBS溶液（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.47 mM KH₂PO₄，10 mM Na₂HPO₄，pH 7.4）₂PO₄，以及 4.3 mM NaH₂PO₄).
   1. 使用 1 M NaOH 将 1x PBS 的 pH 值调节至 9.0。
4. 制备并稀释病毒原液至10⁴-10⁵ 最可能数（MPN）/ml^-1 通过将1 ml病毒储备液与9 ml PBS（pH 7）混合，具体方法如前所述 ^8,13-80 °C下以1 ml分装保存。
   1. 使用注射器滤器（0.22 μm 孔径）对病毒原液进行过滤除菌，以去除潜在污染物。
5. 去氯自来水
   1. 使用无菌量筒量取1 L无菌自来水，倒入含有磁力搅拌子的2 L烧杯中。
   2. 加入0.7 g硫代硫酸钠，搅拌至颗粒完全溶解。如有需要，用1 M HCl或1 M NaOH溶液将自来水的pH值调节至7–7.5。
   3. 解冻病毒加标液（1 ml），并将全部体积的加标液加入1 L去氯的无菌自来水中，混匀10分钟。
   4. 每次实验时制备一个方法空白样（不含腺病毒的脱氯自来水），并以与加标样品相同的方式进行处理。

3. 混合纤维素酯滤膜装置的准备

1. 移除滤器外壳上的无菌覆盖物。确保滤器外壳上部杯体与下部滤网之间安装紧密，以防止过滤过程中样品泄漏。
2. 移除1 L锥形瓶的无菌覆盖物。确保滤器的塞子紧密地插入锥形瓶顶部开口，形成良好的密封。
3. 将滤器上部杯体从下部滤网处取下，使用无菌镊子将47 mm正电荷滤膜平整地放置在滤网上。将滤器杯体与底部滤网对接，并逆时针旋转拧紧固定。

4. 自来水过滤（初步浓缩）

1. 使用无菌量筒量取 100 ml 含病毒的自来水。
2. 将 100 ml 含病毒的自来水倒入滤器装置中，装置内装有 47 mm 折叠玻璃/纤维素滤膜或纳米氧化铝/玻璃纤维圆盘滤膜。
3. 让水缓慢通过滤膜。施加轻微真空以去除滤膜表面残留的自来水。
4. 若采用胰蛋白酶处理，向滤膜表面加入 5 ml 0.25% 胰蛋白酶，并孵育 5 分钟。
5. 使用 50 ml 无菌去离子水冲洗滤膜表面，去除胰蛋白酶。

5. 滤膜上病毒的洗脱

1. 从2 L锥形瓶上取下滤器外壳，并将其安装到250 ml抽滤瓶上。
2. 使用量筒量取100 ml牛肉浸膏，缓慢将100 ml牛肉浸膏倒入滤器外壳中。
3. 让牛肉浸膏自然流过滤膜，用小号（250 ml）锥形瓶收集滤出液。施加真空以抽滤残留的牛肉浸膏。

6. 硅藻土二次浓缩

1. 将含有洗脱病毒的烧瓶转移至搅拌器上，加入无菌磁力搅拌子并置于搅拌器上，搅拌形成轻微涡流。
2. 将 0.1 g 硅藻土粉末加入 100 ml 牛肉浸出液中，使硅藻土充分分散。将无菌 pH 探针插入牛肉浸出液中。
3. 逐滴加入 1 M HCl 至牛肉浸出液中，调节 pH 至 4.0。缓慢搅拌 10 分钟。
4. 使用 2 L 锥形瓶，将 47 mm 预过滤膜安装到过滤装置中（如前所述）。
5. 将 100 ml 牛肉浸出液/硅藻土混合物倒入预过滤膜上，让牛肉浸出液自然滤过。施加轻微真空以抽滤残留的牛肉浸出液。
6. 在过滤装置出口端安装金属管夹，将无菌 15 ml 聚丙烯收集管连接至金属管夹上，并将过滤装置重新放回锥形瓶中。
7. 在预过滤膜上收集的硅藻土上加入 5 ml pH 9.0 的 1×PBS 缓冲液。
8. 让 PBS 缓冲液滴过预过滤膜。施加轻微真空，将残留的 PBS 抽入 15 ml 收集管中。

7. 有机絮凝二次浓缩

1. 将装有洗脱病毒的烧杯置于搅拌器上。向100 ml牛肉提取液中加入无菌磁力搅拌子，搅拌形成轻微涡流。
2. 将无菌pH探针放入牛肉提取液中。
3. 逐滴加入1 M HCl，调节牛肉提取液的pH至3.5。混合30分钟。
4. 将洗脱液倒入250 ml离心管中，在4 ºC下以2,500 x g离心15分钟。
5. 小心倾去上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于5 ml pH 9的1x PBS中。
6. 在4 ºC下以4,000 x g离心10分钟。倾去上清液，弃去沉淀。
7. 将pH调至7–7.5，通过0.22 µm注射式滤器过滤除菌，并在-80 °C下冷冻保存。

8. 病毒核酸提取

1. 根据制造商说明书，使用合适的商业试剂盒提取病毒核酸。

9. AdV 40/41 定量PCR

1. 使用已发表文献中的引物和探针，以及反应体系和热循环程序 ^8,13。
   注意：该检测方法的估计检测下限约为每反应5个qPCR单位。
2. 按以下浓度加入PCR扩增反应体系的各组分：10 mM Tris（pH 8.3）、50 mM KCl、4.5 mM MgCl₂、10 mM dNTPs、10 µM 引物、1 µM 探针以及0.5 µl 聚合酶，使最终体积为45 µl，并加入96孔PCR反应板中相应数量的孔内。
3. 将45 µl PCR扩增混合液加入96孔快速反应PCR板的相应孔中。
4. 向PCR板的相应孔中加入5 µl 提取的DNA样本。
5. 用耐热封膜覆盖PCR板，并短暂离心，使管壁上的液滴沉降至PCR板孔底部。
6. 设置PCR扩增循环程序如下：95 °C 预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环为95 °C 变性15秒，60 °C 退火延伸1分钟。

10. 数据分析

1. 分析样品在1:5至1:625稀释范围内进行的三份平行五倍系列稀释的测量结果，以确定病毒颗粒的最可能数（MPN），方法如前所述。 ^8,13.
2. 分析腺病毒实验性加标样品的连续5倍稀释液，稀释范围从1:5至1:15,625，以确定病毒颗粒的最可能数（MPN）。
3. 使用美国环保局MPN计算器（http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html），根据稀释类型（1:5 或 1:10）、进行的稀释梯度数以及稀释系列中重复样本的数量，调整计算器设置。
4. 执行对数₁₀ 数据转换，随后归一化至单位体积例如，1 ml，100 ml， 等等。）。通过将样本浓缩物中的病毒颗粒数量除以实验加标中病毒颗粒的数量，计算给定实验的回收率。
5. 评估不同实验变量的影响（例如， 不同硅藻土类型、pH 范围、不同滤膜类型以及不同二次浓缩技术）对腺病毒回收率的影响，通过进行参数或非参数统计检验例如，根据数据分布情况和实验设计选择适当的统计方法（如配对t检验、单因素或双因素方差分析）。

结果

Celite 的选择

在选定表现最佳的变体之前，测试了三种不同类型的硅藻土。使用颗粒较细至中等的硅藻土可获得最高的腺病毒回收率。使用较大颗粒的硅藻土则导致AdV40和AdV41的回收率降低（范围为32%–100%）（图1）。腺病毒40型的平均回收率分别为：细颗粒硅藻土144% ± 52%，中等颗粒硅藻土115% ± 28%，大颗粒硅藻土82% ± 53%；AdV41的回收率分别为：细颗粒硅藻土132% ± 39%，中等颗粒硅藻土83% ± 25%，大颗粒硅藻土50% ± 11%。单因素方差分析表明，优化后的硅藻土技术回收AdV40（P = 0.7920）和AdV41（P = 0.1439）的水平与有机絮凝法无统计学差异，后者回收率分别为75% ± 19%和109% ± 16%。图1展示了不同二次浓缩技术之间以及AdV类型之间的差异。

滤膜类型评估

采用褶皱玻璃/纤维素滤...

讨论

带正电荷的滤膜可用于浓缩水中的病毒；然而，这些滤膜在结构和组成上可能存在差异，进而影响其浓缩效果。更为复杂的是，不同病毒株的衣壳结构和电荷各不相同，因此需要针对特定病毒优化浓缩方法以确保最佳回收率¹⁵。通过对现有浓缩技术（例如，带正电荷滤膜、牛肉提取物洗脱）进行简单改进，可更有效地浓缩目标病毒^16,17。

迄今为止，相关研究通常集中于通过改进初始浓缩（滤膜）步骤来提高病毒回收率，但对后续的浓缩步骤关注较少，而这些步骤同样可能影响病毒的回收效率¹⁸。已有研究表明，不同的二级浓缩技术会影响病毒的回收率^6,13,19,20。从多种基质中回收病毒的效果来看，硅藻土浓缩法与其他二级浓缩方法相比具有相似的回收水平^8,14，同时其样品处理过程更加快速简便。

由于外层衣壳结构不同，某些病毒可能会在滤膜基质中发生物理滞留²¹，因此需要评估不同添加剂对滤膜洗脱方案的影响。例如，在初次浓缩过程中，添加...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺病毒40型毒株	ATCC	VR-931
腺病毒41型毒株	ATCC	VR-930
硫代硫酸钠	Fluka Chemical Co.	72051
Celites #577	Fluka Chemical Co.	22142
NanoCeram 47 mm	Argonide	N/A
1MDS 47 mm	3M	6408502
AP-20 预过滤器 47 mm	Millipore Corp.	AP2004700
甘氨酸	Sigma	50046-1KG
聚磷酸钠	Acros Organics	390930010
胰蛋白酶	Gibco	25200
PBS	Sigma	P5368
盐酸	Fisher	A481-212
BBL 牛肉提取物	BD Biosciences	212303
Difco 牛肉提取物	BD Biosciences	211520
ABI 7900 实时荧光定量 PCR 系统	ABI	N/A
不锈钢滤器外壳	Millipore Corp.	XX2004720
血液DNA提取试剂盒	Qiagen	51104
EPA MPN 计算器			http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html