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酵母内体系统的纳米金标记用于超微结构分析

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DOI：

10.3791/51752

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2014年7月14日

 ,  , 
1Department of Cell Biology, University Medical Center Utrecht

本文内容

摘要

酵母（Saccharomyces cerevisiae）一直是用于鉴定和研究调控内体系统生物发生及功能相关基因的关键模式生物。本文介绍了一种用于超微结构研究的内体区室特异性标记的详细实验方案。

摘要

内体是真核细胞中主要的膜分选检查点之一，主要调控来自质膜和高尔基体蛋白质的再循环或降解。因此，内体系统在维持细胞稳态中发挥着核心作用；参与这一由囊泡运输相互连接的细胞器网络的基因若发生突变，会导致包括癌症和神经生物学障碍在内的严重病理状况。因此，理解内体系统生物发生及其组织机制具有重要意义。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在此研究中发挥了关键作用。为了在超微结构水平上特异性地标记并分析该模式生物的内体系统，本文提供了一种详细的实验方案：通过原生质球摄取带正电荷的纳米金颗粒，随后利用银增强反应对这些颗粒进行可视化。该方法也是研究内体运输缺陷突变体形态学特征的有力工具。此外，该技术不仅适用于超微结构观察，还可与免疫胶体金标记结合，用于蛋白质定位分析。

引言

内体系统是一种主要的膜分选装置，在细胞中发挥多种关键作用，包括溶酶体酶分选受体的运输以及质膜（PM）受体的再循环1,2内体分为三个不同的区室， 即早期内体（EE）、晚期内体（LE）和回收内体。这种分类基于内吞物质到达这些区室所需的时间、特定的标志蛋白以及它们的形态特征。膜 即 蛋白质和脂质双层膜从质膜内吞后，可经由内体递送至溶酶体进行降解，或被回收返回。膜结构也可从高尔基体运输至内体，并同样地继续转运至溶酶体或被回收返回高尔基体。此外，蛋白质可被分选至由内体限界膜向内出芽形成的腔内小泡，该过程导致晚期内体的一个亚类——多泡体的形成。

酵母的内体系统相较于高等真核细胞而言相对简单。酵母的内体分为早期内体（EE）和晚期内体（LE）。与哺乳动物细胞不同，酵母细胞不含循环内体，也不含有组织特异性的溶酶体相关细胞器，因此其内体运输途径的网络结构较为简单3,4。正因如此，酵母长期以来一直是研究内体系统中膜运输基本机制的有利实验体系，并且至今仍具有这一优势。这一优势还体现在许多参与内体通路的基因最初正是通过在酵母中进行遗传筛选而被分离鉴定出来的5。 尽管野生型和突变型酵母细胞的内体系统已通过生化分析和荧光显微镜技术得到了广泛研究，但在超微结构水平上的研究却极为有限。形态学分析在酵母中尤为重要，因为在荧光显微镜下，大多数内体细胞器表现为点状结构，难以对其进行明确鉴定6。遗憾的是，目前可用于免疫电镜（IEM）样品制备的、能识别酵母内体蛋白标志物的抗血清种类非常有限7-10。对于某些蛋白，该问题已通过目标基因的内源性标签标记以及使用识别该标签的抗体进行检测而得以解决7,11,12。然而，由于表达水平较低，许多蛋白在IEM中仍无法被检测到。过表达这些蛋白并非可行方案，因为这种方法可能导致蛋白错误定位和/或细胞器形态与功能的改变。因此，使用可在电子显微镜（EM）下检测的探针对内吞区室进行标记是一种有效的替代策略。如果该探针能够以时间依赖的方式进入内吞途径，则尤为理想，因为这可以明确其标记特定细胞器的时间点6。

带正电荷的纳米金颗粒被酵母原生质球（即细胞壁已被酶解去除的酵母）摄取的方法已成功用于鉴定酵母的内体区室10。这些颗粒可强烈结合构成生物膜的带负电荷的脂质。因此，带正电荷的纳米金会与质膜（PM）结合，通过内吞作用进入细胞，并依次经过早期内体（EE）和晚期内体（LE），最终到达液泡。然而，这些微小的金颗粒本身尺寸过小，无法通过电子显微镜（EM）直接观察。为了使其可见，可通过化学反应使银或金在金探针周围沉积，从而增大其尺寸13-15。我们已开发并成功应用了一种基于Tokuyasu方法的免疫电子显微镜（IEM）技术，用于开展亚细胞定位研究8,16。该方法可在酵母样品中实现免疫胶体金标记，同时保持优异的形态学分辨率8,17-24。我们还建立了一种将此IEM方案与酵母内体系统区室的纳米金标记相结合的实验流程6。利用该方法，我们对不同亚类的内体进行了形态学表征，并对具有内体运输缺陷的突变体进行了超微结构分析6,25。此外，我们已证明，这种纳米金标记可与免疫胶体金标记联合使用，从而能够探究目标蛋白在不同内体亚群中的分布情况。本文将详细介绍在实践中如何利用带正电荷的纳米金对酵母内体系统进行标记。

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方案

1. 原生质球制备

  1. 根据实验设计，在适当的培养基中于30 °C下将酵母培养过夜。
  2. 次日，使用光度计在600 nm处测定培养物的光密度（OD600）。用相同的培养基将细胞稀释至OD600为0.2–0.4，并使其生长至对数生长期，除非实验设计要求其他条件。当培养物的OD600达到1–2时，细胞即处于对数生长期。
  3. 在50 ml离心管中，以3,500 × g离心5分钟收集相当于10 OD600的细胞。离心后弃去上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于5 ml含100 mM PIPES（pH 9.6）和10 mM二硫苏糖醇的溶液中，于30 °C孵育10分钟。
  5. 再次以3,500 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。
  6. 将细胞重悬于5 ml含有1 M山梨醇和5 mg溶壁酶的培养基中（培养基根据实验设计确定），于30 °C轻轻振荡孵育30分钟。
  7. 将细胞悬液以300 × g离心5分钟，收集沉淀部分，即为原生质球。弃去上清液。
  8. 将原生质球重悬于960 µl含1 M山梨醇的冰冻培养基中（培养基根据实验设计确定），并将混合物转移至预冷的2 ml微量离心管中。

2. 纳米金颗粒的摄取

  1. 使用移液器将原生质球与4 nmol带正电荷的纳米金颗粒轻轻混合，纳米金颗粒重悬于40 µl水中。混合物的终体积必须为1 ml。
  2. 将获得的细胞悬液置于冰上15分钟。
  3. 将悬液转移至室温，并孵育所需时间，以允许纳米金通过内吞作用进入细胞。
    注意：5分钟的摄取时间主要标记内吞囊泡和早期内体区室，而15分钟的摄取时间可标记整个内体系统（早期内体和晚期内体）。更长的孵育时间（超过30分钟）还可标记液泡。
    注意：该方法无法进行脉冲-追踪标记实验。因此，在对晚期内体（LE）进行分析标记时，纳米金也会出现在质膜（PM）和早期内体（eEE）中。

3. 固定与切片

  1. 向细胞悬液中加入1 ml双倍浓度的固定液［含1 M山梨醇的4%多聚甲醛（PFA）、0.4%戊二醛（GA）和0.1 M PHEM缓冲液（20 mM PIPES、50 mM HEPES，pH 6.9、20 mM EGTA、4 mM MgCl2）］以终止纳米金的摄取。将离心管置于室温下。
  2. 在30分钟内手动轻轻翻转微量离心管数次（以保持原生质球处于悬浮状态），然后在1,700 × g下离心两次，每次25秒。
  3. 弃去上清液，加入1 ml含1 M山梨醇的新鲜标准浓度固定液（2% PFA、0.2% GA溶于0.1 M PHEM缓冲液），并在室温下于缓慢旋转的摇床上孵育2小时。
  4. 按照先前所述方法对细胞进行冷冻切片处理6。注意：在进行纳米金摄取和银增强实验时，无需执行所述方案中的过碘酸处理步骤。过碘酸处理用于更好地通透细胞壁26，但在原生质球制备过程中该结构已被去除。
  5. 使用UCT超薄切片机，在-120 °C下用干燥的金刚石刀切割50 nm厚的冷冻超薄切片8，并将切片转移至表面涂有聚乙烯醇-碳膜的50目镍网上。

4. 纳米金颗粒可视化的银增强法

注意：反应混合物的制备步骤基本遵循制造商提供的说明。采用本方案进行实际操作时所做的调整，可使银增强法在冷冻切片上的应用更加有效且可靠。

  1. 从冷冻柜中取出银增强试剂盒，置于37 °C培养箱或水浴中解冻。解冻后，将试剂盒放入置于暗室中的24 °C培养箱中，备用（见4.7）。
  2. 将加热板放置于暗室内，并将其升温至24 °C的最终温度。
  3. 用表面保护膜覆盖加热板顶部，光面朝上，并用胶带固定。
  4. 将Parafilm置于Benchkote上，并用黑色记号笔标记其边缘，以便在黑暗中能够看清Parafilm的边界。
  5. 将温度计粘贴在Benchkote顶部，以监测加热板的温度。若温度未达24 °C，需逐步调节至设定值。
  6. 将装有双蒸水的50 ml离心管及银增强试剂盒一并放入暗室中。
  7. 用预热至37 °C的双蒸水填充小型培养皿。将载网放入水中，样品面朝下，孵育30分钟。
  8. 重复步骤4.7一次。
  9. 将载网转移至储存盒中，并带入暗室。
  10. 再次清洗载网：将其（样品面朝下）依次通过固定在加热板上的Parafilm表面的数滴24 °C双蒸水进行漂洗。
  11. 确保Parafilm上已准备好另外9滴24 °C的双蒸水，用于银增强反应后的漂洗步骤。
  12. 关闭所有光源，确保室内完全黑暗，然后打开红光灯。
  13. 从24 °C培养箱中取出银增强试剂盒的A液和B液。
  14. 先在1.5 ml微量离心管中加入6滴A液，再加入6滴B液，使用玻璃巴斯德吸管充分混匀，避免产生气泡。该溶液较为黏稠，需先手动用吸管混合，最后短暂涡旋混匀。
  15. 将A液和B液放回24 °C培养箱，取出C液。
  16. 向A/B混合液中加入6滴C液，先用巴斯德吸管混匀，再短暂涡旋，注意避免产生气泡。
  17. 立即使用最终混合液，将其以约20 µl/滴的量滴加在Parafilm上。
  18. 使用洁净的抗磁镊子将载网置于混合液滴上（e.g.，银增强反应），根据所需增强效果（i.e. 金颗粒的大小）孵育6至15分钟。
  19. 将载网从混合液中取出，依次通过24 °C的双蒸水滴进行漂洗。首先快速连续通过6滴，随后在3滴中各孵育7分钟，之后再打开室内光源。
  20. 进行下一步操作，即免疫金标记或膜染色27，以便通过电子显微镜观察结果。

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结果

根据本实验方案，可通过透射电子显微镜观察酵母内体系统的形态。图1展示了已进入并因此被纳米金标记的不同类型的内体区室。经银增强的纳米金颗粒清晰可见，表现为电子致密颗粒。本实验所建立的银增强反应最佳条件，可使金颗粒保持均匀的粒径范围（5–15 nm），且不会干扰酵母细胞的超微结构。在24 °C孵育5分钟后，纳米金可标记质膜以及早期内体区室（图1A）；而在至少30分钟的摄取后，纳米金可到达晚期内体（在本例中为多泡体）（图1B）。本研究所采用的免疫电镜技术8与所述纳米金/银增强方案相结合，展现出优异的分辨率，这体现在所显示细胞器形态的良好保存与高质量，尤其是多泡体内囊泡的清晰结构（图1B）。

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讨论

免疫电镜技术能够将蛋白质的定位与这些蛋白质所处的载体和细胞器的超微结构分辨率相结合。在研究酵母内体系统时，这一技术尤为重要，因为其区室在荧光显微镜下呈现为点状结构，因此难以区分。基于此，使用一种可被电镜检测、并能以时间依赖方式进入内吞途径的探针，对于特异性标记不同内体至关重要。此类探针可用于评估内吞作用的功能性6，同时也是缺乏可识别蛋白标志物的抗血清时的一种有效替代方法。

本文所述方法利用带正电荷的纳米金作为探针标记内体区室。尽管冷冻切片需要特殊的设备和技能，但本方案在技术上较为简便，无需特殊仪器，因此任何希望将其用于研究的实验室均可采用。然而，在该实验的关键步骤——银增强反应过程中，必须采取一些预防措施。该反应对光极为敏感，因此实验室内所有光源（除红光外）均需关闭或遮蔽。与其他化学反应一样，银增强反应的速度受温度影响。为了在相同参数下获得一致且可重复的结果，所有溶液和工具必须在24 °C下仔细预孵育。准确确定在常规进行该反应的实验室内银增强的孵育时间至关重要。纳米金的扩增时间必须足够长，以便通过电镜直观检测到金颗粒，同时又必须足够短，以避免产生过大的颗粒而掩...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 René Scriwanek 在图表制备过程中提供的帮助。F.R. 的研究得到了 ECHO（700.59.003）、ALW 开放项目（821.02.017 和 822.02.014）、DFG-NWO 合作项目（DN82-303）以及 ZonMW VICI（016.130.606）基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PIPES（哌嗪-1,4-双(2-乙烷磺酸)）默克，德国达姆施塔特1,102,200,250
HEPES默克公司，德国达姆施塔特391,340
EGTASigma，美国密苏里州圣路易斯E4378
MgCl₂2·6H2O默克，达姆施塔特，德国1,058,330,250
DL-二硫苏糖醇Sigma，美国密苏里州圣路易斯市D0632
山梨醇Sigma，美国密苏里州圣路易斯S1876
带正电荷的NanogoldNanoprobes，纽约州雅潘克2022-20 保存 °C
HQ-银™ 增强试剂盒Nanoprobes，纽约州雅潘克2012-20℃保存 °C
多聚甲醛（PFA）Sigma，美国密苏里州圣路易斯市441244
8% 电镜级戊二醛Polyscience, Inc.，沃灵顿，宾夕法尼亚州216-20℃保存 °C
溶菌酶MP Biomedicals，美国加利福尼亚州圣安娜153526-20℃保存 °C
Parafilm MSigma，美国密苏里州圣路易斯市P7793
50目镍网 Agar Scientific，斯坦斯特德，英国G209N
冷冻免疫金刚石刀 35°Diatome AG，比尔，瑞士N.A.
UCT超薄切片机 徕卡，索尔姆斯，德国N.A.
Formvar 15/95 树脂电子显微镜科学公司，宾夕法尼亚州哈特菲尔德15800
50目镍网 Agar Scientific，斯坦斯特德，英国AGG2050N
ParafilmSigma，美国密苏里州圣路易斯市P7793
网格存储盒徕卡，索尔姆斯，德国162-50
Falcon 100 mm × 15 mm 培养皿康宁，纽约州，康宁351029
巴斯德毛细吸管 150 mmVan Bruggen Glas，荷兰鹿特丹10216234
1.5 ml 微量离心管 Sarstedt, Nü德国马布雷希特72690001
50 ml 离心管Bio-one，荷兰阿尔芬阿登莱茵210296
Benchkote表面保护膜沃特曼，英国梅德斯通 1159201

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