光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

摘要

本文介绍了我们在麻醉小鼠皮层中从已鉴定的抑制性中间神经元获取稳定且分离良好的单细胞单位记录的策略。表达ChR2的神经元通过其对蓝光的反应来识别。该方法使用标准的细胞外记录设备，是钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种经济替代方案。

摘要

神经生理学的一个主要挑战是表征大脑皮层中大量抑制性细胞类型的反应特性和功能。 我们在此分享一种策略，该策略采用Lima及其同事开发的方法，用于在麻醉小鼠皮层中对已鉴定的抑制性中间神经元进行稳定且分离良好的单细胞单位记录¹在表达通道视紫红质-2（Channelrhodopsin-2, ChR2）的特定神经元亚群的小鼠中进行记录。通过观察细胞对短暂蓝光闪光的反应来识别该神经元群体中的成员。该技术被称为“PINP”（Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations，光刺激辅助的神经元群体识别），可使用标准的细胞外记录设备实现。该方法可作为钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种经济且易于实施的替代方案，用于将细胞外记录靶向至基因型明确的细胞。本文提供了一套优化该方法在日常实践中应用的指导原则。我们特别针对小清蛋白阳性（parvalbumin-positive, PV+）细胞优化了该策略，但发现该方法同样适用于其他类型的中间神经元，如表达生长抑素（somatostatin-expressing, SOM+）和表达钙视网膜蛋白（calretinin-expressing, CR+）的中间神经元。

引言

表征构成哺乳动物大脑的众多细胞类型一直是神经生理学的核心目标，但长期以来难以实现。例如，大脑皮层中不同抑制性细胞类型的特性与功能备受关注，但目前仍知之甚少。部分原因在于，传统的盲法体内记录技术在区分不同细胞类型方面存在局限性。虽然可通过细胞外动作电位的波宽来区分假定的钙结合蛋白阳性抑制性神经元与兴奋性锥体细胞，但该方法容易产生I型和II型错误^2,3。另一种方法是将记录的神经元进行染料填充、回收并染色，以事后确认其形态学和分子特征，但这一过程费时费力。近年来，通过钙成像或视觉引导的膜片钳记录技术，已可对基因定义的抑制性中间神经元群体进行研究。在这些方法中，通过病毒载体或转基因手段表达钙指示剂（如GCaMP）或荧光蛋白（如GFP），可识别并表征由启动子表达所定义的细胞类型。这些方法依赖双光子显微镜，不仅需要昂贵的设备，而且由于脑组织对光的散射特性，仅限于浅层皮层的成像。

最近，Lima 及其同事¹开发了一种光遗传学的新应用，用于在活体（in vivo）条件下对基因定义的神经元类型进行靶向电生理记录，该方法称为“PINP”（神经元群体的光刺激辅助鉴定，Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations）。该记录在特定神经元亚群表达通道视紫红质-2（Channelrhodopsin-2, ChR2）的小鼠中进行。通过给予短暂的蓝....

方案

注意：以下实验方案遵循美国国立卫生研究院指南，并已获俄勒冈大学动物护理与使用委员会批准。

1. 急诊外科

1. 通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮-美托咪啶混合物使动物麻醉（表1）。
   注意：本实验所用小鼠由cre依赖性ChR2-eYFP转基因品系10与中间神经元驱动品系（Pvalb-iCre11，PV+；Sst-iCre12，SOM+；Cr-iCre12，CR+）杂交获得。若表达水平相似，病毒递送ChR2或相关视蛋白应具有同等效果。
2. 手术开始前，确认动物对轻柔脚趾夹捏无反应。根据需要在实验过程中重复给予麻醉剂，以维持该麻醉深度。若使用注射类麻醉剂，可选择性地植入腹腔导管用于维持给药。
3. 在整个实验过程中，使用生理盐水或乳酸林格液保持动物水合状态（约3 ml/kg/hr），例如通过使用适当稀释的麻醉混合液进行维持注射（表1）。
4. 将动物置于立体定位仪或其他头部固定装置中，确保颅骨牢固固定。这对于维持稳定的单细胞记录至关重要。
5. 在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥，维持体温在36.5–37 °C。
6. 进行小脑延髓池引流以增强记录稳定性。使用手术刀片去除颅骨后部组织，暴露小脑延髓池。在硬脑膜上做一小切口以引流脑脊液。仅使用刀尖操作，避免接触小脑或脑干。
7. 使用手术刀在目标皮层区域上方....

结果

本文介绍了我们采用Lima 等¹开发的光遗传学方法，在麻醉小鼠皮层中对基因型分类的抑制性中间神经元进行单细胞记录的策略。表1列出了推荐的麻醉剂混合配方——氯胺酮-美托咪啶-乙酰丙嗪（“KMA”）。图1展示了一根用于记录的钨微电极的制备状态。图2提供了一个简易LED控制单元的电路图。图3展示了使用Arduino微控制器控制光输出的配置与代码。图4显示了实验方案中讨论的光诱导电学伪迹示例。此类伪迹偶尔会出现（左图），但易于校正（右图）。图5展示了三种光学鉴定的中间神经元（PV+、CR+ 和 SOM+）的记录示例。左图显示了原始电压迹线及对齐的波形，代表了采用该策略可望获得的信噪比水平。通过设定数百微伏的固定电压阈值，可稳定捕获动作电位。点阵图（右图）显示了光诱发反应的短潜伏期和高可靠性，从而可明确鉴定ChR2阳性中间神经元。图6展示了三个PV+中间神经元在1秒光脉冲刺.......

讨论

尽管PINP在概念上很简单，但在实际操作中可能具有挑战性。成功的关键因素之一是电极的选择。电生理记录的监听半径是一个关键参数。该半径必须足够大，以便在电极尖端距离ChR2+细胞尚有一定距离时，仍能检测到光诱发的动作电位，从而可以根据信号调整推进速度。同时，该半径又必须足够小，以实现良好的单细胞单位分离，即电极不应同时记录到邻近ChR2-细胞的放电活动。在监听半径上实现恰当的平衡对于任何靶向细胞类型而言都是一项挑战，而对于抑制性中间神经元尤其如此，因为这类细胞分布稀疏、体积较小，且常常与具有较大细胞外放电信号的锥体细胞紧密相邻。即使采用本文建议的策略，预期的记录成功率也不高。在满足单细胞单位分离质量高且记录时长超过半小时的标准下，我们通常每只动物可获得0–2个PV+神经元。

在PINP抑制性神经元时，双突触（间接）激活并不是主要问题，因为抑制性神经元相对不太可能间接激活突触后细胞。而在PINP兴奋性神经元时，双突触激活较为常见；许多在光照下产生动作电位的神经元并不表达ChR2，而是接受了来自表达ChR2神经元的强效突触兴奋。如何区分直接激活与间接激活的神经元，Lima et .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ChR2-EYFP 品系	Jackson 实验室菌种	12569
Pvalb-iCre (PV) 品系	Jackson 实验室菌种	8069
Sst-iCre (SOM) 品系	Jackson 实验室菌种	13044
Cr-iCre (CR) 品系	Jackson 实验室菌种	10774
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9793	III-A 型，高电渗扩散（High EEO）
微点针（硬脑膜钩）	FST	10066-15
手术剪刀	FST	14084-09
手术刀	FST	10003-12（刀柄），10011-00（刀片）
普拉露比眼科软膏	Foster & Smith	9N-76855
恒温毯	Harvard Apparatus	507220F
钨微电极	A-M Systems	577200	12 MΩ 交流电阻，127 μm 直径，12° 锥形尖端，环氧树脂涂层
毛细玻璃管	Warner Instruments	G150TF-3
热缩管	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit 加速剂	DVA	SKU ZA/ZAA	需与标准瞬干胶配合使用。
微电极交流放大器 1800	AM Systems	700000
MP-285 电动显微操作器	Sutter	MP-285
四通道数字示波器	Tektronix	TDS2000C
有源扬声器	Harman	型号 JBL Duet
手动操作器	Scientifica	LBM-7
800 µm 光纤补丁电缆	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
功率计	ThorLabs	PM100D（功率计），S121C（标准功率传感器）
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED 的功率和效率持续提升，建议查询最新产品（www.cree.com）。
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