锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向

摘要

报告基因细胞系提供了一种在异质性细胞群体中可视化、追踪和分离目标细胞的方法。 然而，利用传统同源重组技术在人胚胎干细胞中进行基因靶向的效率极低。本文中，我们描述了利用锌指核酸酶增强的同源重组技术，将EGFP靶向整合至中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3位点的方法。

摘要

目前人类胚胎干细胞（ESC）分化方案的一个主要局限在于会产生异质性的细胞群体。 这些培养物含有目标细胞，但也混有未分化的胚胎干细胞、非神经系衍生物以及其他神经元亚型。  这限制了它们在 体外 和 体内 应用，例如 体外 用于药物发现或细胞替代治疗的建模。为帮助克服这一挑战，可构建报告细胞系，以实现对目标细胞的可视化、追踪和分离。 然而，通过传统的同源重组方法在人类胚胎干细胞中实现这一目标效率极低。 本方案描述了对 Pituitary homeobox 3 (PITX3利用定制设计的锌指核酸酶在人类胚胎干细胞中对特定基因座进行编辑，该核酸酶可引入位点特异性的DNA双链断裂，并结合一个 PITX3-EGFP特异性的DNA供体质粒。在生成之后 PITX3 报告细胞系，随后可利用已发表的方案进行分化，用于诸如 体外 帕金森病建模或细胞替代治疗

引言

目前的胚胎干细胞（ESC）分化方案会产生异质性的细胞群体，尤其是在获得特定神经元表型方面。  因此，尽管培养物中含有目标细胞表型，但通常也存在其他神经元、非神经元以及未分化的细胞类型¹.  这些特性限制了胚胎干细胞来源的细胞在细胞替代治疗中的应用 体外 疾病建模

遗传报告细胞系提供了一种可视化、追踪和分离目标细胞的方法，前提是报告蛋白（RP）的表达能够真实再现内源性表达模式。  利用基因编码区上游的启动子可构建粗略的遗传报告系统，但此类构建体缺乏调控内源基因表达的精确调控元件。  相比之下，同源重组技术可确保报告蛋白（RP）的高保真表达。  过去，已通过设计用于特定基因座同源重组的靶向载体，结合电穿孔介导的DNA递送方法，在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中实现了报告蛋白的靶向插入^1,2。  然而，通过传统同源重组方法在人类胚胎干细胞（hESCs）中生成报告细胞系的效率极低，因此仅在少数研究中有所报道（综述见³）。通过使用一种经基因工程改造的嵌合蛋白，该蛋白由FokI 核酸酶与位点特异性锌指基序融合而成，统称为锌指核酸酶（ZFNs），可在预定的基因组位点引入DNA双链断裂。  当加入含有与DNA双链断裂两侧同源序列的DNA载体时，基因组位点可通过同源重组方式进行修复，从而实现供体DNA序列的整合。该技术已被证明....

方案

所有操作均在无菌超净工作台中进行。除非另有说明，所有培养基和溶液均需预热至37 °C。

1. 转染用人源PSCs（hESCs和hiPSCs，本方案中使用WA-09）的扩增

注意：人胚胎干细胞（hESCs）的扩增无需使用Matrigel或Geltrex。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上扩增的人胚胎干细胞，在经过MEF去除步骤后（见第2.8节），可用于电穿孔或核转染。

1. 准备1个100 mm培养皿和1个75 cm²培养瓶，分别接种DR4 MEFs细胞，密度为2.0 × 10⁶⁴ 每平方厘米细胞数² 在MEF培养基中（参见 表1) 接种于预先用0.1% (w/v) 明胶包被的培养皿中。
   注意：可使用 CF1、BLK6 或 MF1 MEFs，但建议使用具有抗生素抗性的 MEF 细胞系。 例如， DR410
2. 次日，将hESC传代至一个预先接种了第1.1节制备的MEFs的100 mm培养皿中。操作时，先吸除培养皿中的hESC培养基，用无Ca2+/Mg2+的Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤hESC，然后加入Dispase（见 表2 （适当体积），置于37°C、5% CO₂的加湿培养箱中₂孵育3-5分钟后，吸除Dispase，....

结果

定制设计的共电穿孔后 PITX3 锌指对连同 PITX3-EGFP特异性的DNA供体质粒，随后通过嘌呤霉素筛选，利用基因组PCR筛选初步鉴定出阳性hESC克隆（图1）。利用5’和3’特异性探针对这些PCR阳性克隆进行Southern印迹杂交，证实已正确靶向至exon 1 PITX3 位点（图2)，效率为19%。免疫荧光图像如图所示 图3 利用已发表的PA6基质细胞分化方案进行分化后，展示由PITX3启动子驱动的EGFP表达^12,13. 可观察到EGFP与中脑多巴胺能神经元标志物（如FOXA2（红色））的共定位图 3A）和酪氨酸羟化酶（TH；红色）（图3B），而重要的是，未观察到与GABA能标记物γ-氨基丁酸（GABA；红色）的共定位 (图3C).

讨论

报告基因细胞系的建立为从人胚胎干细胞（hESC）来源的异质性细胞群体中追踪、可视化和分离目标细胞提供了强有力的手段。  然而，通过传统同源重组方式进行基因打靶在人胚胎干细胞中效率极低³。  在本实验方案中，我们描述了一种相对简便的技术，利用一种广泛可得的靶向载体联合锌指核酸酶（ZFNs），在hESC中将报告基因（RP）插入PITX3基因座的第一个外显子中。  在我们的操作中，该基因打靶系统效率较高，19%的嘌呤霉素抗性克隆含有正确打靶的PITX3基因座（与先前发表的结果相似⁶）。 

使用锌指核酸酶（ZFNs）进行基因靶向的一个局限性在于，自行从头设计ZFNs存在困难。  因此，在本实验方案中，我们采用了定制的商业化ZFNs，但其获取成本较高。  近年来，TALEN系统已被用于通过同源重组实现基因靶向⁹。  使用TALENs可显著降低基因编辑的成本，并且可在实验室内自行设计，从而加快研究进程。  尽管本研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠胚胎成纤维细胞（DR4）	GlobalStem	GSC-6004G
明胶	Sigma	G1393-100ML
无钙、无镁、无酚红 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）	Life Technologies	14175-095
Dispase	StemCell Technologies	7923
细胞刮刀	康宁	3008
Accutase	Life Technologies	A11105-01
Y27632	Axon Medchem	Axon 1683
细胞筛网 - 40 μm	BD 生物科学	352340
33 mm - 0.22 μm 滤膜	Millipore	SLGP033RS
rhFGF2	R&D Systems	233-FB-025/CF
电穿孔仪	BioRad	165-2661
0.4 cm 电穿孔比色皿	BioRad	165-2088
人TV-hPITX3-正向靶向构建体	Addgene	31942
ZFN 试剂盒；人类 PITX3	Sigma-Aldrich	CKOZFN1050-1KT
嘌呤霉素	InvivoGen	ant-pr-1
Matrigel	BD 生物科学	354277
Geltrex	Life Technologies	A1569601
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	10566-016
胎牛血清，经鉴定，热灭活，美国来源（FBS）	Life Technologies	16140-071
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063
Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）	Life Technologies	11320-033
KnockOut血清替代物（KSR）	Life Technologies	10828-028
MEM非必需氨基酸  (非必需氨基酸)	Life Technologies	11140-050
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061
ß-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023
N-月桂酰肌氨酸钠溶液（Sarcosyl）（30%）	Sigma-Aldrich	61747
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Trizma盐酸盐	Sigma-Aldrich	T3253
蛋白酶K溶液（20 mg/ml）	Bioline Australia	BIO-37084
长片段模板PCR扩增系统	罗氏澳大利亚	11681834001
hPITX3 L臂通用引物F（引物）：5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’	GeneWorks，澳大利亚
hPITX3 左臂 GFP 右（引物）：5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’	GeneWorks，澳大利亚
HyperLadder 1 kb	Bioline Australia	BIO-33025
GelRed	澳大利亚 Jomar 生物科学公司	41003