需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向

10.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51764

⸱

2014年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

本文内容

摘要

报告基因细胞系提供了一种在异质性细胞群体中可视化、追踪和分离目标细胞的方法。 然而，利用传统同源重组技术在人胚胎干细胞中进行基因靶向的效率极低。本文中，我们描述了利用锌指核酸酶增强的同源重组技术，将EGFP靶向整合至中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3位点的方法。

摘要

目前人类胚胎干细胞（ESC）分化方案的一个主要局限在于会产生异质性的细胞群体。 这些培养物含有目标细胞，但也混有未分化的胚胎干细胞、非神经系衍生物以及其他神经元亚型。  这限制了它们在 体外 和 体内 应用，例如 体外 用于药物发现或细胞替代治疗的建模。为帮助克服这一挑战，可构建报告细胞系，以实现对目标细胞的可视化、追踪和分离。 然而，通过传统的同源重组方法在人类胚胎干细胞中实现这一目标效率极低。 本方案描述了对 Pituitary homeobox 3 (PITX3利用定制设计的锌指核酸酶在人类胚胎干细胞中对特定基因座进行编辑，该核酸酶可引入位点特异性的DNA双链断裂，并结合一个 PITX3-EGFP特异性的DNA供体质粒。在生成之后 PITX3 报告细胞系，随后可利用已发表的方案进行分化，用于诸如 体外 帕金森病建模或细胞替代治疗

引言

目前的胚胎干细胞（ESC）分化方案会产生异质性的细胞群体，尤其是在获得特定神经元表型方面。  因此，尽管培养物中含有目标细胞表型，但通常也存在其他神经元、非神经元以及未分化的细胞类型1.  这些特性限制了胚胎干细胞来源的细胞在细胞替代治疗中的应用 体外 疾病建模

遗传报告细胞系提供了一种可视化、追踪和分离目标细胞的方法，前提是报告蛋白（RP）的表达能够真实再现内源性表达模式。  利用基因编码区上游的启动子可构建粗略的遗传报告系统，但此类构建体缺乏调控内源基因表达的精确调控元件。  相比之下，同源重组技术可确保报告蛋白（RP）的高保真表达。  过去，已通过设计用于特定基因座同源重组的靶向载体，结合电穿孔介导的DNA递送方法，在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中实现了报告蛋白的靶向插入1,2。  然而，通过传统同源重组方法在人类胚胎干细胞（hESCs）中生成报告细胞系的效率极低，因此仅在少数研究中有所报道（综述见3）。通过使用一种经基因工程改造的嵌合蛋白，该蛋白由FokI 核酸酶与位点特异性锌指基序融合而成，统称为锌指核酸酶（ZFNs），可在预定的基因组位点引入DNA双链断裂。  当加入含有与DNA双链断裂两侧同源序列的DNA载体时，基因组位点可通过同源重组方式进行修复，从而实现供体DNA序列的整合。该技术已被证明在人类原代细胞4,5 和hESCs6,7 的基因组编辑中具有重要应用价值。  近期研究进一步利用了转录激活子样效应物核酸酶（TALENs）——一类源自植物病原菌的转录因子8，用于设计位点特异性核酸酶9。

在以下实验方案中，我们通过电穿孔法将含有EGFP的同源靶向载体6与针对人类Pituitary homeobox 3（PITX3）位点的ZFNs共同导入hESC，从而构建hESC报告细胞系。  经过2至3周的抗生素筛选后，可手动挑选正确整合DNA的hESC克隆，进行扩增，并首先通过PCR进行初步筛选，随后通过Southern印迹法验证。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有操作均在无菌超净工作台中进行。除非另有说明，所有培养基和溶液均需预热至37 °C。

1. 转染用人源PSCs（hESCs和hiPSCs，本方案中使用WA-09）的扩增

注意：人胚胎干细胞（hESCs）的扩增无需使用Matrigel或Geltrex。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上扩增的人胚胎干细胞，在经过MEF去除步骤后（见第2.8节），可用于电穿孔或核转染。

  1. 准备1个100 mm培养皿和1个75 cm²培养瓶，分别接种DR4 MEFs细胞，密度为2.0 × 10⁶4 每平方厘米细胞数2 在MEF培养基中（参见 表1) 接种于预先用0.1% (w/v) 明胶包被的培养皿中。
    注意：可使用 CF1、BLK6 或 MF1 MEFs，但建议使用具有抗生素抗性的 MEF 细胞系。 例如， DR410
  2. 次日，将hESC传代至一个预先接种了第1.1节制备的MEFs的100 mm培养皿中。操作时，先吸除培养皿中的hESC培养基，用无Ca2+/Mg2+的Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤hESC，然后加入Dispase（见 表2 （适当体积），置于37°C、5% CO₂的加湿培养箱中2孵育3-5分钟后，吸除Dispase，用HBSS轻柔洗涤1-2次以去除MEFs。加入hESC培养基（参见 表3用细胞刮棒或5 ml移液器，轻轻将菌落从培养皿表面刮下。
  3. 将培养皿中的集落碎片从悬浮液中收集到15 ml离心管中。用hESC培养基冲洗培养皿，并将冲洗液转移至15 ml离心管中。注意避免将细胞团块分散成单细胞或过小的碎片。
  4. 以160 × g离心5分钟，使菌落碎片沉淀。
  5. 吸弃上清液。用手指轻敲15 ml离心管底部，以松动菌落碎片沉淀。根据传代比例（通常传代比例为1:4至1:8较为合适），在hESC培养基中轻柔重悬菌落碎片。操作时需格外小心，避免将细胞团块分散成单细胞或过小的碎片，以免影响再接种效率。
  6. 在将hESC细胞团块重新接种到MEFs上之前，先用HBSS洗涤1次。缓慢加入适量的（参见 表2将含有hESC细胞团的细胞悬液用hESC培养基接种至预先铺有MEFs的培养皿中。
  7. 将培养皿放入培养箱的架子上，缓慢地前后左右移动，以均匀分散菌落碎片。
  8. 每日更换hESC培养基。
  9. 为制备小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM），用 PBS 洗涤 75 cm² 培养瓶中的 MEF 细胞一次，随后加入 10 mL 新鲜的低糖 DMEM 培养基（含 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素），在 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育 24 小时。收集上清液，于 4°C 下以 1,500 × g 离心 5 分钟以去除细胞碎片，随后将上清液过滤除菌（0.22 μm 滤器），分装后于 -80°C 保存备用。2 预先接种MEFs的培养瓶用HBSS洗涤1次，加入hESC培养基。24小时后收集条件培养基，并更换为新鲜hESC培养基。此后每日重复换液，最多持续12天。将MEF条件培养基（MEF-CM）储存于4 °C备用。

2. 转染前人胚胎干细胞的准备

  1. 每天在显微镜下观察hESCs的生长情况。当集落达到40-50%汇合度时，将3个直径100 mm的培养皿接种，每皿接种2.0 × 10⁶个细胞。5 每平方厘米的MEFs2.
  2. 当细胞集落达到60%–70%融合度时，即可进行转染。通过去除已分化的集落或集落核心对集落进行“修整”。
    注意：由于我们相信细胞在对数生长期时转染效率和靶向效率更高，因此建议在人胚胎干细胞（hESCs）融合度达到≥70%之前进行电穿孔。
  3. 用HBSS洗涤hESC集落，然后加入Accutase。
    注意：在步骤2.7中与Y-27632共同孵育时已可实现充分抑制，因此无需在之前用ROCK抑制剂Y-27632对hESCs进行预处理。
  4. 37°C、5% CO₂条件下孵育10–20分钟2 直至在显微镜下观察到菌落分散为单细胞。用1 ml移液器吹打细胞。
  5. 加入hESC培养基，并使用40 μm细胞滤网过滤至15 ml锥形管中，以去除细胞团块。
  6. 在160 × g下离心5分钟。用新鲜的hESC培养基重悬细胞沉淀，以去除残留的Accutase溶液，重复一次。
  7. 将细胞重悬于含有10 μM Y-27632的hESC培养基中，并将全部细胞悬液转移至预先用明胶包被的100 mm培养皿中。
  8. 37 °C/5% CO₂ 条件下孵育2 至少 30 分钟。
  9. 在此期间，MEFs 将附着于明胶包被的培养皿上。使用 1 ml 移液器收集未贴壁的 hESCs，转移至新的 15 ml 离心管中，并用血细胞计数板测定细胞密度。

3. 人类胚胎干细胞的电穿孔

  1. 使用 0.22 μm 滤器过滤 CM-MEF 培养基，并加入 10 ng/ml 重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）
  2. 将2.9节中的7.5 × 10⁶个hESCs转移至一个新的15 ml锥形管中，在160 × g条件下离心5分钟。
  3. 在此期间设置电穿孔仪：选择指数衰减电穿孔程序，并设定以下参数：电压：250 V，电容：500 μF，电阻：∞-。
  4. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 0.8 ml 冰上预冷的 0.22 μm 滤过 HBSS 中。将悬液转移至无菌的 0.4 cm 电穿孔比色皿中。
  5. 加入TV-hPITX3-正向靶向质粒（30 μg DNA），用200 μl移液器轻轻混匀。冰上孵育5分钟。在此期间，取出一份PITX3 ZFN mRNA，在冰上解冻。解冻后，将7.5 μl ZFN mRNA转移至电穿孔杯中的DNA/细胞混合物中，用200 μl移液器轻轻混匀。
    注意：靶向位点是影响靶向效率的主要因素。在胚胎干细胞（ESCs）中不表达的基因或沉默基因的位点，例如 PITX3，使用传统的同源重组方法难以靶向。6因此，本实验方案利用针对人类PITX3位点定制设计的锌指核酸酶（ZFNs），以诱导DNA双链断裂。
  6. 按照电穿孔仪屏幕上的提示进行电穿孔操作。
  7. 使用200 μl移液器将电穿孔比色皿中的内容物转移至含有10 ml hESC培养基的15 ml离心管中。每次用200 μl hESC培养基洗涤比色皿两次，并将洗涤液转移至同一15 ml离心管中。此时会有由裂解细胞释放的DNA和蛋白质形成的“黏液状”碎片，这些碎片会对细胞存活产生不利影响。在160 × g条件下离心5分钟，以去除这些碎片。
  8. 吸弃上清液，轻轻敲击细胞沉淀以松动。用30 ml添加了10 μM Y-27632的MEF-CM重悬细胞，接种至3个预先铺有MEFs的100 mm培养皿中。
  9. 每天更换培养基。第2天时，可撤去Y-27632，仅使用hESC培养基培养细胞。
  10. 培养2-3天后，hESCs应达到50%-70%汇合度。此时开始抗生素筛选（例如， 0.5 μg/ml 嘌呤霉素
  11. 每天添加新鲜的hESC/嘌呤霉素培养基以维持筛选。约7天后应可见小克隆形成。若未使用抗生素抗性的MEF，则可通过额外添加1.0 × 10⁶ MEF以进行补充。4 每平方厘米细胞数2.

4. 挑选转基因 hESC 克隆

  1. 在筛选后约 14 - 21 天（当克隆直径达到约 1 mm 时），准备用于扩增和筛选的培养板。首先在 4°C 下解冻一份 Matrigel 或 Geltrex，至少解冻 5 小时。按照生产商说明书进行稀释，并向 3 块 96 孔板的每孔中加入 75 μl。通过将 MEF 细胞以 2.0 × 104 个细胞/cm2 的密度接种，准备 3 块 48 孔板。将上述两种培养板均于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。
  2. 次日，使用连接在 2 ml 移液器末端的 21 G 针头，以网格切割法将克隆分割为 16–25 块。
  3. 吸除 96 孔板中的 Matrigel，并替换为添加补充物的 CM-MEF 培养基。用 HBSS 对 48 孔板中的 MEF 细胞洗涤一次，随后加入 hESC 培养基。
  4. 使用 200 μl 移液器，将分割后的克隆约 1/3 轻柔转移至 48 孔板中用于扩增；将剩余 2/3 转移至对应的含补充 CM-MEF 培养基的 96 孔板中。
  5. 每天更换培养基以维持培养（96 孔 Matrigel 包被板使用添加补充物的 CM-MEF 培养基，含 MEF 的 48 孔板使用 hESC 培养基；两种培养基均补充 0.5 μg/ml puromycin）。
  6. 持续扩增至 96 孔板细胞完全汇合，随后通过 PCR 进行初步筛选。

5. 阳性克隆的筛选与扩增

  1. 为制备基因组DNA（方法基于 11），通过倒置去除培养板中的全部培养基，然后用纸巾吸干。
  2. 每孔用室温PBS洗涤两次（每次100 µl/孔），倒置后如步骤5.1所述吸干。将培养板置于-80 °C冷冻1至2小时以促进细胞裂解（培养板可长期以此状态保存）。
  3. 在细胞于-80 °C冷冻期间，配制Sarcosyl裂解缓冲液（见表4）（50 µl/孔）。为裂解细胞，将培养板在室温下解冻5分钟，然后将裂解缓冲液加入各孔中。用封口膜密封每块培养板边缘，放入含有湿润纸巾的密封容器中以维持湿度，并在60 °C过夜孵育。
  4. 孵育结束后，向10 ml -20 °C的无水乙醇中加入150 µl 5 M NaCl，充分混匀，然后向每孔加入100 µl（注意：加入NaCl后乙醇溶液会变浑浊）。轻轻敲击培养板以混匀（不要使用移液器吹打），室温静置至少30分钟。在此期间，溶液将逐渐变清，DNA将发生沉淀。
  5. 按步骤5.1方法移除液体，然后向每孔加入150 µl 70%乙醇。轻柔倒置培养板并如前吸干。重复此步骤2次。
    注意：由于沉淀的DNA会自然黏附于组织培养级塑料表面，因此在这些洗涤步骤中不会脱落。
  6. 最后一次洗涤后，将培养板以最高速度短暂离心，使DNA聚集至各孔底部，然后在室温（或37 °C）下空气干燥至少30分钟。
  7. 向每孔加入40–50 µl T0.1E（pH 8.0）（见表5）或TE（pH 8.0），将培养板置于65 °C孵育1小时，或4 °C过夜，之后用于PCR。通过轻敲培养板侧面使DNA重悬。每10 µl PCR反应使用1–2 µl重悬的DNA。
  8. 使用Expand Long Template PCR系统，以hPITX3 L臂基因F和hPITX3 L臂GFP R引物，对克隆进行初步筛选，退火温度58 °C，延伸时间45秒，共35个循环。
  9. 将样品与Hyperladder 1kb一同在含GelRed的1%琼脂糖凝胶中以100 V电泳45分钟，通过紫外照射检测阳性克隆。
  10. 通过HindIII酶切扩增后的阳性克隆基因组DNA，并使用位于载体同源臂5’和3’端的探针进行Southern印迹杂交，以验证PCR阳性克隆（方法如前所述1）。探针通过PCR扩增获得，所用引物对分别为hPITX3 5’探针F和R，以及hPITX3 3’探针F和R，经EcoRI酶切后连接至通用克隆载体。
  11. 根据阳性克隆数量，用MEFs预先包被6孔板中的2个孔（2.0 × 104 细胞/cm2）。
  12. 次日，用10 μM Y-27632对48孔板中的阳性克隆进行预处理，至少孵育1小时。
  13. 用HBSS洗涤阳性克隆，然后加入300 μl Accutase。
  14. 当集落解离为单细胞时，加入1 ml hESC培养基，收集至15 ml离心管中。
  15. 每天更换培养基。第2天可停止添加Y-27632，细胞继续在hESC培养基中培养。
  16. 当集落融合度达到70–80%时，进行传代，并将剩余的集落片段冻存。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

定制设计的共电穿孔后 PITX3 锌指对连同 PITX3-EGFP特异性的DNA供体质粒，随后通过嘌呤霉素筛选，利用基因组PCR筛选初步鉴定出阳性hESC克隆（图1）。利用5’和3’特异性探针对这些PCR阳性克隆进行Southern印迹杂交，证实已正确靶向至exon 1 PITX3 位点（图2)，效率为19%。免疫荧光图像如图所示 图3 利用已发表的PA6基质细胞分化方案进行分化后，展示由PITX3启动子驱动的EGFP表达12,13. 可观察到EGFP与中脑多巴胺能神经元标志物（如FOXA2（红色））的共定位图 3A）和酪氨酸羟化酶（TH；红色）（图3B），而重要的是，未观察到与GABA能标记物γ-氨基丁酸（GABA；红色）的共定位 (图3C).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

报告基因细胞系的建立为从人胚胎干细胞（hESC）来源的异质性细胞群体中追踪、可视化和分离目标细胞提供了强有力的手段。  然而，通过传统同源重组方式进行基因打靶在人胚胎干细胞中效率极低3。  在本实验方案中，我们描述了一种相对简便的技术，利用一种广泛可得的靶向载体联合锌指核酸酶（ZFNs），在hESC中将报告基因（RP）插入PITX3基因座的第一个外显子中。  在我们的操作中，该基因打靶系统效率较高，19%的嘌呤霉素抗性克隆含有正确打靶的PITX3基因座（与先前发表的结果相似6）。 

使用锌指核酸酶（ZFNs）进行基因靶向的一个局限性在于，自行从头设计ZFNs存在困难。  因此，在本实验方案中，我们采用了定制的商业化ZFNs，但其获取成本较高。  近年来，TALEN系统已被用于通过同源重组实现基因靶向9。  使用TALENs可显著降低基因编辑的成本，并且可在实验室内自行设计，从而加快研究进程。  尽管本研...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本方案中所描述的工作由维多利亚州政府资助，该资助是与加州再生医学研究所（CIRM）合作联盟的一部分。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠胚胎成纤维细胞（DR4）GlobalStemGSC-6004G
明胶SigmaG1393-100ML
无钙、无镁、无酚红 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）Life Technologies14175-095
DispaseStemCell Technologies7923
细胞刮刀康宁3008
AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Y27632Axon MedchemAxon 1683
细胞筛网 - 40 μmBD 生物科学352340
33 mm - 0.22 μm 滤膜MilliporeSLGP033RS
rhFGF2R&D Systems233-FB-025/CF
电穿孔仪BioRad165-2661
0.4 cm 电穿孔比色皿BioRad165-2088
人TV-hPITX3-正向靶向构建体Addgene31942
ZFN 试剂盒；人类 PITX3Sigma-AldrichCKOZFN1050-1KT
嘌呤霉素InvivoGenant-pr-1
MatrigelBD 生物科学354277
GeltrexLife TechnologiesA1569601
NaClSigma-AldrichS3014
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Life Technologies10566-016
胎牛血清，经鉴定，热灭活，美国来源（FBS）Life Technologies16140-071
青霉素/链霉素Life Technologies15070-063
Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）Life Technologies11320-033
KnockOut血清替代物（KSR）Life Technologies10828-028
MEM非必需氨基酸  (非必需氨基酸)Life Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
ß-巯基乙醇Life Technologies21985-023
N-月桂酰肌氨酸钠溶液（Sarcosyl）（30%）Sigma-Aldrich61747
EDTASigma-AldrichE9884
Trizma盐酸盐Sigma-AldrichT3253
蛋白酶K溶液（20 mg/ml）Bioline AustraliaBIO-37084
长片段模板PCR扩增系统罗氏澳大利亚11681834001
hPITX3 L臂通用引物F（引物）：5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’GeneWorks，澳大利亚
hPITX3 左臂 GFP 右（引物）：5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’GeneWorks，澳大利亚
HyperLadder 1 kb Bioline AustraliaBIO-33025
GelRed澳大利亚 Jomar 生物科学公司41003

参考文献

  1. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
  2. Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
  3. Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
  4. Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
  5. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
  6. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  7. Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
  8. Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
  9. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  10. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
  11. Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
  12. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
  13. Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
  14. Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

PITX3 报告基因电穿孔Southern 印迹PCR 筛选MEF 共培养克隆分离抗生素筛选
锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。