我们报告了一种从小鼠胰腺中分离高完整性RNA的方案，该组织富含核糖核酸酶。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
从富含核糖核酸酶的组织（如小鼠胰腺）中分离高质量RNA具有挑战性。由于胰腺的主要功能是参与消化，小鼠胰腺中的核糖核酸酶含量可能高达75 mg。本文报道了对标准苯酚/硫氰酸胍裂解试剂方案的若干改进，以实现从小鼠胰腺中分离RNA。硫氰酸胍是一种强效的蛋白质变性剂，在大多数条件下可有效破坏核糖核酸酶的活性。然而，要成功地从富含核糖核酸酶的组织中分离RNA，必须对标准方案进行关键性修改。关键步骤包括使用高比例的裂解试剂与组织量、在相分离前去除未消化的组织，以及在RNA溶液中加入核糖核酸酶抑制剂。通过这些及其他改进措施，我们常规获得的RNA其RNA完整性数值（RIN）均高于7。所获得的RNA质量足以满足常规基因表达分析的要求。本方案也可便捷地适用于其他富含核糖核酸酶的组织RNA提取。
引言
高质量完整 RNA 的分离对于常规分子生物学实验至关重要，例如 Northern 印迹9、qRT-PCR1 或基因表达谱分析5。目前大多数 RNA 分离方法均基于异硫氰酸胍法的改进2, 3。异硫氰酸胍是一种强效的蛋白质变性剂，可在大多数条件下有效抑制核糖核酸酶的活性。Chomczynski 和 Sacchi3 提出的常用方法在异硫氰酸胍裂解液中加入苯酚，使分离时间缩短至约 4 小时。目前许多 commercially-available RNA 提取试剂均基于 Chomczynski 和 Sacchi 的方法3。
富含核糖核酸酶的组织（如人或小鼠胰腺）在RNA提取过程中会带来额外挑战。小鼠胰腺中核糖核酸酶含量可高达75 mg6，在胰腺组织破碎过程中部分酶会被释放，导致组织自溶。已有对硫氰酸胍法的多种改良方案被成功用于提取高完整性的胰腺RNA2, 4, 7, 10。向小鼠胰腺灌注RNA稳定试剂有助于获得高完整性的RNA4, 7, 10，但该操作技术要求高，可能需要解剖显微镜等专用仪器，且操作过程中可能破坏组织结构，导致细胞裂解。使用RNA稳定试剂灌注组织还可能干扰后续的蛋白质提取和组织学染色等其他应用。此外，该技术不适用于人胰腺RNA的提取。其他一些方案则要求研究者自行配制特定溶液2。
我们报告一种从小鼠胰腺中分离高完整性RNA的实验方案。该方案结合了先前已发表方法中的一些要素，主要基于标准的苯酚/硫氰酸胍裂解试剂法。本方法无需配制特殊溶液，也无需将试剂灌注到胰腺组织中。成功分离RNA的关键步骤包括：使用较高的苯酚/硫氰酸胍裂解试剂与组织的比例、在相分离前去除未消化的组织，以及在最终的RNA溶液中加入核糖核酸酶抑制剂。通过这些及其他优化措施，我们通常可获得RIN值大于7的RNA，适用于常规基因表达分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备
以下操作遵循机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的政策。
- 建议每天分离的小鼠胰腺不超过6个。确保所有手术器械清洁并经过高压灭菌，每只动物使用一套独立的器械。
- 标记所有微量离心管，每只动物准备四个2 ml的离心管。
- 将8 ml裂解试剂加入50 ml离心管中，并置于冰上。注意：尽管纯化试剂盒中包含适用于胰腺分离的硫氰酸胍-苯酚试剂，但由于每次分离需要较大体积，因此使用裂解试剂。
- 将以下溶液各约10 ml分装至15 ml离心管中，用于清洗匀浆器刀头：70%乙醇（2管）、HPLC级水（1管），以及含有约200 µl RNase Away或等效核糖核酸酶失活剂的HPLC级水（1管）。
2. 手术、胰腺解剖与匀浆
- 将 1-2 ml 异氟烷加入含有棉纱布或纸巾的广口瓶中。将小鼠放置在可防止其接触异氟烷源的平台上。在麻醉每只小鼠之前，向瓶中添加新鲜的异氟烷。
- 轻柔地将小鼠放入含有异氟烷的广口瓶中，盖上瓶盖，并通过轻轻前后摇动瓶子来监测麻醉效果。当小鼠无法自行站立时，表明已进入麻醉状态。
- 为确认麻醉效果，将动物从瓶中取出并施加有力的足趾夹捏。如果小鼠对足趾夹捏无反应，则进行步骤 2.5。
- 如果小鼠对足趾夹捏有反应，则重复步骤 2.2 至 2.3。
- 将已麻醉的动物俯卧位放置于实验台面上。用左手牢固按压小鼠颈部，右手抓住小鼠尾巴，迅速以约 45° 角向上拉扯，使颈椎脱位。
- 使用 25 号皮下注射针刺穿动物四肢足掌，将尸体固定于一个表面（如覆盖有纸巾的平整泡沫板）上。
- 使用无菌外科器械切开小鼠腹部中段，并迅速取出胰腺。用镊子夹住胰腺，使用弹簧剪将其从小肠和脾脏上剪下。在取出过程中注意不要拉伸胰腺，以免组织破裂释放核糖核酸酶。注意：从小鼠体内取出胰腺所需的时间至关重要。熟练操作者应在约 1 分钟或更短时间内完成胰腺解剖。
- 将整个胰腺放入含有 8 ml 冰冷裂解试剂的 50 ml 离心管中。盖紧管盖，短暂振荡以使组织完全浸入试剂中，并立即进入下一步操作。裂解试剂与组织的比例至关重要。有关使用不同体积裂解试剂所提取 RNA 完整性的比较，请参见结果部分。
- 匀浆 5 秒。操作时需将匀浆器刀头压至离心管底部，以便组织被吸入刀头内，实现高效匀浆。
3. 去除未消化的组织
注意：匀浆后，裂解试剂中仍会残留少量组织碎片。此时应优先快速裂解组织，允许部分组织未完全消化，避免过度匀浆导致RNA降解。
- 将含有已裂解胰腺的2 ml裂解试剂转移至一个2 ml微量离心管中。每次分离需收集两管匀浆液。剩余匀浆液应弃去或于-80 °C保存以备后续研究使用。
- 在4 °C条件下，以12,000 × g离心5分钟，使未消化的组织沉淀。此步骤至关重要，因为未完全消化的组织若带入后续RNA溶液中，可能会将核糖核酸酶（RNase）引入样品，造成污染（参见步骤5.13）。
- 将1 ml上清液转移至另一个2 ml微量离心管中。立即进行后续分离操作，并将另一份重复样品管置于-80 °C保存以备将来使用。在进行下一步操作期间，将所有含有匀浆液的离心管置于湿冰上保存。
- 将剩余的裂解试剂弃入适当的化学废液容器中。
4. 匀浆器刀头的清洗
- 在进行下一个组织分离之前，将匀浆器刀片放入10 ml 70%乙醇中清洗。启动匀浆器约20秒，以去除卡在刀片上的任何组织碎片。
- 使用200 µl移液器吸头去除匀浆器刀片上残留的任何组织碎片。
- 依次用清水、通用RNase失活剂和70%乙醇重复步骤4.1。用干净的Kim擦拭纸擦干匀浆器轴。
- 对剩余动物的胰腺分离重复步骤2.1，保持每个动物的RNA单独分离，不要将不同动物的RNA混合。
5. RNA 提取
以下部分与纯化试剂盒的操作步骤相同。使用纯化试剂盒的优势在于能够分离出包括小RNA在内的总RNA。
- 若使用冻存的匀浆液，需在湿冰上解冻，并于室温放置 5 分钟。
- 加入 200 µl 氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡 15 秒，然后在室温静置 2–3 分钟。
- 在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。
- 将上层水相转移至微量离心管中，加入 1.5 倍体积的异丙醇，通过反复吹打数次充分混匀。
- 将最多 700 μl 的样品转移至置于 2 ml 收集管中的离心柱中。盖上盖子，在室温下以 8,000 × g 离心 15 秒。
- 弃去穿流液。
- 重复步骤 5.5–5.6，使用剩余样品。
- 向离心柱中加入 700 μl RWT 缓冲液，以 8,000 × g 离心 15 秒，弃去穿流液。
- 用移液器将 500 μl RPE 缓冲液加入离心柱中，以 8,000 × g 离心 15 秒以洗涤柱子，弃去穿流液。
- 向离心柱中加入 500 μl RPE 缓冲液，以 8,000 × g 离心 2 分钟以干燥柱子。
- 将离心柱转移至 1.5 ml 微量离心管中，用移液器将 80 μl 无核糖核酸酶水直接加在离心柱膜上，以 8,000 × g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。
- 向 RNA 溶液中加入 1 µl 核糖核酸酶抑制剂。可于 -80 °C 保存，或继续进行步骤 5.13。
- 为验证 RNA 的完整性，首先使用分光光度计测定 RNA 浓度及 260/280 比值。
- 用分子生物学级水将部分 RNA 溶液稀释至约 500 ng/µl。
- 通过毛细管电泳分析测定 RNA 完整性（i.e.，RIN）。约需 5 µl RNA 溶液即可完成分析。
- 分装 RNA 溶液（见 图 2），并于 -80 °C 保存。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
从1 ml裂解匀浆液中提取的总RNA产量为20–40 µg。OD 260/280比值通常约为2.0，RIN值 consistently 大于7.0。如果RIN ≤6，则需要重复提取。偶尔可获得高于8.0的RIN值。
在摘除胰腺前，最常用的两种小鼠安乐死方法为 CO2 窒息法或异氟烷吸入法。两种方法均需在实施后进行颈椎脱位。由于化学试剂和/或操作时间可能影响RNA的完整性，因此比较了采用这两种方法分离的小鼠胰腺RNA的RIN值。小鼠分别通过CO2 窒息法或异氟烷吸入法进行麻醉，之后均实施颈椎脱位。与异氟烷吸入法相比，CO2 窒息法在颈椎脱位前的麻醉时间约延长1至2分钟。经异氟烷吸入法后分离的RNA其RIN值为7.5±0.31，而CO2 窒息法所得RNA的RIN值为2.2±0.3（p<10-4，均值±标准差，三次重复实验）。安乐死方法对RNA完整性具有显著影响，异氟烷吸入法优于CO2 窒息法。
...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
从富含核糖核酸酶的组织中分离RNA对分子生物学实验来说是一项巨大挑战。目前市面上有多种基于苯酚-硫氰酸胍法的试剂和试剂盒可用于RNA提取。硫氰酸胍能够使蛋白质变性，从而降低核糖核酸酶的活性。然而，胰腺中核糖核酸酶的含量极高，需要在标准RNA提取流程基础上进行额外的优化。本文报道了一种基于标准硫氰酸胍法的实验方案，包含多个关键性改进步骤，以及成功从胰腺等富含核糖核酸酶组织中分离RNA的技术要点。
需注意RNA提取的标准操作规范。这些技术对于成功提取RNA至关重要，即使是从RNase含量较低的组织样本中提取也不例外。具体措施包括使用分子生物学级别的水、无RNase的耗材以及一次性塑料制品而非玻璃器皿。建议在每次提取过程中更换手套。对于缺乏RNA提取经验的操作者，建议先从RNase含量较低的样本（如肝脏）或细胞培养物中提取RNA以积累经验，再开展需要从胰腺组织中提取RNA的工作。目前已有大量优秀的实验方案，提供了成功操作RNA的多种关键步骤8。
本文报道了从鼠胰腺中分离高完整性RNA的几个关键因素。这些因素包括...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢凌建华、雷蒙德·麦克唐纳、加尔文·斯威夫特、米歇尔·格里芬、保罗·格里波和拉查加尼·萨特亚纳拉亚纳提供的有益评论、建议以及共享实验方案。本研究得到了资助项目U01CA111294以及俄亥俄州立大学校内研究计划颁发的“创新性发展奖”的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Power Gen 500 | 费舍尔科技 | 14-261-03 | 匀浆器 |
| 5424R | 艾本德 | 制冷型微量离心机 | |
| Trizol 试剂 | 英潍捷基 | 15596018 | 裂解试剂 |
| 学生用Vannas弹簧剪 | 费舍尔 | 91500-09 | 用于从附着组织中分离胰腺 |
| 外科剪刀，6英寸 | 费舍尔 | 08-951-20 | 用于剪开小鼠皮肤 |
| 钝头镊子 | 费舍尔 | 1381239 | 解剖时用于夹持胰腺 |
| 异氟烷 USP | 雅培实验室 | 4/8/5210 | 麻醉剂 |
| Rnase out（40 U/µl） | 英潍捷基 | 10777-019 | RNase抑制剂 |
| Rnase Away | 安比昂 | 10328-011 | 通用RNase失活剂 |
| 高效液相色谱级水 | 费舍尔 | W5-4 | 用于清洗匀浆器刀头 |
| 分子生物学级水 | 海克隆 | SH30538.03 | RNA洗脱 |
| miRNeasy Mini 试剂盒 | 凯杰 | 217004 | 纯化试剂盒 |
| 2 ml 微量离心管，经认证无RNase和DNase | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml 离心管 | 法尔肯 | 352099 | |
| 70% 乙醇 | 费舍尔 | ||
| 100% 乙醇 | 费舍尔 | ||
| 200 µl 移液器吸头 | 雷宁 | GPL200F | 用于清洗匀浆器刀头 |
| 氯仿 | 费舍尔 | BP1145-1 | |
| Nanodrop | 赛默飞 | ND-1000 | 分光光度计 |
| Bioanalyzer | 安捷伦 | 毛细管电泳分析仪，用于测定RNA完整性 | |
| RNAlater | 安比昂 | RNA稳定试剂 | |
| RNeasy 离心柱 | 凯杰 | 离心柱 ，miRNeasy Mini 试剂盒的组成部分 | |
| 小鼠 | 查尔斯河 | 品系 C57BL/6 | 年龄范围为4至12个月。 |
| 小鼠 | 杰克逊实验室 | 品系 129 | 年龄范围为4至12个月。 |
参考文献
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
