高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

摘要

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。

摘要

单分子显微技术正成为一种强大的方法，用于分析信号分子的行为，特别是那些在整体测量（例如标准生化或显微方法所获得的数据）中通常被掩盖的方面（例如，动力学、不同状态和群体的共存、瞬时相互作用）。因此，诸如受体-受体相互作用之类的动态事件，可以在活细胞中以高时空分辨率进行实时追踪。本方案描述了一种基于小而明亮的有机荧光染料标记和全内反射荧光（TIRF）显微镜的方法，用于直接可视化活细胞表面的单个受体。该方法能够精确定位受体、测量受体复合物的大小，并捕捉诸如瞬时受体-受体相互作用等动态事件。本方案详细说明了如何开展单分子实验，包括样品制备、图像采集和图像分析。作为示例，报告了该方法在分析两种G蛋白偶联受体（即，β₂-肾上腺素能受体和γ-氨基丁酸B型（GABA_B）受体）中的应用。该方案可适用于其他膜蛋白、不同细胞模型、转染方法及标记策略。

引言

位于细胞表面的受体能够感知细胞外环境，并对多种刺激作出响应，例如气味分子、离子、小分子神经递质以及大分子蛋白质激素。细胞膜的流动性使得受体及其他膜蛋白能够在膜中移动，这对于蛋白质复合物的形成以及瞬时蛋白质-蛋白质相互作用的发生至关重要——例如受体借此组装成功能单位并将信号转导至细胞内部。例如，G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）是细胞表面受体中最大的家族¹，已有研究提示其可形成二聚体或多聚体，这种现象可能参与精细调控信号转导过程，并具有重要的生理学和药理学意义^2-5。

单分子显微技术具有高时空分辨率直接观测活细胞表面单个受体动态行为的巨大潜力，包括它们相互结合形成二聚体及更高级别的分子复合物^6-10。与传统的生物化学和显微方法相比，该技术具有多项优势，后者通常只能反映成千上万甚至数百万分子的平均行为。

使用足够明亮且光稳定的荧光团对蛋白质进行标记，对于单分子显微镜技术至关重要。本方案利用近年来新开发的SNAP标签¹¹，将小分子且高亮度的有机荧光团共价连接至细胞表面受体。SNAP是一种来源于人类DNA修复酶O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的20 kD蛋白标签，可与荧光团偶联的苄基鸟嘌呤（fluorophore-BG）衍生物发生不可逆标记。CLIP....

方案

1. 样品制备

1. 盖玻片清洗
   注意： 在通风橱中操作。
   1. 使用洁净的镊子将玻璃盖玻片（直径 24 mm）放入可分隔单个盖玻片的盖玻片架中。
   2. 将装有盖玻片的架放入烧杯中，加入氯仿直至完全浸没盖玻片。用铝箔覆盖烧杯以减少挥发，并在室温下使用水浴超声仪超声处理 1 小时。取出盖玻片架，让盖玻片自然干燥。
   3. 重复步骤 1.1.2，但以 5 M NaOH 溶液替代氯仿。
   4. 将盖玻片架转移至新的烧杯中，用蒸馏水清洗三次。将清洗后的盖玻片置于盛有 100% 乙醇的玻璃细胞培养板中备用。
2. 校准样品的制备
   1. 将荧光染料溶解于适当的溶剂中。
   2. 用滤膜除菌（0.22 µm）的水将荧光染料进行 1:10 系列稀释，浓度范围从 1 pM 至 1 nM。
   3. 取出储存在 100% 乙醇中的洁净盖玻片，用滤膜除菌水清洗。在每张洁净的盖玻片上分别点加 20 µl 不同浓度的荧光染料稀释液。在无菌罩下让盖玻片干燥。避光防尘保存至使用。这些样品用于估算单个荧光分子的荧光强度（见步骤 3）。
3. 转染
   1. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下，将 CHO 细胞培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素和 100....

结果

所述方案可应用于多种不同的膜蛋白。例如，已有研究报道了β₂-肾上腺素能受体和GABA_B受体的代表性实验结果¹⁰。由于单分子荧光信号较弱，最大限度降低背景荧光是获得成功结果的第一步关键操作。因此，必须使用经过充分清洗的盖玻片（图2A），并尽量减少样品的自发荧光（例如，使用不含酚红的培养基）。下一步是测定单个荧光分子的荧光强度，可通过在洁净盖玻片上点样单个荧光分子并成像实现（图2B）。通常采用荧光分子的系列稀释液，以筛选出最佳分析条件，即能够产生分布均匀且彼此分离良好的单荧光分子的浓度。还可通过成像单体对照蛋白（例如，用荧光标记的BG衍生物标记NAP标签CD86受体）进行额外对照实验。完成上述初步对照与校准后，即可开始正式实验。图3A展示了一个转染了SNAP标签β₂-肾上腺素能受体并用荧光标记BG衍生物染色的细胞的典型TIRF图像序列的第一帧图像，其中亮点代表单个受体或受体复合物。该图像还展示了适用于.......

讨论

本方案可实现对细胞表面受体复合物的空间分布、运动性及尺寸进行单分子水平的分析。与荧光蛋白标记相比，使用小分子有机荧光染料具有更亮的荧光信号和更高的光稳定性，因而更适合对单个受体颗粒进行长时间的可视化观察。由于该方法可实现极低的表达水平（<0.45 个受体颗粒/µm²），因此可在不超过生理表达密度的条件下分析受体及其他膜蛋白的特性。此外，还可分析受体在激动剂刺激¹⁰或其他干预措施（例如模拟病理状态）下的变化。同时，由于采用SNAP/CLIP标签^11,12的标记策略具有高度灵活性，可根据具体需求选择不同的荧光染料——值得注意的是，联合使用SNAP和CLIP标签可实现双色实验，e.g.，用于观察两个相互作用蛋白之间的共定位。最后，本方案在多个环节均可进行修改，例如更换不同类型的细胞、转染方法或标记策略。

关键步骤包括尽量减少背景干扰和自发荧光（通过使用经过充分清洗的盖玻片、不含酚红的培养基以及过滤的溶液），优化转染条件（例如，质粒DNA用量及转染后时间）以实现极低表达水平，高效标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	AppliChem GmbH	A1585	警告：有毒且具刺激性物质，可能具有致癌性
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	警告：强碱性且具有强腐蚀性的试剂
无水乙醇	Sigma-Aldrich	32205
玻璃盖玻片	马里恩费尔德-优质	111640	24 mm 直径，0.13–0.16 mm 厚度
0.2 mm 无菌滤器	Sarstedt	83.1826.001
CHO细胞	ATCC，美国	ATCC CCL-61	中国仓鼠卵巢细胞系
6孔细胞培养板	Nunc	140675
DMEM/F-12 培养基	GIBCO，Life Technologies	11039-021	无酚红培养基
胎牛血清	Biochrom	S 0115
青霉素-链霉素	Pan Biotech GmbH	P06-07 100
胰蛋白酶-EDTA	Pan Biotech GmbH	P10-23100
Lipofectamine 2000	Invitrogen，Life Technologies	11668-019
Opti-MEM I 低血清培养基	Invitrogen，Life Technologies	31985-047
荧光团偶联的苄基鸟嘌呤	New England BioLabs	S9136S	SNAP-Surface Alexa Fluor 647。用DMSO配制1 mM的储存液。-20℃保存。°C.
DMSO	AppliChem GmbH	A1584
成像缓冲液：			137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl₂2，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，pH 7.3，经无菌滤膜过滤
NaCl	AppliChem GmbH	A1371
KCl	AppliChem GmbH	A3582
CaCl2	AppliChem GmbH	A2303
MgCl₂2	AppliChem GmbH	A3618
HEPES	AppliChem GmbH	A3724
成像室	分子探针，Life Technologies	A-7816	Attofluor 细胞培养皿，用于显微镜观察
全内反射荧光显微镜	Leica		型号：DMI6000B
全内反射荧光物镜	Leica	11 506 249	HCX PL APO 100x/1.46 油 CORR
EM-CCD相机	Roper Scientific		Photometrics Cascade 512B
温度控制器	Pecon		Tempcontrol 37-2 数字型
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院，美国		http://rsbweb.nih.gov/ij
u-track 软件	美国哈佛医学院细胞生物学系计算细胞生物学实验室		http://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab 软件	美国 MathWorks 公司