本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。
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摘要
摘要
单分子显微技术正成为一种强大的方法，用于分析信号分子的行为，特别是那些在整体测量（例如标准生化或显微方法所获得的数据）中通常被掩盖的方面（例如，动力学、不同状态和群体的共存、瞬时相互作用）。因此，诸如受体-受体相互作用之类的动态事件，可以在活细胞中以高时空分辨率进行实时追踪。本方案描述了一种基于小而明亮的有机荧光染料标记和全内反射荧光（TIRF）显微镜的方法，用于直接可视化活细胞表面的单个受体。该方法能够精确定位受体、测量受体复合物的大小，并捕捉诸如瞬时受体-受体相互作用等动态事件。本方案详细说明了如何开展单分子实验，包括样品制备、图像采集和图像分析。作为示例，报告了该方法在分析两种G蛋白偶联受体（即，β2-肾上腺素能受体和γ-氨基丁酸B型（GABAB）受体）中的应用。该方案可适用于其他膜蛋白、不同细胞模型、转染方法及标记策略。
引言
位于细胞表面的受体能够感知细胞外环境，并对多种刺激作出响应，例如气味分子、离子、小分子神经递质以及大分子蛋白质激素。细胞膜的流动性使得受体及其他膜蛋白能够在膜中移动，这对于蛋白质复合物的形成以及瞬时蛋白质-蛋白质相互作用的发生至关重要——例如受体借此组装成功能单位并将信号转导至细胞内部。例如，G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）是细胞表面受体中最大的家族1，已有研究提示其可形成二聚体或多聚体，这种现象可能参与精细调控信号转导过程，并具有重要的生理学和药理学意义2-5。
单分子显微技术具有高时空分辨率直接观测活细胞表面单个受体动态行为的巨大潜力，包括它们相互结合形成二聚体及更高级别的分子复合物6-10。与传统的生物化学和显微方法相比，该技术具有多项优势，后者通常只能反映成千上万甚至数百万分子的平均行为。
使用足够明亮且光稳定的荧光团对蛋白质进行标记，对于单分子显微镜技术至关重要。本方案利用近年来新开发的SNAP标签11，将小分子且高亮度的有机荧光团共价连接至细胞表面受体。SNAP是一种来源于人类DNA修复酶O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的20 kD蛋白标签，可与荧光团偶联的苄基鸟嘌呤（fluorophore-BG）衍生物发生不可逆标记。CLIP是基于SNAP进一步改造的标签，可被荧光团偶联的苄基胞嘧啶衍生物标记12。
本论文中报道的实验方案详细说明了如何使用小分子有机荧光染料对SNAP标记的11受体进行转染和标记，并利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在活细胞表面观察单个受体或受体复合物10。该方案可实现细胞表面蛋白在胞外SNAP标记后超过>90%的标记效率10。文中还进一步提供了如何利用单分子数据来分析受体复合物的大小和运动性，以及如何捕捉受体间瞬时相互作用的信息。整个实验流程的示意图见图1。以实例说明，本文描述了将SNAP标记的G蛋白偶联受体（GPCRs）转染至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，随后使用荧光染料-BG衍生物进行标记，并应用于受体二聚化/寡聚化的定量与动态监测。该方案可拓展至其他细胞表面蛋白和荧光标签（例如，CLIP），以及其它转染与标记方法。
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方案
1. 样品制备
- 盖玻片清洗
注意： 在通风橱中操作。- 使用洁净的镊子将玻璃盖玻片（直径 24 mm）放入可分隔单个盖玻片的盖玻片架中。
- 将装有盖玻片的架放入烧杯中，加入氯仿直至完全浸没盖玻片。用铝箔覆盖烧杯以减少挥发，并在室温下使用水浴超声仪超声处理 1 小时。取出盖玻片架，让盖玻片自然干燥。
- 重复步骤 1.1.2，但以 5 M NaOH 溶液替代氯仿。
- 将盖玻片架转移至新的烧杯中，用蒸馏水清洗三次。将清洗后的盖玻片置于盛有 100% 乙醇的玻璃细胞培养板中备用。
- 校准样品的制备
- 将荧光染料溶解于适当的溶剂中。
- 用滤膜除菌（0.22 µm）的水将荧光染料进行 1:10 系列稀释，浓度范围从 1 pM 至 1 nM。
- 取出储存在 100% 乙醇中的洁净盖玻片，用滤膜除菌水清洗。在每张洁净的盖玻片上分别点加 20 µl 不同浓度的荧光染料稀释液。在无菌罩下让盖玻片干燥。避光防尘保存至使用。这些样品用于估算单个荧光分子的荧光强度（见步骤 3）。
- 转染
- 在 37 °C、5% CO2 条件下，将 CHO 细胞培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素的 1:1 DMEM/F12 培养基中。注意： 整个实验过程中使用无酚红培养基，以最小化自发荧光。
- 从 100% 乙醇溶液中取出洁净盖玻片，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，并将每张盖玻片放入 6 孔细胞培养板的各个孔中。
- 用胰酶消化、计数并以 3 × 105 个细胞/孔的密度将 CHO 细胞接种至含盖玻片的 6 孔板中。将细胞在培养箱（37 °C，5% CO2）中培养 24 小时，使其融合度达到约 80%，此为转染的最佳细胞密度。
- 对每个孔，分别在两个含有 500 µl OptiMem 培养基的离心管中稀释 2 µg 所需质粒 DNA（e.g.，SNAP 标记的 β2-肾上腺素能受体）和 6 µl Lipofectamine 2000。室温孵育 5 分钟。
- 将步骤 1.3.4 中的两种溶液合并至同一离心管中，混匀形成转染混合物。室温孵育 20 分钟。
- 在孵育期间（步骤 1.3.5），取出 CHO 细胞，用预热（37 °C）的 PBS 清洗两次。弃去 PBS，每孔加入 1 ml 含 10% FBS 但不含抗生素的无酚红 DMEM/F12 培养基。
- 将步骤 1.3.5 中的全部转染混合物（1 ml）逐滴加入各孔中，并轻轻前后摇动培养板以确保充分混匀。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 至 4 小时，随后立即进行下一步操作。注意： 此转染条件已优化至受体密度 < 0.45 粒子/µm2，适用于单分子成像。若使用不同细胞、载体或试剂，可能需要调整条件。
- 蛋白标记
- 将 1 µl 荧光团-BG 储存液稀释于 1 ml 含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基中，使终浓度为 1 µM。从培养箱中取出转染后的细胞，用预热（37 °C）的 PBS 清洗两次。弃去 PBS，每孔加入 1 ml 1 µM 荧光团-BG 溶液，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 20 分钟。
- 孵育结束后，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基清洗细胞三次，每次清洗后在 37 °C 孵育 5 分钟。用镊子取一张含标记细胞的盖玻片，放入成像室中。
- 用 300 µl 成像缓冲液清洗两次。加入 300 µl 新鲜成像缓冲液，立即进行成像（第二部分）。
2. 图像采集
注意： 使用配备油浸高数值孔径物镜的全内反射荧光（TIRF）显微镜，例如，100倍放大倍数/1.46 数值孔径），适用的激光器 例如， 405 nm、488 nm、561 nm 和 645 nm 半导体激光器）、电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机、培养箱和温度控制系统，用于单荧光分子成像。
- 设置所需的显微镜参数， 即激光线，TIRF 角度（此参数控制隐逝场的穿透深度），曝光时间，帧率，以及每段视频的图像数量10始终保持加热器/培养箱及温度控制开启，以避免温度漂移和水分冷凝。
- 在显微镜的100倍物镜上滴加一滴镜油。将带有标记细胞的成像室置于显微镜的载物台上，使用明场照明将细胞调至焦点。
- 切换至全内反射荧光（TIRF）照明。激光功率应尽可能调低，以便寻找目标细胞，同时最大限度减少光漂白。
- 选择目标细胞并精细调节焦距。将激光功率设置为可观察到单个荧光分子的水平。采集图像序列，并将原始图像序列文件保存为 .tiff.
3. 校准（玻璃表面的单个荧光分子以及单体/二聚体受体对照）
- 按照 1.2 中所述方法，将每个校准样品组装到成像腔中。将每个样品置于显微镜下，选择包含明显分离的、以单步方式漂白的衍射极限斑点的样品。注意：这些斑点代表荧光染料的单个分子。
- 按照步骤 2 所述采集 TIRF 图像序列。重要：所有实验（包括校准实验）必须使用相同的成像参数。
- 按照 4.1–4.2 中详述的方法进行检测与追踪分析。按照 4.2.6 中所述提取每个颗粒的强度。根据这些数据，计算单个荧光分子强度的均值（µ）和标准差（σ）。
- 可选：对转染了单体细胞表面受体（例如，CD86）、其N端分别带有一个或两个拷贝的 SNAP10 并用荧光染料-BG 衍生物标记的细胞进行相同的分析。按照上述在玻片上对单个荧光分子的实验流程操作。参照 Calebiro, D. 等10 中所述方法估算标记效率。
4. 图像分析
- 图像序列准备
- 使用图像处理软件（例如., ImageJ) 以裁剪图像。
- 将各帧分别保存为独立文件 .tiff 在新文件夹中保存图像，并在每张图像上标注帧编号。
- 通过沿细胞轮廓绘制感兴趣区域（ROI）并使用以下方法测量细胞表面积 测量工具 在 ImageJ 或使用其他软件中的类似工具。利用该数值，通过将视频开始时的颗粒总数除以细胞表面积，计算颗粒密度。
- 颗粒检测与追踪
注意： 使用非商业软件，例如 u-track13，工作中 Matlab 环境，以自动检测和追踪单个受体颗粒。
注意： 的 u-track 算法基于多假设跟踪方法。该方法通过构建代价矩阵来连接各帧之间的粒子，矩阵中赋值了某一帧中的特定粒子在下一帧中对应、出现、消失或与其他粒子合并/分裂的各自概率。该方法求解全局代价最小化的方案， 即，最终选择概率最高的路径。这还能追踪暂时消失的粒子，这是由荧光分子闪烁引起的一种典型现象。最新版本的 u-track (2.1.0) 具有图形用户界面，可简化这些分析的执行。- 从 Matlab 命令提示符中输入“movieSelectorGUI”以打开视频选择界面。按照说明，从先前保存的独立图像开始创建新的视频数据库（参见4.1.2）。
- 提供用于粒子检测与追踪所需的像素尺寸（nm）、时间间隔（秒）、数值孔径、相机位深以及荧光染料的发射波长。保存视频数据库。
- 从影片选择界面运行分析，选择“单颗粒”作为对象类型。此时将出现一个新窗口，可在其中定义用于粒子检测和追踪的参数。首先使用默认参数，随后如果检测和/或追踪质量不理想，可调整这些参数（例如，部分颗粒未被检测到或轨迹出现断裂。 可选： 在跟踪设置下，勾选“将追踪结果导出为矩阵格式”用于将所有粒子的坐标和振幅存储在一个矩阵中（字段名为“追踪的特色信息”）。有关这些参数的详细描述，请参见 u-track 记录
- 运行检测算法。该算法可自动确定每个衍射极限光斑的位置及其相对于背景的强度即，通过在局部强度极大值周围拟合标准差等于显微镜点扩散函数的二维高斯函数来定位单个受体/受体复合物。然后运行追踪算法。将分析结果存储在 .mat 文件。
- 使用“视频查看器”常规，包含在 u-track 使用软件包或类似的自定义工具来可视化轨迹，并检查检测与追踪的质量。
- 打开 .mat 文件以查看位置和振幅（即., 被追踪粒子在每一帧中的强度）。步骤 4.2.4 生成的数据包含在 tracksFinal 数组的 tracksCoordAmpCG 字段和/或 trackedFeaturedInfo 中。根据检测到的粒子总数，将其除以在步骤 4.1.3 中测得的细胞表面积，计算粒子密度。
- 可选： 利用随时间变化的粒子坐标（见4.2.6）分析受体粒子的运动。计算均方位移（MSD）和扩散系数（D）使用 Matlab 或类似软件。针对每个粒子和每个时间间隔（Δt）考虑在内，使用以下公式计算均方位移（MSD）：
其中 Δt 是帧数时间间隔， N 为所分析的步数，x 和 y 分别表示粒子在由索引指定的帧中的 x 和 y 坐标。利用均方位移（MSD）随时间变化的曲线图来评估特定粒子的运动类型：线性关系表明为自由扩散即，布朗运动），正曲率（即，曲线呈抛物线形状）表明存在定向运动，而负曲率则提示受限运动14对于自由扩散的粒子，通过以下方程拟合测得的均方位移（MSD）数据，计算每个粒子的扩散系数（D）：
- 采用高斯拟合方法计算粒径
注意： 一旦已知校准样品（玻璃上的单个荧光团和/或荧光标记的单体受体）的强度分布，即可对图像序列起始时的颗粒强度分布进行混合高斯拟合，以确定受体复合物的大小即每颗粒的受体数量10使用以下方法进行这些分析 Matlab 或类似软件。- 通过计算每个粒子从第一帧到其强度首次发生变化（大多数情况下由于光漂白导致强度下降）之前各帧的平均强度，来确定每个粒子的强度。
- 根据以下方程进行高斯混合拟合：
其中 φ(i是具有特定强度的颗粒的频率 i, n 是组件编号， αn 是影响组分峰高的一个参数 n, μ 和 σ 是参考单个荧光分子强度的平均值和标准差（按步骤3所述方法计算得出）。 注意：确定组分的最大数量（n最大值）通过逐步增加每个图像序列的 n最大 直到添加组分不再产生统计学上更优的拟合效果，以 F-测试。 - 可选： 对视频最后几帧获得的强度分布进行混合高斯拟合（例如，400 帧序列的最后 60 帧）。替换 μ 和 σ 根据拟合后获得的数值，对这些参数提供更精确的估计，并重复步骤 4.3.2。
- 计算混合高斯拟合中每个组分的曲线下面积（AUC）。通过将每个组分的AUC值除以整个分布的AUC值，计算不同大小受体颗粒（即单体、二聚体、三聚体等）的相对丰度。
- 可选： 利用不同细胞的数据及相应的颗粒密度（按4.2.6节所述方法计算），绘制颗粒大小分布与颗粒密度相关联的图谱10.
- 使用步进拟合方法计算粒径
注意： 使用阶跃拟合分析作为确定受体复合物大小的替代方法10单个荧光团的光诱导破坏（光漂白）会导致其瞬时消失，因此含有该荧光团的颗粒也随之消失——这一现象构成了本分析的基础。 n 荧光染料预计会逐渐漂白，产生一个强度轮廓，其具有 n 步骤。- 从每个颗粒中提取强度分布曲线 .mat 文件由生成 u-track 或类似的检测/追踪软件（参见 4.2.6）。
- 使用步进拟合算法（例如参考文献10中提出的方法）对每个粒子的漂白步数进行计数。
- 可选：利用结果生成分布图，显示不同大小受体颗粒的相对丰度，并如前所述将它们与颗粒密度相关联（参见4.3节混合高斯拟合的结果）。
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结果
所述方案可应用于多种不同的膜蛋白。例如，已有研究报道了β2-肾上腺素能受体和GABAB受体的代表性实验结果10。由于单分子荧光信号较弱，最大限度降低背景荧光是获得成功结果的第一步关键操作。因此，必须使用经过充分清洗的盖玻片（图2A），并尽量减少样品的自发荧光（例如，使用不含酚红的培养基）。下一步是测定单个荧光分子的荧光强度，可通过在洁净盖玻片上点样单个荧光分子并成像实现（图2B）。通常采用荧光分子的系列稀释液，以筛选出最佳分析条件，即能够产生分布均匀且彼此分离良好的单荧光分子的浓度。还可通过成像单体对照蛋白（例如，用荧光标记的BG衍生物标记NAP标签CD86受体）进行额外对照实验。完成上述初步对照与校准后，即可开始正式实验。图3A展示了一个转染了SNAP标签β2-肾上腺素能受体并用荧光标记BG衍生物染色的细胞的典型TIRF图像序列的第一帧图像，其中亮点代表单个受体或受体复合物。该图像还展示了适用于...
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讨论
本方案可实现对细胞表面受体复合物的空间分布、运动性及尺寸进行单分子水平的分析。与荧光蛋白标记相比，使用小分子有机荧光染料具有更亮的荧光信号和更高的光稳定性，因而更适合对单个受体颗粒进行长时间的可视化观察。由于该方法可实现极低的表达水平（<0.45 个受体颗粒/µm2），因此可在不超过生理表达密度的条件下分析受体及其他膜蛋白的特性。此外，还可分析受体在激动剂刺激10或其他干预措施（例如模拟病理状态）下的变化。同时，由于采用SNAP/CLIP标签11,12的标记策略具有高度灵活性，可根据具体需求选择不同的荧光染料——值得注意的是，联合使用SNAP和CLIP标签可实现双色实验，e.g.，用于观察两个相互作用蛋白之间的共定位。最后，本方案在多个环节均可进行修改，例如更换不同类型的细胞、转染方法或标记策略。
关键步骤包括尽量减少背景干扰和自发荧光（通过使用经过充分清洗的盖玻片、不含酚红的培养基以及过滤的溶液），优化转染条件（例如，质粒DNA用量及转染后时间）以实现极低表达水平，高效标...
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本方案的开发得到了欧洲研究理事会（M.J.L. 获得高级资助项目 TOPAS）和德国研究基金会（D.C. 获得资助项目 CA 1014/1-1，M.J.L. 获得 SFB487 项目资助）的资助。T.S. 受亚历山大·冯·洪堡基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯仿 | AppliChem GmbH | A1585 | 警告：有毒且具刺激性物质，可能具有致癌性 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 警告：强碱性且具有强腐蚀性的试剂 |
| 无水乙醇 | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| 玻璃盖玻片 | 马里恩费尔德-优质 | 111640 | 24 mm 直径，0.13–0.16 mm 厚度 |
| 0.2 mm 无菌滤器 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO细胞 | ATCC，美国 | ATCC CCL-61 | 中国仓鼠卵巢细胞系 |
| 6孔细胞培养板 | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 培养基 | GIBCO，Life Technologies | 11039-021 | 无酚红培养基 |
| 胎牛血清 | Biochrom | S 0115 | |
| 青霉素-链霉素 | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen，Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Invitrogen，Life Technologies | 31985-047 | |
| 荧光团偶联的苄基鸟嘌呤 | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647。用DMSO配制1 mM的储存液。-20℃保存。°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| 成像缓冲液： | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl₂2，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，pH 7.3，经无菌滤膜过滤 | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl₂2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| 成像室 | 分子探针，Life Technologies | A-7816 | Attofluor 细胞培养皿，用于显微镜观察 |
| 全内反射荧光显微镜 | Leica | 型号：DMI6000B | |
| 全内反射荧光物镜 | Leica | 11 506 249 | HCX PL APO 100x/1.46 油 CORR |
| EM-CCD相机 | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| 温度控制器 | Pecon | Tempcontrol 37-2 数字型 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院，美国 | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track 软件 | 美国哈佛医学院细胞生物学系计算细胞生物学实验室 | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab 软件 | 美国 MathWorks 公司 |
参考文献
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