受体动力学通过单分子荧光显微镜的高分辨率时空分析

摘要

该协议描述了如何使用全内反射荧光显微镜来可视化和跟踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体横向移动性、受体复合物的大小以及可视化瞬时受体-受体相互作用。该方案可以扩展到其他膜蛋白。

摘要

单分子显微术正在成为一个强大的方法来分析信号分子，特别是关于那些方面（ 如 。，动力学，不同的国家和人群，短暂的相互作用共存），它们通常隐藏在合奏测量，如行为那些与标准生化或显微镜方法获得。因此，动态事件，如受体 - 受体相互作用，可以实时跟踪与高时空分辨率的活细胞。这个协议描述的基础上以小而明亮的有机荧光团和全内反射荧光（TIRF）显微镜直接可视化单一受体的活细胞的表面上的标签的方法。这种方法允许一个精确定位的受体，测定受体复合物的大小，并捕捉动态事件，如瞬时受体 - 受体相互作用。该协议提供了如何PE的详细说明rform单分子实验，包括样品制备，图像采集和图像分析。作为一个例子，这种方法的应用，分析2的G-蛋白偶联受体， 即 _，，β2 -肾上腺素能受体和γ-氨基丁酸B型（GABA _B）受体，报道。该协议可以适于其他膜蛋白和不同的细胞模型，转染方法和标记策略。

引言

位于细胞表面上的受体感知细胞外环境和各种刺激，如气味分子，离子，小神经递质和大蛋白激素的反应。细胞膜的流体性质允许受体和其他膜蛋白的移动。这是为蛋白质复合物和瞬时蛋白质 - 蛋白质相互作用，如那些用于通过受体组装成的功能单元和信号转导到细胞内发生的形成是必不可少的。例如，G-蛋白偶联受体（GPCR），它构成细胞表面受体¹的最大家族，已经提出了以形成di-/oligomers，这似乎是参与信号转导的微调，调节和可能有重要的生理和药理后果^2-5。

单分子显微镜具有高spatiotemp直接可视化的巨大潜力口服分辨率位于活细胞，包括其相关联的表面上的单个受体的动态行为，以形成二聚体和更高阶的分子复合物^6-10。这比标准的生化和显微镜方法，通常报告的分子数千或数百万的平均行为提供了几个优点。

具有足够明亮，耐光荧光蛋白标记是必不可少的单分子显微镜。该协议需要在近期推出SNAP标签¹¹的优势，以共价连接的小而明亮的有机荧光细胞表面受体。 SNAP是从人类的DNA修复酶的O ⁶ -烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，它可以不可逆地标记有荧光团标记的苄基鸟嘌呤（荧光团- BG）衍生物衍生的20 kD蛋白标记。 CLIP，从SNAP派生的进一步工程化标签，可以代替标记荧光基团-Conjugated苄基胞嘧啶衍生物

方案

1，样品制备

1. 清洗盖玻片
   注意：在通风橱中操作。
   1. 用干净的镊子把盖玻片（直径为24毫米）插入分隔各个盖玻片盖玻片持有人。
   2. 把夹持器与盖玻片到烧杯中，并加入氯仿，直到盖玻片覆盖。用铝箔覆盖烧杯以减少在超声波仪浴1小时，在室温下蒸发，并超声处理。就拿盖玻片架从烧杯，让盖玻片干。
   3. 重复步骤1.1.2用5M NaOH溶液代替氯仿。
   4. 取盖玻片夹持器进入一个新的烧杯中，并洗涤3次，用蒸馏水。把清洁的盖玻片的玻璃细胞培养板中填充有100％的乙醇。
2. 校准样品的制备
   1. 在适当的溶剂中溶解的荧光染料。
   2. 制备荧光染料测距1:10系列稀释下午1时至1纳米的过滤除菌（0.22微米）的水。
   3. 取存储在100％乙醇清洗盖玻片和洗涤用过滤灭菌的水。现货20微升在一个单独的清洗盖玻片每个荧光染料稀释。让盖玻片下无菌罩干燥。保护盖玻片从光线和灰尘，直到使用。使用这些样本来估计单分子荧光的强度（参见步骤3）。
3. 转染
   1. 培养CHO细胞以1:1的Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）补充有10％胎牛血清（FBS），100 U / ml青霉素和100微克/毫升链霉素，在37℃，在5％的CO ₂ 注：使用无酚红的媒体在整....

结果

所描述的协议可以被应用到各种不同的膜蛋白。作为一个例子，与_β2 -肾上腺素能受体和GABA受体_乙获得代表性结果列^10。由于从单个分子的荧光信号弱，尽量减少背景荧光是第一关键步骤，成功的结果。因此，要广泛使用清洁的盖玻片（ 图2A），以及最大限度地减少样品自发荧光（ 例如 ，通过使用无酚红培养基）是很重要的。下一个步骤是确定单个荧光分子的荧光强度。这可以由成像单荧光点在一个干净的盖玻片（ 图2B）来实现。通常情况下，荧光团的系列稀释来选择用于分析的最佳条件， 即 ，，能产生良好的分离，并均匀分布的单荧光团浓度。其他续ROLS可以由成像控制单体蛋白来进行， 例如 ，标有荧光团-BG衍生物NAP-标记的CD86受体。一旦这些初步的控制和校准已经完成，实际的实验就可以开始。 图3A示出的小区的转染SNAP-标签的_β2 -肾上腺素能受体和标记有荧光团-BG衍生物典型的全内反射荧光图像序列的第一帧。这些点代表.......

讨论

所描述的协议允许的空间布置，流动性和细胞表面受体复合物的大小在单分子水平的分析。相比，使用荧光蛋白，具有小的有机荧光团，它们是明亮，更耐光的标签，具有允许单个受体粒子的扩展可视化的优点。由于非常低的表达水平得以实现（<0.45受体粒子^{个/μm2），}受体和其他膜蛋白的性质可以在密度不超过生理相关的分析。此外，受体刺激激动剂¹⁰或其它操作的影响，例如，旨在再现一种病理状况，可以进行分析。此外，由于标签的策略，SNAP / CLIP标签^11,12的灵活性，不同的荧光团可根据自己的具体需求使用-值得注意的是，SNAP的结合和CLIP的标签可以被用来进行两色实验， 例如 ，来观察两个相互作用的蛋白之间的共定位。最后，这个协议可以在几个点通过使用不同的细胞，转染方法和标记策略修改，例如。

关键的步骤包括的背景和自发荧光的最小化（通过使用大量清洗盖玻片，无酚红的媒体，并过滤溶液）的转染条件下（转染后，例如 ，质粒DNA的量和时间等）的优化，以实现极低的表达水平，高效的标签和一个明亮，足够耐.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Chloroform	AppliChem GmbH	A1585	注意：有毒和刺激性物质以及可能的致癌物
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	注意：强碱和强腐蚀性试剂
无水乙醇	Sigma-Aldrich	32205
玻璃盖玻片	Marienfeld-Superior	111640	直径 24 mm，厚度 0.13-0.16 mm
无菌过滤器	Sarstedt	83.1826.001
CHO 细胞	ATCC，美国	ATCC CCL-61	中国仓鼠卵巢细胞系
6 孔细胞培养板	Nunc	140675
DMEM/F-12 培养基	GIBCO，Life Technologies	11039-021	不含酚红的培养基
胎牛血清	Biochrom	S 0115
青霉素 - 链霉素	Pan Biotech GmbH	P06-07 100
胰蛋白酶-EDTA	Pan Biotech GmbH	P10-23100
Lipofectamine 2000	Invitrogen，Life Technologies	11668-019
Opti-MEM I 减血清培养基	Invitrogen，Life Technologies	31985-047
荧光团偶联的苄基鸟嘌呤	新英格兰生物实验室	S9136S	SNAP-Surface Alexa Fluor 647。在 DMSO 中制备 1 mM 储备溶液。储存在 -20°C 下。
DMSO	AppliChem GmbH	A1584
成像缓冲液：			137 mM NaCl、5.4 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES，pH 7.3，无菌过滤
NaCl	AppliChem GmbH	A1371
KCl	AppliChem GmbH	A3582
CaCl2	AppliChem GmbH	A2303
MgCl2	AppliChem GmbH	A3618
HEPES	AppliChem GmbH	A3724
成像室	分子探针，Life Technologies	A-7816	Attofluor 细胞室，用于显微镜
TIRF-M	徕卡		型号：DMI6000B
TIRF 物镜	徕卡	11 506 249	HCX PL Apo 100x/1.46 油 CORR
EM-CCD 相机	Roper Scientific		Photometrics Cascade 512B
温度控制器	Pecon		Tempcontrol 37-2 数字
成像软件	美国国立卫生研究院		http://rsbweb.nih.gov/ij
u-track 软件 美国		哈佛医学院细胞生物学系计算细胞生物学实验室	http://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab软件	The MathWorks， 美国