在改进的双光子显微镜中进行三维轨道追踪：用于细胞内囊泡追踪的应用

摘要

在本视频方案中，我们使用经改造的双光子显微镜结合轨道追踪方法，对活细胞内荧光标记的溶酶体进行高速、三维的动态追踪。

摘要

本视频方案的目的是介绍如何使用经过改造的双光子显微镜进行三维荧光轨道粒子追踪实验并对其进行分析¹。与传统方法（基于逐行扫描或宽场图像堆栈）不同，三维轨道追踪技术能够在数百微米的尺度上，以高空间分辨率（10 nm 精度）和高时间分辨率（50 Hz 响应频率），对运动中的荧光粒子进行三维定位与动态追踪²。该方法基于一种反馈算法，通过控制双光子激光扫描显微镜的硬件，使扫描光束围绕待追踪目标做圆形轨道运动：反馈机制通过调节扫描光束的位移，将荧光目标始终保持在视场中心^3-5。为了展示该技术的优势，我们对活细胞内快速移动的细胞器——溶酶体进行了追踪^6,7。细胞按照标准流程接种，并使用商业化的溶酶体染料进行标记。本文简要介绍了硬件配置，并更详细地阐述了控制软件，以实现在活细胞内进行三维轨道追踪实验。我们详细讨论了控制扫描显微镜所需的各项参数，以及如何实现光束围绕粒子进行闭合轨道运动。最后，我们展示了该方法如何有效用于在活细胞三维空间中追踪标记溶酶体沿微管的快速运动。溶酶体的移动速度通常在 0.4–0.5 µm/sec 范围内，表现出沿微管网络的定向运动特征⁸。

引言

迄今为止，已开发出大量方法，利用显微镜在三维空间中追踪荧光颗粒。大多数方法依赖于高速相机，这类相机通常适用于二维追踪，再结合对显微镜发射光路的定制化改造，以实现轴向（z轴）方向的追踪。激光扫描显微镜（包括共聚焦或双光子显微镜）传统上可通过连续采集z层图像序列（z-stacks）来追踪荧光颗粒，但该过程通常耗时较长，只有在主动反馈机制将待追踪颗粒维持在较小光栅扫描成像区域中心时，才能获得较好的时间分辨率（10 Hz）²。

锁定粒子是轨道追踪方法的基础。该方法并非采用光栅扫描，而是在荧光粒子周围执行圆形轨道扫描。通过检测轨道上荧光强度的变化，可精确定位粒子的位置⁴。

粒子的定位位置可用于触发显微镜扫描器，使轨道重新居中于粒子位置。显微镜的检流计扫描器由模拟电压驱动，该电压的交流分量可实现聚焦激光束的轨道扫描。 即 一个正弦波和一个余弦波施加到 X 和 Y 扫描镜将能够执行圆形轨道扫描。信号的直流偏置可用于改变轨道中心的位置。一旦确定了轨道周期并配置了交流信号的波形，反馈系统只需更新信号的直流分量即可。

需要一种能够读取探测器收集的荧光信号的软件，以控制扫描仪和探测器，计算粒子的位置并更新直流偏置。为了实现成功的反馈成像，必须仔细选择轨道参数（大小和时序），并根据需要追踪的荧光粒子的特性来调整这些参数。

该技术的物理和数学基础此前已针对二维和三维应用进行了描述^4,5。在本实验方案中，我们简要介绍了实验装置的主要硬件组件，并更详细地说明了参数选择以及典型实验所需的样品制备步骤，从而能够在活细胞内以高时间分辨率追踪溶酶体的位移。

方案

1. 样品制备

1. 使用添加10%胎牛血清以及100 I.U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素的DMEM培养基，在组织培养瓶中培养CHOK1细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育。
2. 收集CHOK1细胞，并将其接种至直径为14 mm、表面厚度为0.16 mm的微孔板中。接种密度以成像所需的最适密度为宜，约为60–70%融合度。
3. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。用HBSS（Hank平衡盐溶液）洗涤细胞三次，然后将细胞置于含有50 nM Lysotracker DND26绿色染料和150 nM tubulin tracker绿色染料的溶液中，在37 °C孵育1 小时。可选步骤：在孵育前，额外使用一种线粒体基质染色染料（25 nM）进行染色。
4. 用HBSS洗涤细胞三次，以去除未结合的染料。成像前加入新鲜的DMEM生长培养基。

2. 显微镜配置

视频方案中所述用于粒子追踪的显微镜是在市售倒置显微镜的框架上组装而成的（图4）。然而，目前已有可用于三维轨道粒子追踪的商用模块。

1. 使用Coherent Chameleon-Ultra II Ti:Sa飞秒激光激发光源，其输出波长可调范围为690 nm-1,040 nm。
2. 使用镀红外膜的反射镜将激光束对准显微镜的后端端口。通过旋转的半波片和方解石线性偏振器对激光束进行衰减。调节衰减程度，使样品处的平均功率保持在0.5至2 mW之间。
   注意：激光束由一对由伺服电机驱动的振镜反射，从而可在样品平面内控制聚焦光束的位置和轨迹。在典型配置中，从振镜出射的准直激光束经扩束镜（10倍）扩束后，经短通二向色镜反射，进入显微镜物镜的后端。
3. 在光路中放置高数值孔径的水浸物镜（60倍，NA 1.2），以收集来自样品的荧光信号。根据所需的一通道或双通道检测模式，选择相应的荧光滤光片组。使用发射带通滤光片进一步筛选发射荧光的光谱范围。
4. 将样品置于电动载物台上，并使用物镜压电控制器调节物镜的精细运动。
5. 将滤光片组输出的光信号导入光电倍增管，信号经甄别后传送至数字I/O数据采集卡。
   注意：计算机生成的波形作为I/O卡的模拟输出，提供给扫描器的控制电子元件。光电倍增管的光子计数输入信号以及对扫描器的输出信号，均由实验室荧光动力学SimFCS软件通过I/O卡进行测量与控制。

3. 成像

1. 将细胞置于载物台上，使用透射光照明进行对焦。
2. 切换至光栅扫描成像模式，以识别已摄取染料的细胞并观察其下方的微管结构。确定存在囊泡运动的初始区域。
3. 一旦识别到孤立的囊泡，设置以下参数以进行轨道追踪：
   1. 选择轨道半径，根据被追踪粒子的大小设定圆形扫描的范围。对于点光源，将轨道半径设为激发光束点扩散函数（PSF）的束腰尺寸，以最大化灵敏度和响应。
   2. 设定轴向距离，用于定义沿轴向方向定位粒子位置时所采用的两个轨道之间的间距。将轴向距离设为PSF束腰的1.5–3倍。
   3. 根据粒子的亮度设定驻留时间，以确定在轨道每个点上停留的时间，该时间也将决定光漂白速率。使用10–100 µsec之间的驻留时间。
   4. 将每个轨道中的采样点数设为64或128，使轨道周期处于4–32 msec量级，从而提供高时间分辨率以确定粒子位置。
4. 通过图形用户界面在光栅扫描图像中用光标选择粒子，调节发送至镜片的直流偏置信号，使光束中心对准粒子。
5. 将显微镜模式从光栅成像切换至轨道扫描，开始追踪。
6. 启动反馈系统并开始数据采集。

4. 轨迹分析

1. 使用软件以“强度地毯图”的形式显示沿轨道每个点及每个时间点收集的荧光信号。通过强度地毯图获取的信号强度信息可反映颗粒与其他明亮物体之间的相互作用。使用软件同时显示轨迹信息（即 随时间变化的直流位移 x,y 扫描仪及 z-压电) 以及随时间以时间序列形式记录的光电倍增管采集的荧光强度。
2. 利用时间序列表示和“强度地毯图”信息，仅选择轨迹中的感兴趣区域。
3. 使用软件显示所选粒子轨迹部分的二维投影。选择适当的控制选项，根据粒子荧光强度对轨迹进行颜色编码。
4. 选择在3D中显示粒子轨迹的选项，并根据荧光强度对其进行颜色编码。使用控件旋转3D轨迹，以可视化溶酶体沿微管运动的特征。

结果

根据本实验方案，可利用改进的双光子显微镜在活细胞内快速进行三维单粒子追踪，以监测荧光标记的溶酶体的位移。实验内容包括在内体成熟过程之后，追踪细胞内单个独立溶酶体的运动⁹。溶酶体使用绿色荧光染料进行染色，并在930 nm波长下利用双光子激发进行激发。我们的数据显示，可获得时间分辨率为32毫秒的x,y,z三维位移轨迹（图 1a）。地毯图分析展示了随时间变化的每条轨道上的荧光强度记录（图 1b）。在追踪过程中，可同时记录发射荧光的积分强度（图 2a）。重建的三维轨迹显示出定向运动，这与囊泡沿微管网络移动的行为相符。此外，可将三维轨迹与周围区域的光栅扫描图像进行关联（图 2b），从而确认该粒子沿微管束方向的运动。

此外，细胞还用红色标记物对线粒体进行染色，以记录囊泡在运动过程中与这些细胞器的潜在相互作用。可以将细胞内颗粒的三维轨迹（图 3a）与线粒体示踪剂荧光发射记录的强度轨迹图（<...

讨论

尽管近年来荧光显微技术与仪器取得了巨大进展，但在三维空间中以高时间分辨率获取荧光粒子的运动轨迹仍然是该领域的一大挑战。虽然在二维条件下对粒子进行高时间分辨率追踪已得以实现，但将其扩展至轴向通常会导致系统频率响应显著下降¹⁰。

在本视频实验方案中，我们重点演示了使用双光子显微镜在活细胞内以高时间分辨率（本实验为32毫秒）对单个粒子进行三维追踪的示范性应用。实施此类实验所需的装置在开展激光扫描显微成像的实验室中通常已具备。用于三维轨道追踪的仪器附加组件及其控制软件在市场上均有售，适用于奥林巴斯（Olympus）等厂商生产的商用激光扫描显微镜。若条件允许，采用脉冲式高功率红外激光光源在实验设计中具有优势，因其无需对发射的荧光进行去扫描。此外，过去的研究已证明，在特定条件下¹¹，由于离焦荧光和光漂白现象减少，红外辐照对细胞的损伤更小。

尽管可以使用高灵敏度相机对荧光颗粒进行二维快速追踪，但缺乏三维信息往往限制了对轨迹数据生物物理意义的准确解读。例如，沿微管运动的囊泡经常遇到微管交叉区域

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
微管追踪绿染料	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Coherent Chamelon-超二代 TI	相干的
格兰-泰勒方解石偏振器	Melles Griot	03PTA001
检流计电机镜	剑桥科技	M 6350
二向色镜	Chroma Technologies	700 DCSPXR
电动载物台	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
光电倍增管	滨松	H7422P-40
数据采集卡	IO 技术	PCI 1128-4000
成像软件	LFD	全球图像-SimFCS