本文介绍了一种神经元培养系统，可用于获取大量高纯度的轴突样本，以进行生物化学和免疫细胞化学分析。该技术将有助于更深入地理解正常轴突生理功能以及导致神经退行性变的信号通路。
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本文内容
摘要
摘要
神经元轴突通过特定机制介导其延伸、维持完整性并诱导退变。这些事件之间需要保持适当的平衡，才能形成具有功能的神经环路。本文所述的实验方案介绍如何使用带有微孔膜（滤膜）的细胞培养插入式小室，以获得大量适用于常规生物化学或免疫细胞化学技术检测的高纯度轴突样本。本方法将利用胚胎背根神经节的组织块培养模型，展示该滤膜插入式小室在发育性修剪和沃勒变性（Wallerian degeneration）研究中的应用。在多种神经退行性疾病中，轴突的完整性与功能均受到损害。事实上，目前已有明确证据表明，在多种神经退行性疾病进程中，轴突功能障碍的出现远早于神经元胞体的丢失，提示这些疾病主要靶向作用于轴突特异性过程。通过获取高纯度的轴突样本，并结合分子与生物化学技术进行分析，该技术有望为调控轴突生理与病理生理机制的研究提供新的见解，进而加深我们对神经系统退行性疾病驱动机制的理解。
引言
神经元的轴突区室在功能上表现出与胞体-树突区室高度的独立性。在投射神经元中，轴突含有大部分的神经元蛋白1,2。近年来，由于研究发现轴突功能障碍在神经退行性疾病和神经精神疾病中往往是早期的共同特征，轴突生理学与病理生理学的研究在神经科学领域日益受到重视3。因此，深入理解正常和病理条件下仅限于轴突的特异性机制，有望揭示导致功能障碍的早期事件。
本实验方案描述了如何使用带有微孔膜（滤膜）的培养插件来获取大量适用于生物化学和免疫细胞化学分析的纯轴突材料。利用滤膜插件研究轴突生物学的方法最初由 Steward 及其同事4建立，并由 Twiss 及其同事5进一步优化为当前的形式。目前，多个研究团队在探索轴突和树突生物学不同方面时均采用该技术，根据所研究的神经元群体、施加的处理方式以及所用的生物化学分析类型，对该方法进行了细微调整6-9。本方案无意涵盖所有可能的应用变体，而是提供一种适用于大多数情况的简化操作流程。特别地，此处描述的方案采用三重包被法，可最大化生物化学分析所需的轴突产量，尤其适用于研究轴突变性——文献中报道的其他包被方法产生的轴突较少，且在缺乏营养因子时更易回缩并快速发生变性9。
在此过程中，神经元胞体保留在滤膜上表面并保持分离状态，而轴突则穿过滤膜孔隙，在其下表面生长。生长于滤膜下表面的纯化轴突（不含胶质细胞及神经元胞体污染）可被收集用于生化分析，或进行固定处理 原位 并通过免疫细胞化学技术进行检测9该实验方法依赖于使用背根神经节（DRG）的胚胎期感觉神经元。由于这些细胞的神经突具有快速且强劲的生长能力，胚胎期DRG被广泛用于轴突生物学的研究。 体外 在维持于神经生长因子（NGF）条件下时，背根神经节（DRG）神经元能够存活，而一旦缺乏该因子则会迅速发生变性。此外，DRG神经元无树突结构，因此通过该方法获取的所有神经突均为纯轴突。
与用于研究轴突的其他方法相比，滤器插入装置具有显著优势。依赖显微镜技术来区分胞体与轴突中发生的生物学过程的研究，所提供的生化信息十分有限。例如，区室化培养系统（如 Campenot 培养室10 或微流控装置11）虽适用于成像分析以及对细胞不同区室进行差异化处理，但仅能获得少量轴突材料，因而无法满足需要相对大量样本的生化分析需求。此外，这些系统的使用需要经过大量培训，并依赖专用设备，且操作过程耗时。另一种常用于从外植体中分离轴突的方法是在收集轴突样本前，手动去除外植体中心区域（包含神经元胞体）。尽管该方法可获得较大量的富集轴突样品，但这些轴突可能被胶质细胞包裹；并且连续从6个孔中快速去除20个外植体的胞体（例如一个最小规模实验的示例）操作繁琐，接近实际可行性的极限。
相比之下，本文介绍的方法能够获得大量且高纯度的轴突样品，这些样品几乎可以用于任何常用于分析全细胞裂解液的生化技术，如蛋白质印迹（western blot）、免疫沉淀6、RNA 印迹5、质谱分析6、RNA 纯化7,12,13等。此外，该方案还可应用于免疫荧光（IF）技术，因为可以固定生长在滤膜底侧的轴突，进而通过免疫荧光进行观察。该方法极大地促进了对轴突特异性过程的分析，因为最终样品中不含细胞体。这一优势十分显著，因为细胞体通常会产生较强的免疫荧光信号，往往会干扰对来自轴突等细小结构的微弱信号的检测与分析。
描述了用于研究轴突变性的两种培养方法的应用：一种是发育性修剪模型，另一种是损伤诱导变性模型（通常称为Wallerian变性）。发育性修剪模型的建立基于以下事实：感觉神经元 体内 竞争有限的靶源性NGF，未能获得足够神经营养支持的神经元发生退变14。这一现象可通过从培养基中撤除NGF在胚胎背根神经节（DRG）培养物中模拟，其过程与体内情况相似 体内，引发轴突变性，随后导致胞体破坏。为建立Wallerian变性模型，可刮除滤膜上层含有胞体的部分。已生长至滤膜下层的轴突便在物理上与胞体分离，继而经历一种快速且特征明确的变性过程，即Wallerian变性。15，以A. Waller命名，他于1850年首次报道了这一现象16.
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方案
注意：以下操作步骤均遵循加拿大动物护理委员会批准的指南。在操作过程中，将尽一切努力将动物的疼痛和痛苦降至最低。
1. 滤膜包被
注意：当培养滤膜插件放入多孔板的孔中时，会形成两个区室：上区室为插件上方的区域，下区室为插件下方的区域 图1A.a-b。外植体接种于上区室，附着在滤膜的上表面；许多轴突会穿过滤膜，在滤膜的下表面及下区室内延伸生长 图1A.c。标准操作体积（即用于添加包被液、洗涤液、培养基等）为下区室2 ml，上区室1 ml，在本方案中统称为“标准体积”。添加溶液时应先从下区室开始，将移液器吸头插入插件与孔壁之间的缝隙中加样。同时，在加样过程中应将插件向一侧倾斜，以防止在滤膜底部产生气泡。
- 在铺板前一天开始包被滤膜。在无菌细胞培养超净台中，将24 mm的滤膜插入物放入6孔接收板中。用标准体积的聚-D-赖氨酸水溶液（1 mg/ml）孵育插入物1小时 ，室温 进行：底部室加2 ml，顶部室加1 ml。
- 吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用去离子水冲洗一次。吸除水后，盖上盖子，将培养板留在超净台中过夜干燥。在吸取液体时，务必清除滞留在滤膜正下方的残留液滴。
- 次日早晨，将层粘连蛋白溶于水中（10 µg/ml），混匀并预热至37 °C。将插入物在细胞培养箱中于37 °C条件下与层粘连蛋白孵育1小时，使用标准体积。
- 吸除层粘连蛋白溶液，加入溶于水中的胶原蛋白（0.1 mg/ml），在室温下孵育1小时。此步骤中，底部室和顶部室各加2 ml。
- 吸除胶原蛋白溶液，并用无菌水洗涤一次。此时滤膜已准备好用于加入培养基和背根神经节（DRG）外植体，具体操作见步骤3。
2. 解剖胚胎背根神经节（DRG）外植体
- 通过腹腔注射阿佛丁（Avertin，250 mg/kg）麻醉一只妊娠13天的雌性小鼠。等待10–15分钟，并检查角膜反射和足底回缩反射是否消失。确认反射消失后，实施颈椎脱位。
- 使用70%乙醇对所有手术器械及雌鼠腹部进行消毒。待器械晾干后，提起腹部皮肤，切开皮肤和肌肉层以暴露腹腔。
- 将子宫从宫颈和卵巢处分离后取出。在无菌操作台中，用剪刀将胚胎从子宫中取出，并收集至盛有冰上预冷的L15培养基的培养皿中，保持冰上放置。
注意：有关获取妊娠13天胚胎的详细操作，请参见此前的技术报告17,18。 - 在显微镜下将胚胎侧放，使用小型弹簧剪剪除头部。沿身体两侧剪开，去除胸部、腹部、四肢和尾部。保留含有脊柱的背部组织，腹面朝上放置，并清除所有内脏器官。
- 使用小型弹簧剪沿腹侧中线剪开脊柱，以完全暴露脊髓。用一对镊子（#3）固定尸体，另一对镊子夹住脊髓最前端部位，将其固定。
- 缓慢而轻柔地将脊髓从椎管中拉出，使用超细镊子（#5）夹取背根神经节（DRGs）并从脊髓上分离。将分离出的DRGs聚集于培养皿底部。
- 使用剪去尖端以扩大开口的200 µl移液器吸头吸取聚集的DRGs。将DRGs转移至离心管中，冰上保存直至完成全部DRG收集。
注意：推荐使用白色/透明吸头，因为DRGs不易黏附于此类吸头内壁（相较于标准黄色吸头）。使用前用培养基冲洗吸头可进一步防止DRGs黏附于管壁。
3. 在滤膜上接种和培养背根神经节组织块
- 使用标准体积，将37 °C的完全DRG培养基加入包被的插入式培养小室中。在底部隔室的培养基中补充15 ng/ml的NGF，顶部隔室则不添加NGF。
注意：尽管NGF能够有效穿过滤膜并在数小时内达到浓度平衡，但我们观察到，在接种前直接将NGF加入底部隔室，可显著增加滤膜底面的轴突产量。 - 使用1,000 µl移液枪，将枪头末端剪去一部分以扩大开口，将DRG从离心管转移至滤膜上。
- 在吸取DRG前，先将培养基在枪头中上下吹打2–3次 ，以防止DRG黏附在枪头内壁。同一枪头可用于所有孔。使用无色枪头（而非标准蓝色枪头）可减少DRG在枪头表面的黏附。
- 转移DRG时，将移液枪设定为800 µl。先从滤膜顶部吸取约200 µl培养基，然后移至含有DRG的离心管中，轻轻吹打少量液体数次，以重悬已沉降至管底的DRG。随后吸出全部液体，并将DRG转移至插入式小室中央，操作时保持枪头浸没于液体中。
- 所有插入式小室接种完成后，盖上培养板盖，轻轻旋转培养板10次，每次旋转之间轻敲培养板于生物安全柜台面上。这些操作有助于DRG组织块沉降并贴附于滤膜表面，从而提高轴突产量，同时使组织块均匀分布，避免不同组织块的轴突相互重叠。
注意：前述步骤中描述的组织块接种方法显著提高了组织块在基质上的贴附率（可达75%）。尤为重要的是，该移液操作能有效防止组织块漂浮在培养基表面，而促使其沉降至插入式小室底部。 - 进行生化分析时，每片滤膜接种一个胚胎来源的DRG（约30个）；进行形态学分析时，每片滤膜接种一个胚胎DRG数量的一半或三分之一（10–15个）。此决定必须在将DRG收集至离心管前确定，以确保同一离心管中的所有DRG均接种至同一个孔中（无论是30、15或10个DRG）。
- 将培养物置于37 °C细胞培养箱中维持培养，每2–3天更换一次培养基。更换培养基时，先吸出顶部隔室的培养基，再吸出底部隔室的培养基。添加新鲜培养基时，按标准体积先加入底部隔室，再加入顶部隔室。
注意：为防止细胞/轴突干燥，每次更换培养基时不应同时处理超过3个插入式小室。在NGF存在下于滤膜上培养的DRG可延伸出较长的轴突，培养2天后轴突长度可达2 mm。
4. 营养因子撤除处理
撤除NGF会诱导轴突变性，出现轴突断裂（通过相差显微镜和β-III微管蛋白免疫荧光检测确定），这一现象最早在撤除后约12小时出现，36小时时达到完全断裂。变性过程持续的时间应由最终使用者根据实验设计自行决定。
- 在为期2天的轴突延伸阶段后，将顶部和底部隔室中的培养基更换为不含神经生长因子（NGF）并含有抗NGF抗体（1 µg/ml）的培养基，以结合任何残留或内源性产生的NGF。
- 将培养板放回细胞培养箱（37 °C），使NGF撤除诱导的退变过程按所需时间进行。
- 随后进行蛋白质提取（步骤6），用于Western印迹检测，或直接通过免疫荧光（IF）检测滤膜（步骤7）。
5. 轴突横断以诱导华勒变性
该操作使滤膜底侧的轴突与其胞体分离，但轴突本身保持完整。此后，这些轴突迅速启动沃勒变性。轴突断裂（可通过相差显微镜或β-III微管蛋白免疫荧光检测）在横断后3小时左右首次出现；至9小时时，轴突已完全断裂并从滤膜上脱落。变性过程持续的时间需由最终使用者根据实验设计自行决定。
- 使用细胞刮刀刮取含有已生长背根神经节（DRG）外植体的滤膜上表面。通过在X、Y方向及环形运动中移动刮刀，确保完全去除上层物质。
- 弃去滤膜上室中含有被刮下的漂浮外植体的培养基，并加入1 ml预热的、含神经生长因子（NGF，10 ng/ml）的完全DRG培养基。
- 将培养板放回细胞培养箱（37 °C），使Wallerian变性过程按终端用户选定的时间继续进行。
- 进行蛋白质提取（步骤6）以用于Western blot检测，或直接通过免疫荧光（IF）检测滤膜（步骤7）。
6. 轴突样本的蛋白质提取
- 在收集管（1.5 ml）中加入 75 µl Laemmli 上样缓冲液。在从整套滤膜上收获轴突期间，将管子置于冰上。
- 用 PBS 清洗带有背根神经节外植体的滤膜，并刮取滤膜的上表面。将插入物从培养板中取出，用棉签清洁滤膜的上表面，并吸除滤膜上下两侧多余的 PBS。
- 将插入物倒置放在实验台上，使用锋利的手术刀将滤膜从插入物中切割下来。用镊子夹住滤膜，使底面朝上。用剪刀从滤膜边缘向中心剪开一道切口。
- 将滤膜置于收集管口上方，用镊子将滤膜中心向下压入管内。操作时应形成一个漏斗状结构。将呈漏斗状的滤膜推至管底，使其完全浸入 Laemmli 样品缓冲液中。
- 通过将管子煮沸 4 分钟完成蛋白质提取。用镊子夹住滤膜，将其倒置放入管口顶部，短暂离心（2,000 × g，15 秒），然后丢弃干燥的滤膜。
- 取 10 µl 轴突蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，随后通过 Western 印迹检测目标蛋白。
注意：作为参考，由 20 个外植体培养 2 天后在 100 µl RIPA 裂解缓冲液中裂解所得的轴突样品，其蛋白浓度约为 4–6 µg/µl。
7. 滤膜上轴突的免疫荧光检测
以下步骤概述了在滤膜插件上进行免疫荧光染色的一般操作流程，以β-III微管蛋白的检测为例。针对其他抗原-抗体组合，固定剂、孵育时间、浓度及其他具体条件需进行优化。
- 使用先前使用过的 6 孔板，彻底清洗后，用于后续对插入物的洗涤和孵育。
- 用 PBS 短暂洗涤插入物。在摇床上，用新配制的含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定 10 分钟 ，室温进行。
- 固定后，刮除并清洁插入物的上表面，以收集仅生长在滤膜底面的轴突。随后按标准流程进行免疫荧光（IF）孵育。
- 将插入物置于封闭液（TBS、0.05% Tween 20、5% 脱脂奶粉）中，使用标准体积，室温轻柔振荡孵育 1 小时。
- 将插入物转移至用封闭缓冲液稀释的一抗溶液中（抗 β-III 微管蛋白抗体，1:5,000），使用标准体积。4 °C 轻柔振荡孵育过夜（约 18 小时）。
- 用 PBS 洗涤一抗两次（每次 10 分钟 ，室温）。
- 将插入物转移至用封闭缓冲液稀释的荧光标记二抗溶液中（山羊抗小鼠，1:2,000），使用标准体积。避光、室温轻柔振荡孵育 2 小时。
- 用 PBS 洗涤二抗 3 次 （每次 10 分钟 ，室温 ）。
- 完成免疫荧光染色后，取出插入物，倒掉最后一次洗涤的 PBS，并用棉签清洁滤膜的上表面。吸除滤膜上下两侧的残留液体。
- 将插入物倒置放在实验台上，用锋利的手术刀片将滤膜从插入物中切割下来。
- 用镊子夹住滤膜，使底面朝上，将其放置于显微镜载玻片上。加盖盖玻片，并加入适用于荧光的封片介质。在低温室中避光平放干燥。使用荧光显微镜观察并采集图像。
注意：若在 4 °C 避光保存，这些样品可保存数周，荧光信号损失极小。 - 可选步骤：也可对已从插入物中取出的滤膜进行免疫荧光染色。操作方法为：固定后直接刮除并清洁滤膜的上表面。
- 用锋利的手术刀片将滤膜从插入物中取出，并将带有轴突的一面朝上放置于六孔板底部。
- 随后按照步骤 7.4–7.8 和 7.11 所述进行免疫荧光孵育。此替代方法的优势在于可节省试剂，例如孵育体积可减少至 500 µl（相比之下，当滤膜保留在插入物中直接染色时，如步骤 7.1–7.11 所示，需使用 3 ml）。
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结果
E13.5小鼠的背根神经节外植体在依次包被多聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白和胶原的滤膜上可广泛生长（图1B，左侧），在培养2天内轴突可延伸至长达2 mm。这种基质组合可促进极为旺盛的生长；其他组合所产生的轴突则明显较短（图1B，右侧）。此外，与在塑料表面培养的背根神经节相比，在滤膜上维持培养的背根神经节可延伸出更多且更长的轴突（图1C）。
本方案中使用的孔径为 1 µm 的滤膜可将细胞体截留在滤膜上表面，同时允许神经突通过孔隙生长并延伸至滤膜底面。通过针对细胞核（DAPI）和 β-III-微管蛋白染色后的落射荧光显微镜观察，可清晰地看到这一现象 图 1D。在完整的滤膜上，可以观察到神经元和非神经元细胞的细胞核主要集中于外植体中心区域，并有部分呈放射状分布。然而，当刮除滤膜上表面后，细胞核消失，仅能在滤膜底面检测到轴突。
图1E 显示了一个滤膜底部的示例，该滤膜原本...
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讨论
在采用该技术时，需要考虑的重要参数包括待研究的神经元群体、基质材料、滤膜孔径和表面积。所有这些参数都将影响所获得的神经突起制备物的特异性、质量和数量，最终使用者必须仔细考量。在本方案所展示的示例中，使用背根神经节（DRG）神经元的优势在于其仅延伸轴突，从而可获得纯度高（特异性强）的轴突制备物。
与中枢神经系统来源的神经元相比，胚胎背根神经节（DRG）的轴突生长速度非常快，因此仅需培养2天即可获得轴突样本。1 µm的孔径已被证实足够小，可有效阻止细胞体迁移到下层表面，同时允许生长中的轴突高效通过。相较于更小的孔径规格（即 0.4 µm）时，无法实现对细小轴突的选择性。对于背根神经节（DRG）外植体的研究，24 mm滤膜插入式培养装置（用于6孔板）可产生足量的轴突蛋白样品，适用于包括免疫共沉淀在内的多种技术，后者通常需要较大量的蛋白输入。然而，更小规格（即 适用于某些应用，特别是使用解离细胞和/或免疫细胞化学时，12孔板的滤膜插件是合适的选择。
尽管滤膜小室可有效分离轴突与胞体以供检测，但需注意...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由加拿大卫生研究院资助，资助号为 MOP62827。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD-1 小鼠，E13 天孕鼠 | Charles River | 可通过交配小鼠并检查阴道栓（E0 天）在本实验室完成定时妊娠 | |
| Falcon 细胞培养小室 | Corning | 353102 | 孔径 1 µm，适用于 6 孔接收板 |
| Falcon 细胞培养配套培养板 | Corning | 353502 | 用于承载小室的接收板 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407 | 以 1 mg/ml 水溶液使用，可重复使用一次 |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | 以 10 µg/ml 水溶液使用。从 -80 °C 取出 100 倍浓缩液，4 °C 过夜解冻 |
| PureCol 牛胶原蛋白溶液 | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Invitrogen | 11415-064 | 可用 DMEM 替代 |
| Neurobasal 培养基 | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 无血清添加剂 | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-氟-2′-脱氧尿苷（FDU） | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF（2.5S，β 亚基） | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| 抗 NGF 抗体 | 本实验室制备 | 制备方法见：Acheson, A. 等。检测成纤维细胞和施万细胞中的脑源性神经营养因子样活性：抗 NGF 抗体的抑制作用。Neuron. 7, 265-75, (1991)。 | |
| Alomone Labs | AN-240 | 商业化选择 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG 培养基 | |||
| Neurobasal 培养基 2% B27 Neurobasal 添加剂 2 mM L-谷氨酰胺 1% 青霉素-链霉素 10 µM FDU 15 ng/ml NGF（仅下室添加） | |||
| 1× Laemmli 上样缓冲液 | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris（pH 6.8） 5% 甘油 0.01%（w/v）溴酚蓝 |
参考文献
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