一种基于微流控的电化学生物芯片用于无标记DNA杂交分析

摘要

我们介绍一种基于微流控技术的电化学生物芯片，用于检测DNA杂交。在单链DNA探针功能化之后，通过互补和非互补的单链DNA靶标研究其特异性、灵敏度和检测限。结果表明DNA杂交事件对电化学系统的影响，检测限为3.8 nM。

摘要

将分析用台式实验流程微型化至微米尺度，可在反应时间、成本以及前处理步骤的集成方面带来显著优势。利用此类设备分析DNA杂交事件具有重要意义，因为它提供了一种可在多种疾病即时检测（point-of-care）场景下实时评估生物标志物的技术。然而，当设备尺寸减小时，多种物理效应的影响随之增强，这些效应会影响设备的加工精度和运行可靠性。因此，亟需以可重复的方式精确制造并操作这些设备，以提升整体性能。本文中，我们描述了用于制造和操作基于微流控的电化学生物芯片以实现DNA杂交事件精确分析的实验方案与方法。该生物芯片由两部分组成：一个由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的含有三条平行微通道的微流控芯片，以及一个3×3阵列的电化学微芯片。DNA杂交事件通过电化学阻抗谱（EIS）分析进行检测。EIS分析能够监测在该尺度下占主导地位的电化学系统特性的变化。通过该生物传感器对电荷转移电阻和扩散电阻变化的监测能力，我们验证了对互补单链DNA（ssDNA）目标序列的选择性，计算出检测限为3.8 nM，并在孵育20分钟 后观察到与其他非互补ssDNA存在13%的交叉反应性。该方法可通过阐明微尺度下扩散行为的规律，并实现对DNA杂交事件的研究，从而提升微型化设备的性能。

引言

微流控芯片实验室（LOC）设备在临床诊断、环境监测和生物医学研究中具有诸多优势。这些设备利用微流控通道将流体输送到芯片的特定区域，在这些区域可进行多种操作，包括试剂混合、基于亲和力的结合、信号转导以及细胞培养^1-4。与传统的临床诊断工具（如微孔板读数仪或电泳迁移率变动分析）相比，微流控技术具有多项优势。微流控设备执行类似检测所需的试剂用量减少2至3个数量级（纳升级而非微升级）。此外，由于物种在通道内受到更小空间的限制，某些生物事件的发生速度可得以加快^5,6。第三，可通过光刻和蚀刻技术将传感器集成到微流控设备中，实现无标记检测。最后，这些设备生产成本低廉，操作时对技术人员的工作量要求也较低^7-10。

无标记检测通常使用光学或电学换能器进行。由于光学器件对样品中分析物的干扰较低，因此可提供更优的传感性能。然而，当样品背景的共振波长与传感器相同时，其检测性能会受到影响。¹¹在微流控系统中使用电信号进行生物和化学检测具有诸多优势。由于这类传感器通常仅需图案化的电极即可工作，其制备过程本质上更为简单。此外，电信号可直接与大多数测量设备连接，而其他类型的信号则可能需要通过换能器将信号进行转换。^12-15. 电学传感器通常测量阻抗的变化^16,17电容¹⁸，或氧化还原活性¹⁹然而，随着这些系统的微型化，新的挑战也随之出....

方案

1. 微流控芯片的微加工

1. 制备电化学芯片
   1. 图案化金电极
      1. 用丙酮、甲醇和异丙醇冲洗一片空白的4英寸硅片（优等品级）（“AMI”清洗法）。随后用去离子水（DI）冲洗硅片上的异丙醇，再用氮气吹干₂ 枪
      2. 生长一层 1 µm 厚的 SiO₂ 使用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备沉积钝化层。随后使用直流溅射设备沉积一层200 Å厚的铬，再沉积一层2,000 Å厚的金。
      3. 旋涂“PR1”正性光刻胶（旋转参数：3,000 rpm，加速度 1,000 rpm/sec，时间 30 秒），形成约 1.6 µm 厚的均匀薄膜。将晶圆置于热板上，在 100 °C 下预烘 1 分钟。
      4. 用 190 mJ/cm 的能量曝光晶圆² 在405 nm波长下通过光掩模曝光。将晶圆在352显影液中显影30秒，用去离子水冲洗，并用氮气吹干。₂ 枪
      5. 用金刻蚀液刻蚀金1.5分钟。用铬刻蚀液刻蚀铬约30秒。用去离子水冲洗晶圆，并用氮气吹干。₂ 枪
      6. 使用“AMI”清洗程序剥离光刻胶。
         注意：强氧化剂，可能爆炸。
      7. 用 4:1 的 H 清洁晶圆₂SO₄：H₂O_2....

结果

实验装置的可控且精确的制造工艺在研究中至关重要。它使研究人员能够获得可重复且高通量的实验结果。本文展示了一种基于微流控的电化学生物芯片的高产率、高重复性微加工工艺（图1）。该工艺失败率低，仅有极少数器件出现键合问题导致溶液泄漏。为了验证生物芯片的电化学活性，在微通道中填充电活性氧化还原对铁氰化物/亚铁氰化物后进行循环伏安法测量。图2展示了芯片上九个不同工作电极的可重复电化学响应。这些结果表明，生物芯片的九个腔室中电化学活性一致，可实现高通量测量。

大多数DNA杂交传感器将单链DNA（ssDNA）探针固定在传感器表面。由于金常被用于微流控器件中传感电极的图案化，巯基（thiols）是与传感器表面形成强共价键的良好候选基团³⁴。一种常见的偶联技术是在单链DNA的一端添加一个功能性的巯基（-SH）基团。S-S二硫键可保护游离巯基免于氧化，直到其准备使用为止。一旦通过加入三(2-羧乙基)膦（TCEP）将二硫键还原，游离的巯基（-SH）即可与金表面结合，从而将DNA固定在金表面。若不使用TCEP，单链D.......

讨论

我们的实验流程展示了基于微流控的电化学生物芯片的制备及其在DNA杂交事件分析中的应用。通过高产率的可控微加工工艺，我们开发出一种集成了微尺度通道与电化学传感器阵列的装置。我们采用迭代方法，为电化学芯片的光刻工艺以及微流控通道模具的加工参数制定了可控的处理方案。这些步骤为今后其他微型化分析装置的构建提供了指导。尤为重要的是，它们提供了一种优化多种生物传感参数（如信噪比、稳定性和灵敏度）的方法。在完成器件制备后，我们以单链DNA（ssDNA）探针对电化学传感器进行功能化修饰，作为生物识别元件，赋予其特定的分析功能。尽管这些实验流程表现出较低的器件失效率，但在器件组装后以及进行DNA杂交检测过程中，溶液泄漏仍是一个主要问题。对这类器件中键合失效问题的进一步研究，将有助于提高制备产率，并使其更适用于微流控生物系统的研究。

在我们的研究中，我们展示了生物芯片准确且特异性地检测DNA杂交事件的能力。作为新型分析微装置设计参数的一部分，应考虑装置的制造，这需要采用迭代方法来优化制备参数（例如，光刻参数、微通道尺寸、沉积金属的类型）。为了高效检测DNA杂交事件，还需优化单链DNA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4'' 硅片	Ultrasil	4-5664	单面抛光；P型；硼掺杂；晶向1-0-0；厚度500微米；电阻率10-20欧姆·cm
Shipley 1813 光刻胶（"PR1"）	Microchem		正性光刻胶
AZ5214 光刻胶（"PR2"）	Hoechst Celanse		正性光刻胶
SU-8 50 光刻胶（"PR3"）	Microchem		负性光刻胶
金刻蚀液	Transene	TFA	无需稀释
铬刻蚀液	Transene	1020AC	无需稀释
PDMS 弹性体	Dow Corning	3097366 1004
PDMS 固化剂	Dow Corning	3097358 1004
活检打孔工具	Healthlink	BP20
Tygon 柔性管	Cole Parmer	R 3603	0.015"
Tygon 柔性接头	Cole Parmer	06417-41	0.0625"
1 ml 注射器	Beckton-Dickenson	301025
一碱磷酸钾	Fluka	1551139
无水二碱磷酸钾	Sigma	RES20765-A7
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
三(2-羧乙基)膦	Aldrich	C4706
6-巯基-1-己醇	Aldrich	451088
20倍浓缩的氯化钠-柠檬酸钠缓冲液	Sigma	93017
六氰合铁(III)酸钾	Aldrich	455946
互补单链DNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA 寡核苷酸	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
靶向单链DNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA 寡核苷酸	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
互补单链DNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA 寡核苷酸	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
靶向单链DNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA 寡核苷酸	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
互补单链DNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA 寡核苷酸	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
仪器
等离子体增强化学气相沉积（PECVD）	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	腔室压力1,000 mTorr，温度200 °C，射频功率20 W，气体：a) N2O 流速710 sccm；b) 5% SiH4 和95% N2 混合气体流速170 sccm，SiO2 生长速率690 Å/min。
直流溅射设备	AJA International	ATC 1800-V	铬溅射参数：腔室压力10 mTorr，氩气流速20 sccm，施加直流功率200 W，溅射速率10 nm/min。金溅射参数：腔室压力10 mTorr，氩气流速20 sccm，施加直流功率200 W，溅射速率36 nm/min。
电子束蒸发系统	Denton	定制	钛蒸发参数：腔室压力 < 2 × 10-6 Torr，电子枪供电功率7.5 kW，灯丝电流150-200 mA，蒸发速率6-10 Å/秒。铂蒸发参数：腔室压力 < 2 × 10-6 Torr，电子枪供电功率7.5 kW，灯丝电流150-200 mA，蒸发速率2-3 Å/秒。
电化学工作站	CH Instruments	660D
注射泵	KD Scientific	KDS230