体内 小鼠睾丸显微注射与电穿孔

摘要

本文描述了小鼠睾丸的显微注射与电穿孔技术 在 体内 作为 用于研究精子发生独特过程的小鼠睾丸细胞转染技术。本方案包含玻璃毛细管制备、通过输出小管显微注射以及电穿孔转染等步骤。

摘要

本视频与文章详细介绍了小鼠睾丸的显微注射与电穿孔技术 在 体内这种特定的睾丸小鼠细胞转染技术可用于研究精子发生过程中的独特机制。

以下实验方案重点介绍将质粒构建体转染入小鼠睾丸细胞的操作。具体而言，我们使用了报告载体 pEGFP-C1，该载体表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP），同时也使用了表达红色荧光蛋白（DsRed2）的 pDsRed2-N1 载体。两种报告基因均由人巨细胞病毒立即早期启动子（CMV）驱动表达。

为了将基因导入小鼠睾丸，需将报告质粒构建体注射到活体小鼠的睾丸中。为此，需暴露麻醉动物的睾丸，并准备显微注射部位。我们首选的注射部位是输出小管，其最终连接的睾网是精子在睾丸与附睾之间运输的解剖通路。通过使用染色的DNA溶液，可在显微注射后很好地实现并控制曲细精管的填充。当观察到睾丸因其着色的管状结构而充分填充后，对该器官进行电穿孔处理。这使得DNA溶液能够进入睾丸 细胞。经过3天的孵育后，取出睾丸并在显微镜下检测绿色或红色 荧光，以显示转染是否成功。

通常，本方案可用于将DNA或RNA载体递送至活体小鼠睾丸中，以实现基因的（过）表达或基因敲低，从而促进 在 体内 基因功能分析。此外，该技术也适用于报告基因载体或推测的基因调控元件的研究。因此，电穿孔技术的主要优势在于操作快速、耗时较少，且相较于其他替代技术，所需的设备和技术要求适中。

引言

哺乳动物的精子发生被认为是一个复杂的过程，其中自我更新的干细胞相继经历有丝分裂、减数分裂和分化，最终发育为成熟的单倍体精子。这些形态学变化由多种细胞类型协同调控，尽管已有大量深入研究，目前仍无法在细胞培养体系中完全模拟这些过程。^1,2因此，迄今为止关于精子发生的研究仍依赖于活体生物 在 体内 模型。通常，基因功能研究依赖于转基因动物。然而，构建和维持此类动物模型耗时较长、成本高昂且操作复杂。这主要是由于需要通过长期的繁育过程来获得并维持跨代的转基因。此外，当靶向的基因在多个区域具有必需功能时，采用转基因或基因敲除方法对整个生物体进行遗传操作容易导致生理功能障碍。 例如，睾丸外或全身性地。

此外，一些瞬时转染方法存在一些关键性缺点。例如，病毒介导的基因转移通常可能引发免疫反应，并需要额外的安全规范；而脂质体转染³和微粒轰击⁴则可能对组织造成损伤，且其转染效率仅限于一定深度的细胞层。

相比之下，电穿孔（EP）作为另一种常见的瞬时转染方法，似乎是一种有望实现体内转染和持续进行体内基因分析的技术。通常，EP 被称为一种动态现象，依赖于跨膜局部电压，从而在纳秒内介导形成孔道。这些孔道可维持数毫秒，足以允许 DNA、RNA 或小分子进入细胞⁵。当施加的电压&....

方案

所有动物实验均已获得当地伦理委员会（德国梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局）的批准。

1. 质粒制备

1. 质粒制备时，使用带有内毒素去除缓冲液的质粒纯化试剂盒（见材料表）或类似方法，以避免动物产生免疫反应。请遵循说明书中的操作步骤。使用ddH₂O稀释质粒溶液。
2. 将DNA溶液以最大速度（20,000 × g）离心，去除碎片，然后收集上清液。
3. 使用分光光度计测定质粒浓度（见材料）。
4. 用ddH₂O将质粒浓度调整至1–3 µg(DNA)/µl。 注意：浓度过低会降低转染效率，而过高可能导致注射液过于黏稠。此外，转染效率取决于质粒大小，需针对不同质粒单独测试。
5. 注射前，准备混合溶液，例如将 40 µl质粒溶液与5 µl PBS（10倍浓度）和5 µl快绿染料（0.5%）混合。快绿用于追踪注射过程。建议使用薄壁PCR管或Parafilm。注意： 根据睾丸大小，每侧睾丸需要20–50 µl的注射体积。 

2. 显微注射针的制备

1. 使用硼硅酸盐毛细管（参见 材料表）制备显微注射针。
2. 使用垂直毛细管拉制仪（参见 材料表）拉制玻璃毛细管。
3. 用镊子轻轻敲击....

结果

小鼠睾丸显微注射与电穿孔实验操作环境 体内 如按照方案使用，其示意图如下所示 图1尽管可以购买工业制造的微量移液器，但我们更倾向于通过拉制来自制移液器图1A）以及斜面处理（图1B) 玻璃毛细管，以满足我们的需求。显微注射和电穿孔所用设备如图所示 图1C出于转染效率的考虑，使用方波电穿孔仪至关重要。

图2展示了小鼠手术的关键步骤，特别聚焦于输出小管的准备。在此过程中，首先暴露睾丸（图2A），通过双目显微镜观察识别输出小管，并将其从脂肪组织中分离（图2B）。随后，使用显微注射移液管穿刺输出小管，并注入质粒溶液（图2C-E）。最后，将载有质粒的睾丸置于两个电极之间，通过施加方波脉冲进行转染（图2F）。

这种.......

讨论

生殖生物学领域的研究，特别是在男性生育力和精子发生方面，不可避免地依赖于活体生物。为了研究睾丸功能，目前尚未建立能够充分反映从二倍体精原细胞到单倍体成熟精子所有关键形态变化的合适细胞培养/体外系统^1,2。因此，构建转基因动物常常是男性生殖生物学研究中必不可少且极具价值的工具。为此，研究人员已构建了大量转基因、基因敲除和基因敲入小鼠，这些模型为理解男性生育力提供了重要见解。然而，转基因小鼠的制备通常需要将基因构建体注射到受精卵的原核中。该技术耗时较长，且通常需由专业实验室完成。而构建基因敲除或基因敲入动物的技术则更为复杂。

研究活体模式生物基因功能的另一种方法是瞬时转染。然而，常用的病毒载体转导可能引发免疫原性或其他非特异性反应，并需要特殊的生物安全规范。脂质体转染³和微粒轰击⁴等方法则受限于特定的细胞深度，甚至可能对组织产生不良影响。

然而，通过在靶组织上直接施加电方波脉冲（即所谓的电穿孔），实际上可以实现对活.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Sigma	1-15 PK
分光光度计	Nanodrop	ND-1000
微量移液器拉制仪	Narishige	PC-10	垂直毛细管拉制仪
显微注射毛细管	Clark	GC100-10	硼硅酸盐标准壁
微量移液器斜面研磨仪	Bachofer	Typ 462	旋转盘式斜面研磨仪
电穿孔仪	Nepagene	CUY 21EDIT	方波电穿孔仪
镊形电极	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø 圆盘电极
体视显微镜	Zeiss	Stemi 2000-C
冷光源	Zeiss	KL 1500LCD
显微注射泵	Eppendorf	Femtojet
显微操作器	自制		XYZ 三维平移台
外科手术器械	FST		剪刀、镊子、持针器
精细镊子	FST	Dumont #5, #7	用于输出小管制备
Michel夹施加器	FST	Michel, 12029-12
Michel缝合夹	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
外科缝合线	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
带30G针头的注射器	B. Braun	Omnican 40	用于填充微量移液器及麻醉
质粒提取试剂盒	Promega	Cat. # A2495	质粒中量提取
质粒pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV启动子 + EGFP
质粒pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV启动子 + DsRed2
快绿染料	Sigma	F7258-25G	用于在ddH2O中稀释
10% 氯胺酮	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	与赛拉嗪按1:1比例混合使用
2% 赛拉嗪	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	与氯胺酮按1:1比例混合使用
斯迪林消毒液	Bode Chemie	Sterillium	消毒
兽用软膏	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	眼科软膏，用于防止眼睛干燥
To-Pro-3 碘化物	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
布洛芬，Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	术后镇痛用解热镇痛药（非甾体抗炎药）儿童溶液
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1