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体内 小鼠睾丸显微注射与电穿孔

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DOI：

10.3791/51802

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2014年8月23日

 ,  , 
1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)

通讯作者： Joachim M. Weitzel <weitzel@fbn-dummerstorf.de>

本文内容

摘要

本文描述了小鼠睾丸的显微注射与电穿孔技术 在 体内 作为 用于研究精子发生独特过程的小鼠睾丸细胞转染技术。本方案包含玻璃毛细管制备、通过输出小管显微注射以及电穿孔转染等步骤。

摘要

本视频与文章详细介绍了小鼠睾丸的显微注射与电穿孔技术 在 体内这种特定的睾丸小鼠细胞转染技术可用于研究精子发生过程中的独特机制。

以下实验方案重点介绍将质粒构建体转染入小鼠睾丸细胞的操作。具体而言，我们使用了报告载体 pEGFP-C1，该载体表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP），同时也使用了表达红色荧光蛋白（DsRed2）的 pDsRed2-N1 载体。两种报告基因均由人巨细胞病毒立即早期启动子（CMV）驱动表达。

为了将基因导入小鼠睾丸，需将报告质粒构建体注射到活体小鼠的睾丸中。为此，需暴露麻醉动物的睾丸，并准备显微注射部位。我们首选的注射部位是输出小管，其最终连接的睾网是精子在睾丸与附睾之间运输的解剖通路。通过使用染色的DNA溶液，可在显微注射后很好地实现并控制曲细精管的填充。当观察到睾丸因其着色的管状结构而充分填充后，对该器官进行电穿孔处理。这使得DNA溶液能够进入睾丸 细胞。经过3天的孵育后，取出睾丸并在显微镜下检测绿色或红色 荧光，以显示转染是否成功。

通常，本方案可用于将DNA或RNA载体递送至活体小鼠睾丸中，以实现基因的（过）表达或基因敲低，从而促进 在 体内 基因功能分析。此外，该技术也适用于报告基因载体或推测的基因调控元件的研究。因此，电穿孔技术的主要优势在于操作快速、耗时较少，且相较于其他替代技术，所需的设备和技术要求适中。

引言

哺乳动物的精子发生被认为是一个复杂的过程，其中自我更新的干细胞相继经历有丝分裂、减数分裂和分化，最终发育为成熟的单倍体精子。这些形态学变化由多种细胞类型协同调控，尽管已有大量深入研究，目前仍无法在细胞培养体系中完全模拟这些过程。1,2因此，迄今为止关于精子发生的研究仍依赖于活体生物 在 体内 模型。通常，基因功能研究依赖于转基因动物。然而，构建和维持此类动物模型耗时较长、成本高昂且操作复杂。这主要是由于需要通过长期的繁育过程来获得并维持跨代的转基因。此外，当靶向的基因在多个区域具有必需功能时，采用转基因或基因敲除方法对整个生物体进行遗传操作容易导致生理功能障碍。 例如，睾丸外或全身性地。

此外，一些瞬时转染方法存在一些关键性缺点。例如，病毒介导的基因转移通常可能引发免疫反应，并需要额外的安全规范；而脂质体转染3和微粒轰击4则可能对组织造成损伤，且其转染效率仅限于一定深度的细胞层。

相比之下，电穿孔（EP）作为另一种常见的瞬时转染方法，似乎是一种有望实现体内转染和持续进行体内基因分析的技术。通常，EP 被称为一种动态现象，依赖于跨膜局部电压，从而在纳秒内介导形成孔道。这些孔道可维持数毫秒，足以允许 DNA、RNA 或小分子进入细胞5。当施加的电压 过高时，由于产热以及过度通透性的诱导，EP 通常具有的瞬时特性会被抵消，进而导致细胞发生不可逆损伤5。

在此，我们证明电穿孔是一种有效且经济的转染系统，可用于遗传性睾丸转化，以阐明睾丸基因特性 在 体内本文介绍了质粒制备、通过输出小管进行显微注射以及随后对小鼠睾丸进行电穿孔的技术。该方法可作为实现小鼠睾丸曲细精管快速、特异且高效转染的首选手段。 在 体内 为了研究精子发生过程。

方案

所有动物实验均已获得当地伦理委员会（德国梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局）的批准。

1. 质粒制备

  1. 质粒制备时，使用带有内毒素去除缓冲液的质粒纯化试剂盒（见材料表）或类似方法，以避免动物产生免疫反应。请遵循说明书中的操作步骤。使用ddH2O稀释质粒溶液。
  2. 将DNA溶液以最大速度（20,000 × g）离心，去除碎片，然后收集上清液。
  3. 使用分光光度计测定质粒浓度（见材料）。
  4. 用ddH2O将质粒浓度调整至1–3 µg(DNA)/µl。 注意：浓度过低会降低转染效率，而过高可能导致注射液过于黏稠。此外，转染效率取决于质粒大小，需针对不同质粒单独测试。
  5. 注射前，准备混合溶液，例如将 40 µl质粒溶液与5 µl PBS（10倍浓度）和5 µl快绿染料（0.5%）混合。快绿用于追踪注射过程。建议使用薄壁PCR管或Parafilm。注意： 根据睾丸大小，每侧睾丸需要20–50 µl的注射体积。 

2. 显微注射针的制备

  1. 使用硼硅酸盐毛细管（参见 材料表）制备显微注射针。
  2. 使用垂直毛细管拉制仪（参见 材料表）拉制玻璃毛细管。
  3. 用镊子轻轻敲击毛细管尖端使其断裂。尖端直径通常为 50–80 µm，长度约为 1 cm。应避免制备过长的尖端，因其刚性不足，难以穿透组织。
  4. 最后，使用微管斜面打磨仪将尖端以 30° 至 45° 角度磨尖（参见 材料表）。
  5. 用注射溶液混合物（参见质粒制备）装填显微注射针。使用小注射器将溶液从玻璃毛细管后端注入。注意：装填时应尽量避免产生气泡，否则气泡将随质粒溶液一同注入曲细精管，从而降低导电性，并可能造成组织损伤。

3. 麻醉与手术

  1. 在无菌条件下使用无菌材料进行操作（即， 注射器、针头、手术器械等。这将减少动物感染风险，并确保较高的存活率。
  2. 使用6至8周龄的雄性小鼠进行电穿孔实验。
  3. 为启动术后镇痛治疗，应在手术前一天为小鼠提供添加镇痛药物的饮用水。此举可预防术后极可能出现的饮水减少（低饮水量）情况，实现预先镇痛。为此，可将饮用水中加入例如小儿布洛芬混悬液（20 mg/ml）。含药饮用水应在术后第1天和第2天以相同浓度继续供给。这意味着每日剂量为7.5 mg/kg，适用于8周龄C57BL/6J小鼠，体重25 g，每日饮水量5 ml。该镇痛方案可确保基本的疼痛缓解，促进快速恢复，并提高动物福利水平26.
  4. 用于制备 手术当天配制麻醉工作液，将10%氯胺酮与2%赛拉嗪按1:1比例混合（参见 材料表）。
  5. 为麻醉动物，按每100 mg体重0.25 ml的剂量皮下注射麻醉剂溶液（氯胺酮 = 0.125 g/kg；赛拉嗪 = 0.025 g/kg）。注射部位应选择骨盆与肢体之间的区域，以避免对小鼠器官造成损伤或伤害。通常需要约10分钟，小鼠即可达到深度麻醉状态。
  6. 用兽医用眼膏覆盖小鼠眼睛，以防止麻醉期间眼睛干燥。
  7. 测试深度麻醉状态，表现为完全无反应。为此，可轻捏动物的脚趾进行检查。
  8. 手术开始时，使用电动剃须刀或类似工具去除腹部毛发，并用Sterilium或类似消毒剂对术区进行消毒。
  9. 在腹部区域中央的包皮腺正上方做一个腹侧切口。首先将皮肤拉开，在此处做一个约8-14 mm的小的横向皮肤切口，然后沿腹肌层继续切开。
    注意：病灶应尽可能小，以减少对动物的伤害。
  10. 小心提起腹脂垫以暴露附着的睾丸，并将其放置在切口旁预先准备好的防水一次性手术纸巾上 (图2A).
  11. 使用双目显微镜寻找输出小管作为注射靶点。输出小管为睾丸与附睾之间的细小血管连接处，位于明显的睾丸动脉旁。该小管与动脉呈近45°角走行，并明显进入附睾头。注意：根据小鼠年龄的不同，输出小管通常埋藏于脂肪组织中。
  12. 使用精细镊子清除输出管中的脂肪组织。之后，将游离的输出管置于无菌的 使用试纸条以确保导管清晰可见，同时不损伤周围组织。

4. 显微注射与DNA应用

  1. 将装有质粒溶液的显微注射移液管连接至显微操作器/注射装置。
  2. 将显微注射针平行置于输出小管旁，针尖朝向睾丸网（图2B）。
  3. 使用精细镊子将小管在显微注射移液管上方剥离。拉动过程中需确保毛细管始终与小管保持平行。
    注意：此操作方式比使用显微操作器移动针头穿刺血管更为方便。
  4. 小心将针头朝向睾丸推进，当其刚好穿透白膜正下方的睾丸网时即停止（图2C）。
    注意： 若针头过度深入睾丸网，质粒溶液将泄漏至间质空间，通常会导致生精小管转染失败。
  5. 进行质粒溶液注射时，使用显微注射仪并设置如下参数：pi： 100 hPa，ti： 0.2 秒，pc： 0 hPa（图2D）。
  6. 通过观察绿色染料的填充情况，监测整个注射过程。注意质粒溶液仅需填充至睾丸体积的2/3即可（图2E）。
    注意： 若注射体积过大，可能损伤睾丸组织。

5. 睾丸电穿孔

  1. 为了实现有效的电穿孔，将镊子电极浸入 PBS (1x) 中。这可以确保足够的导电性。
  2. 用湿润的电极轻轻夹住睾丸（图 2F）。使用电穿孔仪测量电阻。
  3. 对睾丸施加电流。在睾丸的 4 个不同位点上，各施加 8 次 40 V 的方波脉冲，每次脉冲持续时间为 50 毫秒，间隔时间为 950 毫秒。

6. 伤口闭合与术后处理

  1. 电穿孔完成后，将睾丸放回原位。
  2. 使用外科缝合线缝合内层肌肉组织（参见材料部分）。
  3. 使用缝合夹闭合皮肤。用镊子提起皮肤，注意避免夹住肌肉层。每枚缝合夹之间的距离不应超过5 mm。
    注意：由于小鼠可能吞咽外科缝合线，因此推荐使用缝合夹来闭合皮肤切口。
  4. 将小鼠置于铺有无菌纸巾的无菌空鼠笼中，使其从麻醉中恢复，笼子应放置在37 °C的温控加热垫上。加热垫应仅加热笼子的一半区域，以形成温度梯度，使动物可根据自身需求选择最舒适的温度区域。此外，用一张无菌纸巾覆盖小鼠，以进一步减少其应激反应。 注意：由于小鼠体表面积相对于体重的比例显著高于大型动物，因此适当的保温措施对啮齿类动物的顺利恢复尤为重要。
  5. 当手术动物完全清醒后，将其转移至一个配备齐全的全新鼠笼中进行后续恢复。切勿将其放回原来的笼子或与其他小鼠合笼。确保笼具尽可能清洁无菌，以防止伤口感染。密切监测整个恢复过程。在将小鼠送回动物饲养设施前，需确认其已完全恢复且行为表现正常。
    注意：Pritchett-Corning KR 等6进一步讨论了术中及术后相关的辅助策略。

结果

小鼠睾丸显微注射与电穿孔实验操作环境 体内 如按照方案使用，其示意图如下所示 图1尽管可以购买工业制造的微量移液器，但我们更倾向于通过拉制来自制移液器图1A）以及斜面处理（图1B) 玻璃毛细管，以满足我们的需求。显微注射和电穿孔所用设备如图所示 图1C出于转染效率的考虑，使用方波电穿孔仪至关重要。

图2展示了小鼠手术的关键步骤，特别聚焦于输出小管的准备。在此过程中，首先暴露睾丸（图2A），通过双目显微镜观察识别输出小管，并将其从脂肪组织中分离（图2B）。随后，使用显微注射移液管穿刺输出小管，并注入质粒溶液（图2C-E）。最后，将载有质粒的睾丸置于两个电极之间，通过施加方波脉冲进行转染（图2F）。

这种体内转染方法可使用编码不同报告基因的各种质粒。本研究中采用了报告载体 pEGFP-C1（图 3A），其表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）；同时也使用了 pDsRed2-N1（图 3C）载体，该载体可启动红色荧光蛋白（DsRed2）的表达。在本实验中，两个报告基因均由人巨细胞病毒即刻早期启动子（CMV）驱动。

为了评估转染效果，在整个操作完成3天后收集显微注射和电穿孔处理的睾丸，并在荧光显微镜下进行观察（图3）。为进一步详细分析，将睾丸组织用甲醛固定，包埋于石蜡中，切片（5 µm）后用To-Pro-3复染，使细胞核呈现蓝色。最后，通过荧光显微镜检查切片。两种可能的转染结果示例如图4所示。报告基因EGFP的表达由绿色荧光指示，DsRed2的转激活则由红色荧光信号表示。

玻璃微电极制备和显微注射装置；用于精确细胞注射的设备。
图1. 用于小鼠睾丸体内显微注射与电穿孔的设备。 玻璃毛细管通过微电极拉制仪（A）制备，而尖端则使用微电极斜面研磨仪（B）进行 sharpening。显微注射与电穿孔两种技术所用装置如图（C）所示。我们未使用商用显微操作器，而是采用显微镜的XYZ交叉移动平台，并附加一个用于固定微电极的装置。请点击此处查看该图的放大版本。

Microinjection needle technique in testis; microscopic images of epididymis, efferent duct, seminiferous tubules.
图2. 示意图 在体内 小鼠睾丸显微注射与电穿孔操作，包括前期外科手术干预。 通过切开已麻醉小鼠的腹部进入睾丸。切口位于包皮腺上方。暴露睾丸后，将其从腹部脂肪垫中分离出来（A）。在双目镜下观察，辨认输出小管并去除周围脂肪组织。将显微注射移液管置于输精管旁，使针尖朝向输出小管（B）。将玻璃毛细管插入输精管，并向睾丸方向推进，直至其前端准确定位于睾丸网（rete testis）内。C）。借助快绿（Fast Green）监测DNA导入及生精小管填充的过程。D）。仅灌注睾丸的2/3体积，以防止组织损伤（E）。在最终的电穿孔步骤中，将睾丸夹在镊子型电极之间，施加方波电脉冲（F). 请点击此处以查看此图的放大版本。

Fluorescent microscopy images of biological samples, green and red channel analysis.
图3. 睾丸整体组织，注射后3天 体内 电穿孔 在荧光显微镜下，转染的C57BL/6小鼠睾丸显示出增强型绿色荧光蛋白—eGFP的表达A）和红色荧光蛋白 - DsRed2（C）分别编码于 pEGFP-C1 和 pDsRed2-N1 质粒上。两种报告基因的表达均由普遍活性的 CMV 启动子元件调控。靶向曲细精管的有效转染通过荧光强度得以证实。图示（B）和（D) 显示未转染的对照睾丸的自发荧光。比例尺 = 1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Fluorescence microscopy image showing cell expression analysis with green signal highlights.
图4. 单侧处理后3天的小鼠睾丸组织切片 体内 使用pEGFP-C1质粒进行电穿孔 固定小鼠睾丸组织切片的转染结果（5 µm) 显示的是用 pEGFP-C1 质粒进行单侧电穿孔后 3 天的结果。成功转染的睾丸小管细胞通过绿色荧光显示。TO-PRO-3 染色的细胞核可通过蓝色发射光检测到（A 和 B。圆形结构是生精小管内细胞排列的典型特征。比例尺 = 20 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

生殖生物学领域的研究，特别是在男性生育力和精子发生方面，不可避免地依赖于活体生物。为了研究睾丸功能，目前尚未建立能够充分反映从二倍体精原细胞到单倍体成熟精子所有关键形态变化的合适细胞培养/体外系统1,2。因此，构建转基因动物常常是男性生殖生物学研究中必不可少且极具价值的工具。为此，研究人员已构建了大量转基因、基因敲除和基因敲入小鼠，这些模型为理解男性生育力提供了重要见解。然而，转基因小鼠的制备通常需要将基因构建体注射到受精卵的原核中。该技术耗时较长，且通常需由专业实验室完成。而构建基因敲除或基因敲入动物的技术则更为复杂。

研究活体模式生物基因功能的另一种方法是瞬时转染。然而，常用的病毒载体转导可能引发免疫原性或其他非特异性反应，并需要特殊的生物安全规范。脂质体转染3和微粒轰击4等方法则受限于特定的细胞深度，甚至可能对组织产生不良影响。

然而，通过在靶组织上直接施加电方波脉冲（即所谓的电穿孔），实际上可以实现对活体组织的转染，例如 此处的小鼠睾丸。此外，该方法仅需较低的成本、简单的设备以及经过适当培训的实验人员。

另一个值得注意的好处是与 在 体内 与持续性基因改造动物模型相比，转染方法的优势在于能够实现共转染。尽管转基因小鼠或基因敲除小鼠通常仅携带一种基因构建物， 体内 转染技术能够在同一细胞内对不同基因构建体进行全面且同步的分析。该方法可通过使用多种报告基因来实现， 例如，GFP 与 YFP 或 Gaussia- 与 Renilla-荧光素酶，从而可以对野生型和突变基因效应进行比较研究。

此外，通过使用细胞类型特异性启动子，可将基因构建体的表达精确地导向睾丸内的特定细胞。例如，这可以使基因仅在支持细胞或精母细胞中表达。

本文所述方案涵盖了雄性生殖生物学领域的两种重要方法。第一种是向曲细精管进行显微注射，并包括注射毛细管的制备。该技术常用于生殖细胞/干细胞移植，无论是将转基因动物的细胞移植到受体动物中7，还是在异种移植背景下应用8。第二种方法是电穿孔转染，可通过在细胞质膜上诱导产生瞬时孔道，并驱动质粒等带电大分子定向大量进入特定细胞或组织。这种利用电穿孔实现大分子定向递送的技术，常被用于单侧神经细胞的转染，通常在胎鼠体内（in utero）操作9,10，或应用于发育中的视网膜11。

前述详细的实验方案包括以下关键的初始步骤：对雄性小鼠进行麻醉，通过腹部切口暴露睾丸，制备输出管，并向输精管内进行显微注射。由于这些操作技术要求较高，强烈建议先在死亡动物上进行练习，然后再对活体小鼠实施手术。此外，本文还提供了如何将质粒DNA注射并充满曲细精管，以及如何恰当地对睾丸进行电穿孔操作的详细说明。

由于电穿孔（EP）过程中施加电流，产热可能引起组织损伤，尤其是在高电压下。电压升高虽可提高转染效率12, 13, 15，但也会导致睾丸萎缩等不良影响12-14。最适电压范围似乎为30–50 V，该范围可在保证睾丸结构完整性、正常精子质量16、正常交配行为17以及后代产生能力维持正常16-20的同时，实现足够的转染效率。

关于转移基因构建体的基因表达强度，Yomogida et al.21 还发现，在电穿孔实施3天后，线性化载体的表达显著降低，而环状质粒DNA在35天后仍明显维持表达，其中以支持细胞（Sertoli cells）中的表达水平最高。这表明，采用质粒构建体进行电穿孔可获得最佳效果，本研究正是采用了这种方法。在本实验中，我们在电穿孔后3 天检测转染效率，因为观察表明，该时间段足以实现充分的伤口愈合、细胞完整性的修复以及报告蛋白eGFP和DsRed2的充分表达。因此，在手术干预及整个转染程序完成后，3 天的孵育时间似乎是必要的，以确保细胞功能（包括基因表达）得到适当恢复，从而检测到尽可能强的荧光信号，保证转染结果的可靠性。关于转染效率，Yomogida et al.21 的研究显示，体细胞性的支持细胞对电穿孔转染的响应明显高于生殖细胞。我们建议在睾丸中共转染目标质粒和对照质粒，每种质粒分别编码不同的报告基因。

所介绍的电穿孔方法可广泛应用于与雄性生殖细胞及生育过程相关的多种研究问题 。例如，可用于分析精子发生特异性基因的调控元件17,22。该方法也适用于利用小干扰RNA进行基因功能缺失研究23，以及基因功能获得性研究24。此外，已有研究团队表明，该技术在治疗性电穿孔以及转基因后代的制备方面也具有广阔的应用前景18,20,25。

因此，小鼠睾丸 in vivo 电穿孔结合附睾输出管显微注射质粒构建体这一新颖的方法学策略，有望成为成功解析精子发生本质的有力技术。

披露

Marten Michaelis、Alexander Sobczak 和 Joachim M. Weitzel 任职于德国杜默斯托夫莱布尼茨家畜生物学研究所（FBN）生殖生物学研究所，声明他们不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢明斯特大学生殖医学与男科学中心的Birgit Westernstroeer教授传授睾丸显微注射技术。此外，我们感谢Ursula Antkewitz和Petra Reckling提供的技术协助。我们感谢 德国研究基金会（DFG）对本工作的资助（WE2458/10-1）。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
离心机Sigma1-15 PK
分光光度计NanodropND-1000
微量移液器拉制仪NarishigePC-10垂直毛细管拉制仪
显微注射毛细管ClarkGC100-10硼硅酸盐标准壁
微量移液器斜面研磨仪BachoferTyp 462旋转盘式斜面研磨仪
电穿孔仪NepageneCUY 21EDIT方波电穿孔仪
镊形电极NepageneCUY 650P55 mm Ø 圆盘电极
体视显微镜ZeissStemi 2000-C
冷光源ZeissKL 1500LCD
显微注射泵EppendorfFemtojet
显微操作器自制XYZ 三维平移台
外科手术器械FST剪刀、镊子、持针器
精细镊子FSTDumont #5, #7用于输出小管制备
Michel夹施加器FSTMichel, 12029-12
Michel缝合夹FSTMichel, 12040-017.5 x 1.75 mm
外科缝合线Catgut, Markneukirchen, GermanyCatgut 00
带30G针头的注射器B. BraunOmnican 40用于填充微量移液器及麻醉
质粒提取试剂盒PromegaCat. # A2495质粒中量提取
质粒pEGFP-C1ClontechCat. #6084-1CMV启动子 + EGFP
质粒pDsRed2-N1ClontechCat. #6084-1CMV启动子 + DsRed2
快绿染料SigmaF7258-25G用于在ddH2O中稀释
10% 氯胺酮Serum Werk, Bernburg, GermanyUrotamin与赛拉嗪按1:1比例混合使用
2% 赛拉嗪Serum Werk, Bernburg, GermanyXylazin与氯胺酮按1:1比例混合使用
斯迪林消毒液Bode ChemieSterillium消毒
兽用软膏S&K Pharma, GmbHKerato Biciron 5%, Augensalbe眼科软膏，用于防止眼睛干燥
To-Pro-3 碘化物InvitrogenT3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaClCarl Roth3957.1
布洛芬，DolorminJohnson & Johnson Consumer Health Care Germany01094902术后镇痛用解热镇痛药（非甾体抗炎药）儿童溶液
27 mM KClCarl Roth6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2OCarl RothT106.2
18 mM KH2PO4Carl Roth3904.1

参考文献

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