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方法文章

小鼠淋巴结基质细胞的分离

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DOI：

10.3791/51803

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2014年8月19日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Immunoregulation, University of Basel and University Hospital Basel

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

分离淋巴结基质细胞是一个多步骤过程，包括酶消化和机械解离，以获得纤维状网状细胞、淋巴管和血管内皮细胞。在本描述的方法中，采用短时间消化结合自动化的机械解离，以最大程度减少活的淋巴结基质细胞表面标志物的降解。

摘要

包括淋巴结在内的次级淋巴器官由基质细胞组成，这些基质细胞为淋巴细胞的稳态维持、活化和分化提供了结构环境。通过黏附分子CD31和糖蛋白podoplanin（gp38）的表达，已在双阴性细胞群体中鉴定出多种基质细胞亚群，包括T细胞区网状细胞或成纤维性网状细胞、淋巴管内皮细胞、血管内皮细胞以及类似成纤维性网状细胞的周细胞。对于这些不同细胞群体，已描述其具有多种功能，包括分隔和衬覆不同区域、吸引并与其他不同类型细胞相互作用、过滤引流液以及收缩淋巴管。近年来，多个研究团队报道了基质细胞在协调和调控可能对宿主造成危害的细胞毒性T细胞反应中的额外作用。

淋巴结是具有多种不同细胞类型的复杂结构，因此需要采用适当的方法来分离所需细胞群体。目前，淋巴结基质细胞的分离方案主要依赖于酶消化法，并采用不同的孵育时间；然而，基质细胞及其表面分子对这些酶较为敏感，容易导致表面标志物表达丢失和细胞死亡。本文提出一种短时间酶消化结合自动机械解离的方法，以获得存活的单细胞悬液，并维持淋巴结基质细胞表面分子的表达。

引言

淋巴结是特化的结构，在其中启动并协调针对外来和自身抗原的适应性免疫应答。本文所述方法结合了短暂的酶消化与自动化机械移液，以获得淋巴结单细胞悬液，并获取仍维持多种分子表面表达的活性淋巴结基质细胞。

淋巴结基质细胞构成淋巴结的支架结构，并执行三大主要功能：首先，它们过滤体液，以捕获抗原、病原体及其病原体相关分子模式（PAMPs），以及体内存在的细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs）；其次，它们招募并指导抗原呈递细胞（APC）与淋巴细胞相互作用，启动适应性免疫应答；第三，它们为淋巴细胞的稳态维持和分化提供结构环境1-3。在炎症过程中，淋巴结基质细胞产生生长因子、细胞因子和趋化因子，适应淋巴结肿胀，并协调树突状细胞（DCs）、T细胞和B细胞之间的相互作用。这种对免疫应答的协调作用之所以能够实现，依赖于由不同基质细胞群体所形成的复杂结构架构。

淋巴结基质细胞是CD45阴性细胞，可通过成纤维细胞和内皮细胞中CD31或gp38的表达进行区分1-6。Gp38+CD31-标记T细胞区网状细胞（TRC，也称为FRC：成纤维性网状细胞），gp38+CD31+标记淋巴管内皮细胞（LEC），gp38-CD31+标记血管内皮细胞（BEC）。此外，对亚群的进一步表征揭示了其他类型的淋巴结基质细胞的存在。事实上，在gp38-CD31-细胞群中鉴定出一类少量的周细胞样细胞群体7。因此，优化分离步骤有助于鉴定和表征不同淋巴结基质细胞的功能特性。

在开发出淋巴结基质细胞消化方案之前，对淋巴结基质细胞的研究仅限于通过组织切片和显微镜进行的原位观察。然而，结构与功能研究表明，淋巴结基质细胞具有重要的特性。淋巴结基质细胞与podoplanin、胶原蛋白及细胞外基质（ECM）蛋白相关联，形成一种称为导管系统的复杂三维结构，该系统将淋巴液及相关的低分子量蛋白从淋巴结的被膜下窦运输至T细胞区的高内皮微静脉8。树突状细胞（DCs）与基质细胞紧密接触，常可观察到其突起伸入管状导管结构中，以取样液体并检测抗原8。淋巴结基质细胞（TRCs和LECs）与DCs之间的相互作用由趋化因子CCL21和CCL19的释放与呈递所介导9,10。CCL19和CCL21可被CCR7受体识别，从而促进DCs和T细胞迁移至淋巴结的T细胞区4,11。尽管使用相似的趋化因子，DCs和T细胞进入淋巴结的迁移路径却不同12。随后，通过酶消化法处理淋巴结并分离纯化的淋巴结基质细胞，研究人员得以开展功能研究，探讨不同类型淋巴结基质细胞的作用及其与DCs和T/B细胞相互作用的能力6,13。首先，产生IFN-γ的效应T细胞与淋巴结基质细胞之间的相互作用可诱导代谢产物一氧化氮的生成，后者已被证明可抑制次级淋巴器官中T细胞的反应和增殖14-16。其次，已有报道指出，淋巴结基质细胞可通过分泌IL-10支持调节性DC亚群的分化17，并通过产生IL-7调节初始T细胞的稳态6,18。第三，淋巴结基质细胞表达TLR，提示这些基质细胞可能对感染信号或组织损伤过程中释放的自身分子产生响应。事实上，用TLR3配体poly(I:C)处理淋巴结基质细胞可轻微上调主要组织相容性复合体I类分子的表达，并上调共抑制分子PD-L1的表达，但不诱导共刺激分子的表达，从而导致外周组织抗原表达发生显著变化19。多个研究团队已证实，淋巴结基质细胞表达外周组织抗原，并可诱导自身反应性T细胞的耐受19,21-27。因此，深入理解淋巴结基质细胞与其他迁移性和定居性淋巴结细胞之间的相互作用，将有助于发现新的靶分子，以在炎症过程中调控免疫应答的激活或抑制。因此，有必要实施已发表的淋巴结酶分离方法。

既往发表的实验方案采用不同组合的胶原酶消化法并结合较低的机械剪切力6,19,20。然而，长时间的消化酶孵育或不同的消化酶组合可能会降解多种用于分析活化状态及鉴定新的淋巴结基质细胞所需的表面分子。根据基质细胞分析的类型，Link方案或Fletcher方案可能更为适用。在本描述的方法中，采用稍短时间的酶消化并结合自动化机械解离，以最大程度减少活淋巴结基质细胞表面标志物的降解。该方法可实现高度可重复的淋巴结基质细胞亚群分离与区分，变异度低，细胞存活率超过95%。新分离的淋巴结基质细胞可直接用于表面标志物表达分析、蛋白质分析和转录水平研究，也可用于建立基质细胞系，以开展体外功能实验in vitro。

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方案

在本视频出版物和方案中，所有动物实验操作均依照瑞士巴塞尔城市州州级主管部门批准的动物实验方案进行。

1. 淋巴结的制备与消化

  1. 将烧杯中的水置于磁力搅拌器加热板上预热至 37 °C。
  2. 配制基础培养基：在不含丙酮酸盐的 DMEM 培养基中添加 2% 胎牛血清（FCS）、1.2 mM CaCl2 以及青霉素/链霉素（青霉素 100 单位，链霉素 100 µg）。
  3. 使用前对所有解剖器械进行灭菌处理。
  4. 采用 CO2 窒息法处死淋巴结供体小鼠，并无菌解剖获取淋巴结。避免解剖周围脂肪组织。注：本方案优化用于外周皮肤引流淋巴结（腹股沟、臂部、腋窝淋巴结）。
  5. 将淋巴结置于含有 2 ml 冰上预冷的基础培养基的无菌培养皿中。
  6. 使用固定在 1 ml 注射器上的两根 25 G 针头破坏淋巴结包膜。
  7. 将破碎后的淋巴结组织转移至含有 750 µl 基础培养基的 5 ml 聚丙烯圆底管中，培养基中添加 1 mg/ml IV 型胶原酶和 40 µg/ml I 型 DNase。
  8. 每管中加入一个无菌磁力搅拌子。
  9. 将试管放入盛有 37 °C 预热去离子水的烧杯中，以缓慢速度（每秒 1 圈）搅拌 30 分钟。
  10. 从磁力搅拌加热板上取出试管，静置使淋巴结碎片沉降。
  11. 小心移除富含"非基质细胞"的上清液。注：若计划分析 T 细胞、B 细胞、树突状细胞及 CD45-gp38-CD31- 细胞，请保存"非基质细胞"组分。
  12. 用 750 µl 基础培养基洗涤残留的淋巴结组织一次。注：此步骤仅在使用免疫功能健全小鼠时需要。
  13. 静置使淋巴结碎片沉降。
  14. 移除漂浮的非基质细胞组分。
  15. 向淋巴结碎片中加入 750 µl 基础培养基，其中添加 3.5 mg/ml D 型胶原酶和 40 µg/ml DNase I。
  16. 将试管重新放回盛有 37 °C 预热去离子水的烧杯中。
  17. 在缓慢搅拌条件下消化淋巴结组织 5 分钟。
  18. 使用自动多通道移液器以最大速度反复吹打 700 µl 液体，进行 10 个循环，以分散淋巴结组织碎片。注：此步骤有助于破坏组织结构，提高消化效率。
  19. 将试管重新放回盛有 37 °C 预热去离子水的烧杯中。
  20. 继续在缓慢搅拌条件下消化淋巴结组织碎片 10 分钟。
  21. 使用自动多通道移液器以最大速度反复吹打混合 99 个循环，进一步分散淋巴结组织碎片。
  22. 加入 7.5 µl 0.5 M EDTA，以维持单细胞悬液状态。
  23. 再次使用自动多通道移液器以最大速度反复吹打混合 99 个循环，进一步分散淋巴结组织碎片。
  24. 加入 750 µl 基础培养基，并将细胞悬液通过 70 µm 尼龙滤网过滤。
  25. 将细胞悬液在 4 °C 条件下以 1,500 x g 离心 5 分钟。
  26. 此时基质细胞可用于后续分析。

2. 淋巴结基质细胞染色

  1. 使用抗 CD45、抗 podoplanin（gp38）、抗 CD31 抗体组合，可成功识别 TRC、LEC、BEC 和 DN 细胞。
  2. 将消化后的淋巴结组织与活/死细胞标记物、抗-CD45-FITC（1:200）、抗-gp38-PE（1:200）、抗-CD31-APC（1:200）在含有2% FCS的100 μl HBSS中于4 °C避光孵育至少20分钟。
  3. 加入500 μl含2% FCS的HBSS洗涤细胞
  4. 在4°C、1500 × g条件下离心细胞悬液3分钟。
  5. 用含2% FCS的HBSS重悬至100 μl。
  6. 使用配备以下光学系统的流式细胞仪检测染色后的细胞：激发光源最多包含三种激光器，分别为蓝色（488 nm，空气冷却，20 mW 固态）、红色（633 nm，17 mW 氦氖）和紫色（405 nm，30 mW 固态）。
  7. 门控 CD45- 排除造血细胞。
  8. 通过门控单细胞（FSC-W）和活细胞（LIVE/DEAD 示踪剂）排除双联体和死细胞。
  9. 绘制 gp38 与 CD31 用于可视化 TRC（gp38）+CD31-），LEC（gp38+CD31+），BEC（gp38-CD31+）和 DN（gp38-CD31-）细胞（参见 图1).

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结果

本方案改编自Link 等于2007年发表的消化法6，由于采用自动化多通道移液器进行机械解离，消化时间更短（最长45分钟）。此外，该方法更具标准化，可最大限度减少不同淋巴结基质细胞表面标志物的降解，并支持同时处理多个样本。

在Links方案6和本方案中使用的胶原酶IV和胶原酶D，或在Fletchers方案13中使用的胶原酶P和中性蛋白酶，均可维持淋巴结基质细胞的活力，并避免消化包括CD45、gp38和CD31在内的多种表面标志物。为验证本方案，切除腋窝、臂部和腹股沟淋巴结并进行消化以分离其基质细胞。对CD45、gp38和CD31表达的分析显示，从C57BL/6小鼠中分离出了滤泡树突状细胞（TRC）、淋巴管内皮细胞（LEC）、血管内皮细胞（BEC）和双阴性细胞（DN）（图1，设门策略）。

机械应力可能在消化过程中降低淋巴结基质细胞的存活率。通过比较三种不同方案分离的基质细胞亚群的存活率，发现Fletcher方案中细...

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讨论

由于两种已发表的消化方案的出现，淋巴结基质细胞的研究最近成为研究焦点6,13。这两种方案均能够获得单个淋巴结基质细胞，但在消化酶的使用和消化时间上存在差异。由于基质细胞及其表面标志物对酶消化和机械应力敏感，因此需要优化的实验方案。

从新鲜解剖的淋巴结中分离出有活力的淋巴结基质细胞，是进行表型和功能分析的第一步。因此，使用确定浓度的酶、在稳定的温度下并按照指定时间进行仔细消化至关重要。已有两种消化方案被描述6,13，但其消化步骤相对较长。为了缩短消化时间，本方案引入了机械性解离，并使用多通道移液器进行了标准化操作。当前方案的一个优势在于，仅需45分钟即可完成基质细胞的分离，从而最大限度地减少了细胞与消化酶的孵育时间。此外，消化过程中持续搅拌有助于消化酶充分接触淋巴结结构。同时，消化体积被减少至750 µl，从而降低了酶的使用量。

过大的机械力会破坏紧密连接，但同时可能导致细胞死亡。因此，我们测试了多种重悬循环次数与不同解离装置的组合。我们发现，使用自动化多通道移液器仅需两次、每次99个...

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披露

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

作者感谢Sanjiv Luther及其同事在建立当前淋巴结消化方案过程中提供的有益讨论。本研究由瑞士国家科学基金会（SNF）授予S.W.R.的项目PPOOA-_119204和PPOOP3_144918资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCS终浓度 2%
CaCl2Sigma499609终浓度 1.2 mM
胶原酶IV沃辛顿生物化学公司>每毫克干重160单位，使用终浓度为1 mg/ml
胶原酶D罗氏11088882001使用浓度为 3.5 mg/ml
DNAse I罗氏 1128493200140时使用 µ微克/毫升
搅拌磁子FAUST5 mm 长-2 mm ø
5 ml 聚苯乙烯圆底管Falcon-BD 生物科学
带加热功能的磁力搅拌器IKA-RCT-standard9720250
100 mm 无菌培养皿TPP6223201
25 G 针头Terumo
抗小鼠 CD45 抗体Biolegend克隆 30-F11
抗小鼠 CD11c 抗体Biolegend克隆 N418
抗小鼠 Podoplanin 抗体Biolegend克隆 8.1.1
抗小鼠 CD31 抗体Biolegend克隆 MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus，多通道		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µ最大体积
抗小鼠 CD140aBiolegend克隆 APA5
抗小鼠 CD80Biolegend克隆 16-10A1
抗小鼠 CD40Biolegend克隆 1C10
抗小鼠 I-AbBiolegend克隆 AF6-120.1
抗小鼠 CD274（PD-L1）Biolegend克隆 10F.9G2
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒InvitrogenL10119

参考文献

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