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方法文章

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

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DOI：

10.3791/51805

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2014年10月20日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

本文内容

摘要

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。

摘要

许多重要的信号受体通过网格蛋白介导的内吞作用（CME）这一被广泛研究的过程实现内化。传统的细胞生物学检测方法通过测量内吞作用的整体变化，已鉴定出30多种参与CME的已知组分，而生物化学研究则构建了其中许多组分之间的相互作用图谱。然而，目前越来越明确的是，CME是一个高度动态的过程，其调控机制复杂而精细。在本文中，我们描述了如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜，在活细胞中实时直接观察介导该过程的网格蛋白介导内吞机制各组分在单个事件水平上的动态行为。这种方法对于揭示那些能够在不全局阻断内吞作用的前提下改变其功能的细微变化至关重要，这类变化常见于生理条件下的调控过程。我们将重点介绍如何利用该技术分析一个新兴研究领域——货物分子组成在调控不同网格蛋白包被小窝（CCPs）动态行为中的作用。本实验方案适用于多种广泛可得的荧光探针，也可用于观察从细胞表面内化的多种货物分子的动态过程。

引言

网格蛋白介导的内吞作用（CME）过程依赖于网格蛋白介导的内吞机制中多种组分的精确时序到达，以聚集货物并将质膜变形形成囊泡1-3。CME 由膜变形蛋白和货物衔接蛋白共同启动，这些蛋白在内吞作用的新生位点处聚集1。这些蛋白招募网格蛋白这一包被蛋白，后者组装成笼状结构，形成网格蛋白包被的凹陷（CCP）4。一旦 CCP 完全组装成球形结构，膜断裂过程（主要由大型 GTP 酶 dynamin 介导）便产生游离的网格蛋白包被囊泡（CCVs）5,6。这一内化过程触发网格蛋白包被的快速解体，使各组分得以在多轮 CME 中重复利用。

参与网格蛋白介导的内吞作用（CME）的蛋白质的发现与表征，主要基于传统的生物化学、遗传学和显微镜技术4-6,8。这些实验方法阐明了内吞组分的功能及其相互作用位点。尽管这些方法在确定运输机制中的关键组分方面非常有用，但在捕捉CME组分或货物浓度的动态行为方面存在显著局限性。这是一个关键的限制因素，因为CME依赖于一系列蛋白质模块按照特定步骤协调组装，且单个内吞事件动力学的微小变化可能对内吞过程产生显著的累积效应。此外，近期的研究数据表明，单个网格蛋白包被小窝（CCP）在组成和行为上可能存在差异，提示该过程的生理调控在空间和时间上均受到高度限制9-14。因此，对单个内吞事件进行可视化观察，对于理解为何CME中存在多个功能冗余的蛋白质，以及这些蛋白质如何受生理信号调控以调节货物的内化，具有重要意义。

本文介绍了如何利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在活细胞中观察单个网格蛋白包被小窝（CCP）动态水平上的网格蛋白介导的内吞作用（CME）。TIRFM 的原理基于玻璃盖玻片与细胞所处液体环境之间折射率的差异15,16。当激发光以大于临界角的角度入射到细胞时，光线会在界面处发生全内反射，产生一种称为隐逝波的电磁场，其照明范围仅延伸至盖玻片上方约 100 nm 的薄层区域内。因此，只有位于这一狭窄区域内的荧光分子才会被激发。在实际应用中，这种方法可以选择性地激发细胞质膜上或靠近质膜的荧光分子，同时极大程度地减少细胞内部荧光信号的干扰。与常规的落射荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜等常用成像模式相比，TIRFM 能够显著提高信噪比和 z 轴分辨率，从而更清晰地观察质膜上的生物学事件。此外，本文还从基础和实践角度介绍了如何使用一种常用的图像分析平台，对单个内吞事件中货物分子的简单形态特征及其动态行为进行分析与定量。

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方案

1. 培养细胞中荧光标记的网格蛋白介导的内吞作用组分的表达

HEK293细胞是研究GPCR生物学和内吞作用的常用模型细胞，因此本方案中将其作为模型使用。请选择一种转染方案，以实现均匀表达，避免过表达，并具有较低的细胞毒性。

  1. 所有细胞培养操作均须在无菌的层流罩中进行。向12孔板的4个孔中各加入1 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良必需培养基（DMEM）。从一个融合度达到100%的T25培养瓶中，将HEK293细胞按1:50、1:25、1:16和1:10的比例分别稀释后接种至这4个孔中。
    1. 或者，可根据试剂盒说明书将细胞接种至所需规格的多孔板中。在12孔板中每孔接种0.4–2 × 104个细胞。将细胞置于无菌、37 °C、5% CO2和95%湿度条件下培养过夜。
      注意：由于不同实验条件和细胞系的生长速率存在差异，建议接种多个孔，以确保次日转染时达到理想的融合度，或可进行重复转染实验。
  2. 次日上午，选择一个融合度约为70%的孔进行转染（参见图1B）。若无任何孔达到该状态，则继续培养一天。
    注意：70%融合度最适合HEK293细胞。细胞密度过低时进行转染会导致细胞死亡和毒性；而融合度过高则会导致表达效率低下。
  3. 根据试剂盒说明书，在1.5 mL微量离心管中加入60 µL EC缓冲液（来自转染试剂盒）、400 ng编码带标签G蛋白偶联受体（GPCR）和/或网格蛋白相关组分的质粒DNA，以及2.4 µL增强剂。涡旋振荡2秒以充分混匀，随后在微量离心机中以2,000 × g离心2秒，使液体沉降至管底。
  4. 根据试剂盒说明书加入6 μL Effectene试剂。涡旋振荡2秒，再于微量离心机中以2,000 × g离心2秒，使液体沉至管底。室温静置20分钟，以促进转染复合物胶束的形成。
  5. 吸除待转染孔中的培养基。将0.8 mL含10% FBS的DMEM缓慢加入转染试剂混合物中，通过轻柔吹打混匀，避免破坏胶束结构。将培养基与转染混合物沿孔壁缓慢加入孔中。使用微量移液器将微量离心管中剩余的转染混合物全部转移至孔内。
    注意：可选操作，可在转染孔中额外添加0.5 mL含10% FBS的DMEM，为细胞提供更多营养，从而减轻转染压力，降低瞬时表达水平。
  6. 将细胞放回37 °C培养箱中孵育5小时。
  7. 吸除含有转染混合物的培养基，更换为1 mL含10% FBS的DMEM。继续培养过夜。
  8. 次日，将细胞传代至已通过高压灭菌预处理的未包被盖玻片上。
    1. 向每个孔中加入0.5 mL含1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）。或者，可使用0.5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。置于培养箱中孵育1分钟。
    2. 将3个圆形无菌25 mm盖玻片分别放入6孔板的3个孔中。每孔加入2 mL培养基。轻柔地将盖玻片压至孔底，防止细胞在盖玻片底部生长。
    3. 手动轻轻晃动孔板，使细胞从孔底脱落。加入1 mL含10% FBS的DMEM重悬细胞。将1个12孔板孔中的细胞均匀分配至3个盖玻片上。或者，也可将细胞接种至3个底部为玻璃的培养皿中。
  9. 将细胞在盖玻片上继续培养至少48小时后再进行成像。确保细胞充分铺展且形态扁平。

2. 使用全内反射荧光显微镜成像网格蛋白包被小窝及货物动态

  1. 使用 Alexa Fluor 蛋白质标记试剂盒，按照制造商方案将 M1 抗 FLAG 抗体与 Alexa 染料进行偶联。或者，也可直接购买预偶联抗体。
  2. 用1 ml预热的含10% FBS的Leibovitz培养基，或含50 mM HEPES（pH 7.4）和10% FBS的Opti-MEM培养基（成像培养基），将抗体按1:1,000稀释，与细胞在37 °C预孵育10分钟，以标记细胞表面的FLAG标签GPCR。若使用GFP等基因编码的荧光蛋白作为标签，则可省略上述步骤（详见讨论部分）。
  3. 将盖玻片转移至活细胞成像培养皿中。或者，对于玻璃底培养皿，吸除抗体标记培养基，加入700 µl预温的成像培养基。
    1. 使用一对镊子将25号针头的尖端弯成钩状。
    2. 用优势手持一把镊子，另一只手握住弯针。旋转针头，使钩端向下朝向玻璃面。将针头钩面向下，轻轻在6孔板底部拖动，直至钩住盖玻片。注意不要刮擦盖玻片表面，以免导致细胞脱落。轻轻将盖玻片从孔底提起，并将其倚靠在孔壁上以保持平衡。
    3. 用镊子夹住盖玻片边缘附近，将细胞面向上的盖玻片转移至成像室，并组装成像室。加入700 µl（或适量）预热的成像培养基。操作盖玻片时应轻柔，避免施加压力，以防破裂或损坏。
  4. 将培养室转移至显微镜上，并使用载物台加热器或封闭式培养箱将细胞温度维持在37 °C。
  5. 使用100倍或60倍TIRF油镜物镜（数值孔径1.45或更高）将细胞调至焦点。采用常规落射荧光或共聚焦照明模式对细胞进行成像。即 使用非TIRFM（全内反射荧光显微镜）模式来识别表达适当构建体的细胞。由于TIRF照明的照明深度较薄，失焦的细胞几乎不可见，因此难以找到焦平面和细胞。
    注意：某些系统通过将激光入射角调整至临界角以上，利用TIRFM的相同激光器进行常规落射荧光成像。作为重要的安全预防措施，务必始终注意激光束的角度，并始终将其导向远离观察者的方向。
  6. 向下聚焦至表达细胞的底面，直至细胞周围质膜的轮廓消失，细胞中心显现。这一现象在质膜定位的货物蛋白（如 µ-阿片受体）中最为明显（参见 图2A).
  7. 切换至全内反射荧光成像。
    1. 若在常规落射荧光成像中使用相同的激光，应增大激光的入射角度，直至细胞内部的离焦荧光消失，且细胞周围血浆膜的轮廓不可见。（比较 图2C 至 图2A 和 2B)
      注意：在全内反射荧光显微镜（TIRFM）中，移动焦平面会导致图像完全失焦和/或变暗，由于照明深度较浅，整体荧光强度会降低。因此，切换至TIRFM照明的另一种方法是：首先在共聚焦或常规落射荧光模式下对准细胞中心聚焦，然后逐渐增大入射角直至大部分荧光消失，再向下聚焦至细胞质膜。
    2. 一旦进入TIRFM状态，确保激发激光经物镜反射后不会在物镜上方可见。通过观察激光光斑是否可见来确认这一点。
      注意：在传统的落射荧光或共聚焦模式下，激光照明可见于物镜上方，例如出现在天花板上。
    3. 调整焦距以获得清晰的图像。内吞作用相关机器的主要组分（如网格蛋白）将以点状结构显现。精细调节焦距，使点状结构尽可能呈圆形。
      注意：对于膜定位的货物，需调节细准焦螺旋，直至丝状伪足清晰可见。
    4. 使用采集程序保存所有成像参数，例如镜面设置和TIRF角度。对所有必要的波长执行此操作。
  8. 扫描盖玻片以寻找表达所有目标内吞标志物的细胞：在所示示例中为目标细胞表达 µ-阿片受体及衔接蛋白 β-arrestin 图3A选择表达但不过度表达的细胞。详见讨论部分。
  9. 一旦识别出细胞，每隔3秒采集一次图像，持续10分钟。此时间足以捕捉到网格蛋白包被坑（CCP）的整个生命周期，因为在上述条件下成像的HEK293细胞中，CCP的平均寿命约为40秒。10-11这可以提供约12-14帧来观察CCP。例如见 视频 1重复所有步骤以成像更多细胞。

3. 通过手动验证分析内吞动态

尽管通过人工验证 CCP 寿命会受到可检测到的 CCP 数量的极大限制，但它仍然是一种准确的检测方法，不受图像全局变化和检测伪影的干扰。详见讨论部分。

  1. 在 ImageJ 中打开文件。图像以单个 TIFF 文件堆栈形式存储，通道交错。将图像转换为超堆栈。转到 Image > 超堆栈 > 从堆栈转换为多通道堆栈。输入获取的通道数量（即 如果对β-arrestin和µ-阿片受体进行成像，输入2；Z轴层扫描输入1（TIRFM为单层平面），以及视频的帧数（即 弹出窗口中，每3秒1帧、持续10分钟的视频为200帧。
  2. 超堆栈格式会生成一个带有两个滚动条的窗口。使用上方的滚动条切换通道，使用下方的滚动条浏览时间序列。滚动至待测定寿命的蛋白质所在通道。
  3. 移动到视频的第10帧或第15帧，以减少包含那些持续时间未完整显示的预先存在的CCPs。在随机选择的一个斑点周围绘制一个ROI框。
  4. 统计一个斑点可见的帧数。
    注意：参见 图3B 和 3C 内吞事件三种形态学类别的示例10,11,16-19.

通过客观识别分析内吞动态

客观识别能够检测细胞中几乎所有成像的网格蛋白包被 pits（CCPs），但可能因错误结构的伪阳性检测而产生误差。详见讨论部分对每种方法优缺点的权衡。多种程序（包括自定义算法）可用于客观地检测CCPs。本方案描述了使用Imaris（一种图像分析软件，参见材料）进行CCPs的客观识别。

  1. 首先，在图像分析软件中打开原始图像文件。默认情况下，会显示一幅合并的彩色图像。使用“Display Adjustment”窗口调节某一通道的亮度。点击通道名称可更改其显示颜色。取消勾选通道旁的复选框，可阻止该通道显示（见图4A）。
  2. 点击带有橙色斑点的图标以创建“Spots”（斑点）。见图4B。在细胞周围选择一个感兴趣区域（ROI）。见图4C。使用ROI排除那些会错误检测明亮前沿和斑块的区域。对表达水平不同的多个细胞分别进行分析。
  3. 测量一个斑点的直径，为算法提供初始估计值。切换至“Slice”模式，点击斑点的两极以测量其直径。见图4E。对4至5个呈圆形、形态典型、处于形成后至断裂前最稳定阶段的CCP样斑点进行测量。利用这些测量值计算平均直径，精确到最接近的十分之一微米。
  4. 检测斑点。返回“Surpass”模式。选择用于检测的合适通道。输入测得的平均直径，通常为0.3或0.4 μm。点击蓝色前进箭头以量化斑点。见图4E。若斑点直径被低估，荧光中的伪影点将被误识别为斑点；若直径设置过大，则真实的斑点将被忽略。当不确定时，建议略偏低估计，后续再通过过滤去除错误检测。
  5. 按质量过滤斑点。调整过滤器以尽可能多地捕获斑点，同时避免背景干扰。默认选择“Quality”（质量）过滤器20。见图4F。
    1. 使用“Quality”曲线作为参考，设定合适的阈值。用鼠标左键拖动过滤器的下限至曲线上第一个低谷处。这通常是过滤器的良好起点，因为该位置通常能将检测结果优化为仅保留可见的斑点。见图4F。
    2. 检测到的斑点将以球体或中心像素的形式显示在视频中。使用“Colors”选项卡，将斑点颜色调整为与背景对比明显的颜色，以便更清晰地观察。滚动浏览视频，逐帧检查斑点。目标是在其整个生命周期内尽可能多地检测到斑点。
    3. 较暗的斑点可予以剔除，或在后续手动连接成连续轨迹，因为它们在其生命周期中检测效果较差。
    4. 如有需要，可通过“Intensity”（强度）过滤器去除明亮的斑块。点击绿色加号以添加新过滤器。见图4F。创建强度过滤器，用于筛选特定荧光信号强度的斑点。利用生成的强度曲线（类似于4.5节中讨论的质量曲线）设定阈值。使用鼠标左键去除曲线最左端代表最亮斑点的部分。
      注：大型斑块结构通常是细胞中最亮的成分之一，可通过此过滤器轻松排除。
    5. 滚动浏览视频，确保CCP被正确检测为斑点，而最亮的斑块不再被检测到。图3D展示了一个细胞示例，其中CCP（以白色球体表示）的检测通过质量过滤器进行了优化，同时斑块也被成功排除。
    6. 使用质量过滤器降低明亮细胞边缘的影响。在下一步中，仍可能需要手动移除部分明亮物体。继续点击蓝色箭头。
    7. 在“Edit Spots”（编辑斑点）界面中删除异常斑点。切换至“Select”模式。点击目标斑点，其将变为黄色。点击“Delete”删除。点击蓝色箭头继续构建算法。见图4G。
  6. 测量轨迹。将轨迹模式设为“Brownian motion”（布朗运动）。CCP不应表现出定向移动，仅在质膜上发生轻微漂移。该算法最适合此类运动。见图4H。
    1. 将最大距离（Max Distance）设为较小值，例如0.7 µm。见图4H。
      注：设置较小距离可最小化相邻斑点之间的错误连接，同时仍允许在CCP或细胞移动过程中持续追踪同一斑点。
    2. 将最大间隙大小（Max Gap Size）设为1。这允许在连续缺失一帧的情况下仍延续轨迹。点击蓝色箭头以计算轨迹。见图4H。
      注：若间隙大小超过3，会导致不同轨迹被错误连接。
    3. 将轨迹显示模式切换为“Dragon Tail”（龙尾）。滚动浏览视频，观察检测质量。若发现相邻斑点被错误连接，应将最大距离调至低于0.7 µm；若斑点过早断裂，则应增大最大间隙大小。点击蓝色箭头生成轨迹。这将进入过滤轨迹界面。见图4H。
  7. 过滤轨迹并导出数据。使用“Intensity”过滤器进一步去除明亮斑块。使用“Displacement”（位移）过滤器去除进入TIRF视野的内体。需谨慎操作，因为较长的斑点本身也会产生较大的位移。点击绿色双箭头以完成实验流程。见图4I。
    1. 使用带有铅笔图标的“Edit Tracks”选项卡，手动删除无法通过过滤器去除的假阳性轨迹。检查是否存在不连续或错误连接的情况。如需连接两条轨迹，按住Ctrl键并左键点击选择它们，然后在“Edit Tracks”框中点击“Connect”（连接）。如需将轨迹断开为独立斑点，选择目标轨迹后点击“Disconnect”（断开）。按住Ctrl键并左键点击选择多个斑点，然后点击“Connect”以创建新轨迹。该方法与4.5.7节中描述的编辑斑点方法相同。见图4J。
    2. 如需导出数据，请进入统计选项卡。点击单个软盘图标以导出选定的统计量。点击类似一串软盘的图标以导出所有统计量。“Track Duration”（轨迹持续时间）统计量包含内吞轨迹的长度。见图4K。

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结果

利用活细胞全内反射荧光显微镜（TIRF），我们记录了μ-阿片受体（MOR）——一种G蛋白偶联受体（GPCR）——及其内吞接头蛋白β-arrestin的内吞动态过程。根据图1中所述方案，将β-arrestin表达质粒瞬时转染至稳定表达MOR的细胞系中，并在96小时后进行成像观察。该稳定细胞系中的MOR在其N端标记有pH敏感型GFP。这种荧光蛋白仅在中性的细胞外液中发出荧光。此外，MOR仅在激动剂激活后发生内吞，在未激活状态下则均匀分布于质膜上。在共聚焦模式下聚焦于贴附在盖玻片上的质膜时，细胞呈现为内部弥散的弱荧光填充状态；而若聚焦于细胞中心，则质膜仅表现为围绕细胞边缘的一圈荧光环。请比较图2A中的左右两幅图像。切换至传统的落射荧光或角度不合适的TIRF成像时，同一细胞中会出现明显的离焦荧光信号，如图2B所示。当TIRF成像角度正确时，质膜图像变得非常清晰、锐利且明亮，离焦荧光不再干扰成像效果。请将图2C与图2A和图2B进行比较。

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讨论

本文描述了利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在活细胞中实时观察单个网格蛋白包被小窝（CCP）水平上的网格蛋白介导的内吞作用（CME）。CME 是一个快速且高度动态的过程，由许多在空间和时间上相互分离的独立事件共同作用而形成。目前常用的大多数检测方法，例如利用细胞表面生物素化或配体结合进行内化程度的生化测定、通过流式细胞术或固定细胞检测内化蛋白的含量，以及通过电子显微镜定位蛋白位置等，均只能在固定时间点监测蛋白定位的整体变化。这些现有方法在鉴定参与 CME 所必需的蛋白方面非常有用，但缺乏与 CME 或其他动态膜运输过程生理尺度相匹配的空间和时间分辨率。这一点至关重要，因为最近的研究证据表明，CCP 在蛋白组成和动力学方面具有异质性9-12，且 CME 很可能以空间上离散的方式被快速调控。活细胞 TIRFM 技术使得能够在活细胞中实时分析空间上分离的单个 CCP 水平的 CME 过程。

成功应用这一强大检测方法依赖于两个关键因素：细胞的良好状态以及对网格蛋白介导的内吞作用（CME）参数的充分分析。对于前者，正确表达带标签蛋白并采用尽量减少光毒性的显微镜技术至关...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 C. Szalinski 博士、H. Teng 博士和 M. Bruchez 博士在 Imaris 软件使用方面的帮助，感谢 R. Vistein 和 D. Shiwarski 提供的技术支持与建议，并感谢 M von Zastrow 博士、T Kirchhausen 博士、D Drubin 博士和 W Almers 博士提供试剂以及富有启发性的讨论。本研究由资助项目 T32 NS007433（授予 SLB）以及 NIH DA024698 和 DA036086（授予 MAP）提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM高糖培养基Fisher Scientific SH3024301
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙、无镁Gibco, by Life Technologies21600-010
EDTA游离酸Amresco0322-500G
胎牛血清Gibco, by Life Technologies10437-028
Leibovitz L-15培养基，无酚红Gibco, by Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, by Life Technologies
HEPESCellPURE by Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425转染试剂
25 mm 盖玻片Fisher Scientific12-545-86
Corning 细胞培养处理烧瓶，25 cm2Fisher Scientific10-126-28
细胞培养6孔板Greiner Bio-One, by VWR82050-896
单克隆 ANTI-FLAG M1 抗体Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-脑啡肽醋酸盐（DAMGO）Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 蛋白标记试剂盒Life TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris 图像分析软件BitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris，用于自动分析
Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜及所需配件，包括滤光块和滤光片Nikon
适用于Nikon Eclipse Ti的Nikon TIRF附件及所需适配器Nikon用于调节入射角
iXon+ EMCCD 相机及适配器Andor

参考文献

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通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用
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