网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
许多重要的信号受体通过网格蛋白介导的内吞作用（CME）这一被广泛研究的过程实现内化。传统的细胞生物学检测方法通过测量内吞作用的整体变化，已鉴定出30多种参与CME的已知组分，而生物化学研究则构建了其中许多组分之间的相互作用图谱。然而，目前越来越明确的是，CME是一个高度动态的过程，其调控机制复杂而精细。在本文中，我们描述了如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜，在活细胞中实时直接观察介导该过程的网格蛋白介导内吞机制各组分在单个事件水平上的动态行为。这种方法对于揭示那些能够在不全局阻断内吞作用的前提下改变其功能的细微变化至关重要，这类变化常见于生理条件下的调控过程。我们将重点介绍如何利用该技术分析一个新兴研究领域——货物分子组成在调控不同网格蛋白包被小窝（CCPs）动态行为中的作用。本实验方案适用于多种广泛可得的荧光探针，也可用于观察从细胞表面内化的多种货物分子的动态过程。
引言
网格蛋白介导的内吞作用（CME）过程依赖于网格蛋白介导的内吞机制中多种组分的精确时序到达，以聚集货物并将质膜变形形成囊泡1-3。CME 由膜变形蛋白和货物衔接蛋白共同启动，这些蛋白在内吞作用的新生位点处聚集1。这些蛋白招募网格蛋白这一包被蛋白，后者组装成笼状结构，形成网格蛋白包被的凹陷（CCP）4。一旦 CCP 完全组装成球形结构，膜断裂过程（主要由大型 GTP 酶 dynamin 介导）便产生游离的网格蛋白包被囊泡（CCVs）5,6。这一内化过程触发网格蛋白包被的快速解体，使各组分得以在多轮 CME 中重复利用。
参与网格蛋白介导的内吞作用（CME）的蛋白质的发现与表征，主要基于传统的生物化学、遗传学和显微镜技术4-6,8。这些实验方法阐明了内吞组分的功能及其相互作用位点。尽管这些方法在确定运输机制中的关键组分方面非常有用，但在捕捉CME组分或货物浓度的动态行为方面存在显著局限性。这是一个关键的限制因素，因为CME依赖于一系列蛋白质模块按照特定步骤协调组装，且单个内吞事件动力学的微小变化可能对内吞过程产生显著的累积效应。此外，近期的研究数据表明，单个网格蛋白包被小窝（CCP）在组成和行为上可能存在差异，提示该过程的生理调控在空间和时间上均受到高度限制9-14。因此，对单个内吞事件进行可视化观察，对于理解为何CME中存在多个功能冗余的蛋白质，以及....
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方案
1. 培养细胞中荧光标记的网格蛋白介导的内吞作用组分的表达
HEK293细胞是研究GPCR生物学和内吞作用的常用模型细胞，因此本方案中将其作为模型使用。请选择一种转染方案，以实现均匀表达，避免过表达，并具有较低的细胞毒性。
- 所有细胞培养操作均须在无菌的层流罩中进行。向12孔板的4个孔中各加入1 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良必需培养基（DMEM）。从一个融合度达到100%的T25培养瓶中，将HEK293细胞按1:50、1:25、1:16和1:10的比例分别稀释后接种至这4个孔中。
- 或者，可根据试剂盒说明书将细胞接种至所需规格的多孔板中。在12孔板中每孔接种0.4–2 × 104个细胞。将细胞置于无菌、37 °C、5% CO2和95%湿度条件下培养过夜。
注意：由于不同实验条件和细胞系的生长速率存在差异，建议接种多个孔，以确保次日转染时达到理想的融合度，或可进行重复转染实验。
- 或者，可根据试剂盒说明书将细胞接种至所需规格的多孔板中。在12孔板中每孔接种0.4–2 × 104个细胞。将细胞置于无菌、37 °C、5% CO2和95%湿度条件下培养过夜。
- 次日上午，选择一个融合度约为70%的孔进行转染（参见图1B）。若无任何孔达到该状态，则继续培养一天。
注意：70%融合度最适合HEK293细胞。细胞密度过低时进行转染会导致细胞死亡和毒性；而融合度过高则会导致表达效率低下。 - 根据试剂盒说明书，在1.5 mL微量离心管中加入60....
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结果
利用活细胞全内反射荧光显微镜（TIRF），我们记录了μ-阿片受体（MOR）——一种G蛋白偶联受体（GPCR）——及其内吞接头蛋白β-arrestin的内吞动态过程。根据图1中所述方案，将β-arrestin表达质粒瞬时转染至稳定表达MOR的细胞系中，并在96小时后进行成像观察。该稳定细胞系中的MOR在其N端标记有pH敏感型GFP。这种荧光蛋白仅在中性的细胞外液中发出荧光。此外，MOR仅在激动剂激活后发生内吞，在未激活状态下则均匀分布于质膜上。在共聚焦模式下聚焦于贴附在盖玻片上的质膜时，细胞呈现为内部弥散的弱荧光填充状态；而若聚焦于细胞中心，则质膜仅表现为围绕细胞边缘的一圈荧光环。请比较图2A中的左右两幅图像。切换至传统的落射荧光或角度不合适的TIRF成像时，同一细胞中会出现明显的离焦荧光信号，如图2B所示。当TIRF成像角度正确时，质膜图像变得非常清晰、锐利且明亮，离焦荧光不再干扰成像效果。请将图2C与图2A和图2B进行比较。
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讨论
本文描述了利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）在活细胞中实时观察单个网格蛋白包被小窝（CCP）水平上的网格蛋白介导的内吞作用（CME）。CME 是一个快速且高度动态的过程，由许多在空间和时间上相互分离的独立事件共同作用而形成。目前常用的大多数检测方法，例如利用细胞表面生物素化或配体结合进行内化程度的生化测定、通过流式细胞术或固定细胞检测内化蛋白的含量，以及通过电子显微镜定位蛋白位置等，均只能在固定时间点监测蛋白定位的整体变化。这些现有方法在鉴定参与 CME 所必需的蛋白方面非常有用，但缺乏与 CME 或其他动态膜运输过程生理尺度相匹配的空间和时间分辨率。这一点至关重要，因为最近的研究证据表明，CCP 在蛋白组成和动力学方面具有异质性9-12，且 CME 很可能以空间上离散的方式被快速调控。活细胞 TIRFM 技术使得能够在活细胞中实时分析空间上分离的单个 CCP 水平的 CME 过程。
成功应用这一强大检测方法依赖于两个关键因素：细胞的良好状态以及对网格蛋白介导的内吞作用（CME）参数的充分分析。对于前者，正确表达带标签蛋白并采用尽量减少光毒性的显微镜技术至关.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 C. Szalinski 博士、H. Teng 博士和 M. Bruchez 博士在 Imaris 软件使用方面的帮助，感谢 R. Vistein 和 D. Shiwarski 提供的技术支持与建议，并感谢 M von Zastrow 博士、T Kirchhausen 博士、D Drubin 博士和 W Almers 博士提供试剂以及富有启发性的讨论。本研究由资助项目 T32 NS007433（授予 SLB）以及 NIH DA024698 和 DA036086（授予 MAP）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM高糖培养基 | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙、无镁 | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA游离酸 | Amresco | 0322-500G | |
| 胎牛血清 | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz L-15培养基，无酚红 | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | 转染试剂 |
| 25 mm 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning 细胞培养处理烧瓶，25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 细胞培养6孔板 | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| 单克隆 ANTI-FLAG M1 抗体 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-脑啡肽醋酸盐（DAMGO） | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 蛋白标记试剂盒 | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris 图像分析软件 | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris，用于自动分析 | |
| Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜及所需配件，包括滤光块和滤光片 | Nikon | ||
| 适用于Nikon Eclipse Ti的Nikon TIRF附件及所需适配器 | Nikon | 用于调节入射角 | |
| iXon+ EMCCD 相机及适配器 | Andor |
参考文献
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
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重印与许可
