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方法文章

膀胱平滑肌条收缩力作为评估下尿路药理学的方法

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DOI：

10.3791/51807

⸱

2014年8月18日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单而高效的方法， 体外 评估平滑肌在药物作用或神经刺激下收缩功能的方法。主要应用于药物筛选以及组织生理学和药理学研究 和病理学。

摘要

我们描述了一种 体外 测量膀胱平滑肌收缩力的方法及其在研究平滑肌生理学与药理学特性以及病理诱导变化中的应用。该方法为理解膀胱功能提供了关键信息，同时克服了在研究过程中遇到的主要方法学难题 体内 实验，例如影响制备物稳定性和存活率的手术和药物干预、人体组织的使用和/或昂贵化学品的使用。它还提供了一种研究膀胱各个组分特性的方法即 平滑肌、黏膜、神经在健康与病理状态下的表现。

将麻醉动物的膀胱取出后置于克雷布斯（Krebs）溶液中，并切成条状。将组织条放入盛有温热克雷布斯溶液的浴槽中，一端连接等长张力传感器以测量收缩力，另一端固定于固定杆上。可通过直接向浴槽中添加化合物，或通过电场刺激电极激活神经来刺激组织，从而诱发膀胱收缩，模拟生理条件下的收缩反应 体内我们展示了该方法在评估发育过程中以及实验性脊髓损伤后自发性平滑肌收缩功能方面的应用，包括神经传递的性质（所涉及的神经递质和受体）、调节平滑肌活动的相关因素、膀胱各组成部分的作用，以及不同物种和器官对药理学试剂反应的差异。此外，该方法还可用于研究平滑肌收缩和/或舒张过程中涉及的细胞内信号通路、药物结构-活性关系以及神经递质释放的评估。

的 体外 平滑肌收缩性测定方法已广泛应用50余年，其提供的数据极大地增进了我们对膀胱功能的理解，并推动了目前临床用于膀胱管理的药物化合物的开发。

引言

膀胱平滑肌通过舒张实现尿液储存，并通过收缩引发排尿。舒张过程由平滑肌的内在特性以及交感神经持续释放去甲肾上腺素（NE）介导，后者激活逼尿肌中的β肾上腺素能受体（人类为β3AR）。排尿则通过抑制交感神经输入并激活副交感神经实现，副交感神经释放乙酰胆碱（ACh）和三磷酸腺苷（ATP）以引起膀胱平滑肌收缩1。多种病理状态，包括脑和/或脊髓损伤、神经退行性疾病、糖尿病、膀胱出口梗阻或间质性膀胱炎，均可显著改变膀胱功能，对患者的生活质量造成严重影响2。这些疾病通过影响膀胱的一个或多个组成部分——平滑肌、传入或传出神经和/或黏膜——来改变平滑肌的收缩能力。

多个 体内 和 体外 研究膀胱功能的方法已经得到开发。 体内，膀胱测压是评估膀胱功能的主要方法。尽管这是一种完整的制备方法，可在接近生理条件下收集信息，但在某些情况下更倾向于使用平滑肌条。这些情况包括外科和/或药物干预可能影响整体组织存活率和稳定性的场合 体内 制备，或当研究需要使用人体组织或昂贵化学品时尤为适用。该方法还有助于考察药物、年龄和病理因素对膀胱各组成部分的影响， 即 平滑肌、黏膜、传入神经和传出神经

多年来，许多研究团队采用膀胱条组织来回答一系列科学问题。这些组织曾被用于评估病理状态所诱导的肌源性自发活动的变化。这种肌源性活动被认为与膀胱过度活动症（OAB）的尿急和尿频症状相关，因此成为治疗OAB药物研发的重要靶点3-9。膀胱条也被用于研究调节平滑肌张力的肌源性和神经源性因素，旨在发现可作为靶点的离子通道、受体或细胞内信号通路，以诱导平滑肌的舒张或收缩3,10-13。其他研究则聚焦于神经传递的本质，包括参与其中的神经递质与受体，以及病理状态所引起的改变14,15。此外，该方法还被用于不同物种间组织的比较16-18、不同器官间的比较19-21，以及药物结构-活性关系的评估22-24。该方法的延伸应用还可用于测定药物对传出神经末梢递质释放的影响25。进一步地，多种组织（如膀胱、尿道、胃肠道等）均可通过该技术进行研究，这些组织可来源于动物或人类（来自手术标本或经批准用于研究的器官捐献组织），并可用于多种动物模型，包括脊髓损伤（SCI）、膀胱出口梗阻（BOO）或间质性膀胱炎（IC）等。

本文中，我们将结合必要的实验方案，阐述该方法的使用，以解决上述提到的若干科学问题。

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方案

本文所述所有操作程序均已获得匹兹堡大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 溶液

  1. 根据配方配制 Krebs 溶液。成分（单位：mM）：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl2 1.9，MgSO4 1.2，NaHCO3 24.9，KH2PO4 1.2，葡萄糖 11.7。
  2. 用 95% O2 和 5% CO2 饱和 Krebs 溶液，并将其置于 37 ºC 水浴中，供整个实验过程中使用。另取约 200 ml 已饱和的 Krebs 溶液置于室温下，用于组织解剖。
  3. 测定饱和 Krebs 溶液的 pH 值（约 7.4）和渗透压（约 300 mOsm）。

2. 实验装置（示意图1A）

  1. 用10 ml Krebs溶液填充通气（95% O2，5% CO2）的腔室。
  2. 启动循环水泵，将腔室加热至37 °C；打开必要的设备：放大器、刺激器和记录软件。
  3. 使用1 g砝码校准换能器。

3. 组织（图1B）

按照以下步骤，从一只成年未处理的雌性Sprague Dawley大鼠（200-250 g；约10-12周龄）中取出膀胱：

  1. 准备解剖区域及所需器械：电动剃须刀、有齿镊、手术刀片、解剖剪、显微剪、两把解剖镊（作者偏好Dumont #3型解剖镊）、组织夹（或丝线缝合线）、底部涂有Sylgard的解剖皿，内盛Krebs液，并配备组织固定针。
  2. 使用异氟烷吸入麻醉（4%浓度）对动物进行麻醉2将动物置于诱导室中。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，以防角膜干燥。通过观察呼吸频率、对外界刺激的反应以及后肢回缩反射的消失情况，持续监测麻醉深度。
  3. 当动物麻醉后，剃除下腹部区域的毛发。通过腹部正中切口暴露盆腔器官。辨认膀胱和尿道。在靠近近端尿道的膀胱颈处切断，摘除膀胱。立即将组织置于盛有充氧 Krebs 溶液的 Sylgard 包被培养皿中。
  4. 如有需要，此时可去除多余的组织：尿道、胃肠道（GI） tract 的碎片和/或前列腺， 等等。
  5. 使用经 IACUC 批准的方法处死动物（例如麻醉过量或一氧化碳2 窒息后辅以第二种方法
  6. 用组织解剖针穿过膀胱顶部、膀胱颈和输尿管以固定组织，便于进一步解剖。切勿牵拉组织。去除脂肪、结缔组织、近端尿道（如存在）及输尿管。
  7. 从膀胱基底至顶部切开，使其展开成一平整的片状，浆膜面朝下，腔面朝上（图1B）。将解剖针固定在组织的每个角上。去除膀胱顶部和膀胱颈组织。
  8. 如果实验的目的是确定黏膜（尿路上皮和固有层——见示意图）的贡献 图1C) 与平滑肌收缩的关系，比较带有和不带有黏膜的逼尿肌条的特性。为此，在将组织切成条状之前，需在解剖显微镜下使用虹膜弹簧剪和精细镊子小心地去除黏膜层。实验结束后，固定肌条以供后续 H&E 染色以确认黏膜的完全去除。请注意，此操作在小鼠膀胱中比在大鼠膀胱中更容易进行。
  9. 从基部到穹顶将组织纵向切成约 2 x 8 mm 的条状图1B）。用组织夹或类似工具夹住每条带状物的两端。
    注意：一只大鼠的膀胱通常可切成4条，但条带数量可依据动物/膀胱大小增加或减少。
  10. 将条状组织转移至实验腔室。将每条组织的一端连接至可测量组织收缩力的力传感器，另一端固定于玻璃或金属杆上。
    注意：组织浴槽的容量各不相同（0.2 ml 至 20 ml 或更大）。用于啮齿类动物膀胱的典型浴槽容量为 5–20 ml，可提供足够的高度，使组织条完全浸没于溶液中。部分浴槽配有内置刺激电极，部分则无。应确保电极的所有连接均处于良好状态，否则电场刺激将不可靠。
  11. 对每条组织条施加特定大小的力，通过轻柔拉伸组织直至基础张力达到1 g（约10 mN）。初始时组织倾向于松弛，表现为基础张力下降。每隔约15分钟用预温并通气的克雷布斯液（Krebs）清洗组织一次，每次清洗后重新调整基础张力至1 g。让组织平衡约1–2小时，或直至基础张力稳定即 无进一步的组织松弛。
  12. 通过向浴液中直接加入KCl（80 mM）约5分钟，或直至反应达到平台期，以检测组织活性。在实验过程中或实验结束时，可重复给予高浓度KCl刺激，并用于对其他药物的反应或不同组织条间反应的归一化处理（参见数据分析部分中的归一化说明）。
  13. 用预热的含氧 Krebs 溶液多次（3–5 次）洗涤组织，以使组织恢复至处理前状态。

4. 刺激方案

  1. 为研究病理对自发性肌源性活动或平滑肌张力的影响，可采用来自不同动物模型（如脊髓损伤、膀胱出口梗阻或新生动物）的平滑肌条。 图2 阐述了该方法在研究发育过程中及脊髓损伤（SCI）后膀胱自发活动变化中的应用。此外，可使用药理学试剂调节自发活动。 图3 说明 KCNQ 通道调节剂氟吡汀和 XE991 对自发性活动和平滑肌张力的影响。
  2. 通过在确定的时间间隔内将化合物从浓缩的储备液直接加入浴槽中，构建药理学平滑肌刺激的浓度-反应曲线。使用平行的组织条带同时测试药物和溶剂，以排除溶剂和时间效应的影响。
    1. 将所需测试化合物配制成比最终工作浓度高1000倍的储备液。对于毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱（CCh），配制如下储备液：10-5 M，3 × 10-5 M, 10-4 M，3 × 10-4 M, 10-3 M，3 × 10-3 M, 10-2 M. 浴液中的最终浓度为 10-8 M 到 10-5 M (图 4C、D）。对于神经调节素B（neuromedin B，NMB），即一种铃蟾肽受体亚型1激动剂，配制以下储备液：10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M，最终浴液浓度为10-11 M 到 10-6 M. 预期卡巴胆碱（CCh）和神经调节素B（NMB）均可增强组织收缩力。
    2. 对于10 ml组织浴槽，当反应达到平台期时，立即加入每种CCh储备溶液10 µl图4C，D）。在平行的组织条中加入等量的溶剂（水）。同样，每隔约 5 分钟加入 10 µl 的每种神经调节素 B 储备溶液。
      注意：观察NMB和CCh对不同物种来源的平滑肌条张力的兴奋作用 图4.
    3. 使用兴奋性试剂（通常为CCh或KCl）研究预收缩组织中平滑肌的舒张特性。
    4. 为阻断激动剂反应，需在激动剂刺激前，预先用拮抗剂孵育组织10-20分钟，以确保拮抗剂充分渗透组织。
  3. 对于平滑肌的神经刺激（也称为电场刺激，EFS），请按照步骤1至3.13操作，并按以下说明继续进行。EFS旨在选择性地激活神经而非平滑肌。应谨慎选择刺激参数，以避免直接刺激平滑肌。
    1. 设定刺激参数：刺激类型（单次脉冲或脉冲串）、持续时间（脉冲持续时间和脉冲串持续时间）、频率和强度，具体步骤如下所述，并如图所示。 图5A、B.
      1. 对于单脉冲刺激，设置脉冲持续时间、刺激间隔和所需的刺激次数。通常的刺激持续时间参数为持续0.05–0.3毫秒的单脉冲，按所需的时间间隔给予（图 5A）。按照4.3.1.4步骤设置刺激强度。
      2. 对于串刺激，设置串刺激持续时间及串间间隔。膀胱组织的典型参数为每次刺激持续3-10秒，间隔至少1分钟。图5B）。如果发生组织疲劳（即 在对照期，EFS 引起的收缩减弱，增加列间间隔。
      3. 确定刺激串的频率（串内脉冲次数） — 图 5B）。运行频率范围为0.5–50 Hz的频率反应曲线。膀胱的典型频率为10–20 Hz，可产生由ATP和ACh介导的可重复且稳定的收缩。观察小鼠膀胱条在EFS刺激下的频率依赖性反应 图5 展示如何利用该方法评估胆碱能和嘌呤能机制在神经传递中的作用。
      4. 确定刺激强度：系统性地增加刺激强度（电压），直至收缩幅度达到平台期（若使用刺激串，则保持频率恒定）。
      5. 根据实验目的设定刺激强度。若目的是增强神经诱发的收缩，则使用亚最大强度，使收缩幅度约为最大收缩幅度的50%。若目的是减弱神经诱发的收缩，则将刺激强度设定为最大收缩幅度的约80%，以避免组织疲劳。
    2. 确定刺激参数（持续时间、频率和强度）后，在进行药物测试前，需等待约20–30分钟，使电场刺激（EFS）诱导的收缩反应趋于稳定。
      注意：为了验证电场刺激（EFS）对神经传导的选择性，使用钠通道阻断剂阻断神经传导+ 通道阻滞剂河豚毒素（TTX；0.5–1 µM）。在实验开始时执行此步骤，因为TTX相对容易被洗脱。此外，在实验结束时也需执行此步骤（见下文步骤4.3.5）。
    3. 配制以下试剂的储备液，浓度为最终工作浓度的1,000倍：α,β-亚甲基ATP（ABMA；嘌呤能受体激活剂和脱敏剂）10-2 M，阿托品（毒蕈碱受体拮抗剂）10-3 M图5C）。观察其他示例于 图6. 5HT4受体激动剂，西沙必利（3 × 10⁻⁶ M）-6 M, 10-6 M，3 × 10-5 M, 10-5 M，3 × 10-4 M, 10-4 M，3 × 10-3 M, 10-3 M) 增加组织收缩力，以及 SB-203186（3 × 10⁻⁶）-3 M）是一种5HT4受体拮抗剂，可逆转西沙必利的作用。
    4. 为了检测ABMA和阿托品对EFS的影响（图5C），进行两条对照频率响应曲线的测定。加入10 µl的10-2 向浴液中加入 M ABMA，终浓度为 10 µM。由于直接刺激平滑肌中的嘌呤能受体，组织将发生收缩。待反应恢复至基线后，重复频率-反应曲线测定。加入 10 µl 的 10-3 加入阿托品，使其终浓度为 1 µM。孵育约 10 分钟（确保阿托品充分阻断毒蕈碱受体）后，重复测定频率-反应曲线。在平行的组织条中，每一步加入 10 µl 溶剂（水）作为对照。
      注意：有关其他示例，请参见 图6，以预定时间间隔（约每15分钟）向浴槽中分别加入10 µl各浓度的西沙必利储备液，随后直接加入10 µl SB-203186储备液，观察其对电场刺激诱导收缩的影响。在平行的组织条中加入10 µl溶剂DMSO。观察5-HT4受体激动剂西沙必利对人膀胱和回肠组织电场刺激诱发收缩的作用 图6此外，观察作为西沙必利溶剂的二甲基亚砜（DMSO）对人膀胱和回肠组织中电场刺激诱发收缩的影响。
    5. 在EFS方案结束时，通过使用Na通道阻断剂阻断神经传导来验证EFS的选择性+ 通道阻滞剂河豚毒素（TTX；0.5–1 µM）。如果仍存在TTX耐受性收缩，建议在后续实验中调整刺激的持续时间和强度。
  4. 用于确定药物对突触前或突触后位点的作用图7A) 按照步骤 1 至 4.3.2 操作，建立对卡巴胆碱和电场刺激（EFS）的可重复反应，然后加入药物 X。
  5. 实验结束后，取下或解开条状组织，用滤纸轻轻吸干以去除多余液体，然后用天平测量每条组织的重量。同时使用卡尺测量组织长度，以确定横截面积。这些数据用于后续的数据标准化处理（参见第5.4节）。

5. 数据分析

使用合适的软件分析数据（例如，Windaq、LabChart）。

  1. 对于自发性活动，选择药物诱导反应峰值前至少30秒的时段，并测量肌源性活动的幅度和频率（图3）。
    1. 采用快速傅里叶变换分析，确定参与收缩反应的频率谱，并判断膀胱不同部位（例如，顶部与颈部）、发育阶段、病理状态或药物处理之间是否存在差异8。
  2. 对于对平滑肌张力的影响，选择药物诱导反应峰值前至少10–30秒的时段，并测量收缩幅度。
  3. 对于对神经诱发性收缩的影响，测量给药前及药物诱导反应峰值时至少3次收缩的幅度、持续时间和曲线下面积。
    注意：必须同时测量电场刺激（EFS）诱导收缩的幅度和曲线下面积，因为嘌呤能和胆碱能成分具有不同的动力学特征。嘌呤能成分快速且短暂（ATP激活如P2X1等嘌呤能离子通道，引起钙离子快速内流，随后通道失敏），因此对峰值幅度贡献较大，而对曲线下面积贡献较小。胆碱能成分则较慢且持续（乙酰胆碱激活代谢型毒蕈碱受体，需较长时间启动细胞内信号通路，最终激活离子通道使平滑肌去极化并引发收缩）。因此，通过测量曲线下面积能更准确地反映毒蕈碱成分的作用。
  4. 对数据进行标准化处理，以便在不同组织条和药理学处理之间进行比较。所选的标准化参数不应受待测化合物、所研究的病理状态或实验设计的影响。可选用的参数包括组织条重量、横截面积、KCl反应（图4B）、最大反应的百分比（图7B）、另一种收缩剂（例如，氯化乙酰胆碱，CCh）或舒张剂（例如，罂粟碱）所诱导最大反应的百分比。

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结果

自发性肌源性活动

自发性肌源性活动是平滑肌的一个重要特征，会随着出生后发育6-9和病理状态（例如，脊髓损伤（SCI）、膀胱出口梗阻（BOO））3-5而发生变化。由于这种活动被认为与膀胱过度活动症（OAB）的症状相关2，因此研究调控该活动的受体、细胞内信号通路及药理学因素，对于开发治疗OAB及其他平滑肌功能障碍的有效疗法具有重要意义。本文所介绍的方法可便捷地探讨上述问题。图2展示了新生期（i）、幼年期（ii）、成年期（iii）以及脊髓损伤大鼠（SCI；iv）在发育过程中肌源性自发性活动的不同模式。来自新生大鼠的肌条表现出大振幅、低频率的节律性收缩（图2Ai），而成年大鼠的肌条则表现为小振幅、高频率的活动（图2Aii, iii）。脊髓损伤后，新生期的活动模式重新出现（图2Aiv）。除了使用动物模型的肌条外，还可利用多种药理学试剂诱导未经...

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讨论

本文中，我们描述了一种简单的方法 体外 一种可用于研究膀胱生理学与病理学中多个重要科学问题的平滑肌收缩力检测方法，同时有助于发现治疗膀胱功能障碍的新药物。我们已通过该方法展示了其在评估膀胱平滑肌收缩力的发育特性、病理变化及药理学特性方面的应用图2-4），神经传递调节（图5-7A），物种差异（图4），器官差异（图6）以及特定膀胱组分的相关性（例如黏膜 图7B）。此处未展示的其他应用包括使用药理学试剂评估细胞内信号通路3,10,11，不同药物的构效关系22-24或神经刺激后递质释放的评估/定量25.

尽管膀胱功能最终可能被评估 体内，这一点 体外 该方法克服了诸多棘手的情况 体内这些情况包括外科手术和药物干预会降低器官或动物的存活率或生存能力时、使用人体组织时，以及...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）授予 LB 的 R37 DK54824 和 R01 DK57284 基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
设备
带储液罐的组织浴系统Radnoti, LLC159920离体组织浴
温水循环泵Kent Scientific Corporation TPZ-749将组织浴槽保持在 37 °C
计算机
数据采集系统DataQ InstrumentsDI-710-UH用于观察、记录和分析数据
跨桥换能器放大器World Precision InstrumentsSYS-TBM4M换能器放大器
Grass 刺激器Grass TechnologiesModel S88刺激器
麻醉系统Kent Scientific Corporation ACV-1205S麻醉动物
麻醉箱哈佛仪器500116麻醉动物
麻醉面罩Kent Scientific Corporation AC-09508麻醉动物
材料与手术器械
Sylgard道康宁公司184 SIL ELAST KIT固定，解剖， &并切割组织
培养皿康宁3160-152解剖/切割组织
昆虫针ENTOMORAVIA Austerlitz 昆虫针5号固定组织
实验台垫VWR International56617-014吸水实验台垫
大鼠手术器械包Kent Scientific Corporation INSRATKIT组织的取出与解剖
2 把 Dumont #3 镊子Kent Scientific Corporation INS500064组织的取出与解剖
组织镊Kent Scientific Corporation INS500092去除并解剖组织
手术刀Kent Scientific Corporation INS500236组织的取出与解剖
手术刀刀片Kent Scientific Corporation INS500239组织的取出与解剖
专业修剪器 Braintree Scientific, Inc.CLP-223 45去除毛发
缝合线精细科学工具18020-50结扎组织
组织夹Radnoti, LLC158802将组织固定于杆/换能器上
1 g 砝码 Mettler Toledo11119525用于换能器校准
化学品
Krebs 溶液：
氯化钠
氯化钾
磷酸二氢钾
硫酸镁
葡萄糖
碳酸氢钠<膀胱平滑肌收缩力的体外测定方法及其在生理学、药理学及病理学研究中的应用> 氯化钙
氯化镁		 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
贝克		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		配制 Krebs 溶液
异氟烷Henry Schein029405麻醉动物
 氧气罐Matheson Tri Gasox251用于麻醉系统
Carbogen气罐（95%氧气；5%二氧化碳） Matheson Tri GasMoxn00hn36D为 Krebs 溶液通气

参考文献

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膀胱平滑肌条收缩力作为评估下尿路药理学的方法
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