一种用于解析记忆形成神经环路的新生大鼠偏侧化嗅觉学习模型

摘要

本方案介绍了利用急性单侧鼻孔闭塞在大鼠中建立偏侧化早期气味偏好学习的方法。偏侧化学习允许在同一批动物体内考察行为学结果及其潜在的生物学机制，从而减少个体间实验设计所引起的变异。该方案可用于研究早期气味学习背后的分子机制。

摘要

出生后关键期（≤ 10 天）的大鼠幼崽容易对与模拟母体照料刺激相关联的气味形成偏好。这种偏好记忆可持续数小时、数天，甚至终生，具体持续时间取决于训练参数。早期气味偏好学习为我们提供了一个模型，其中自然学习形式的关键变化发生在嗅觉神经回路中。该模型另一个使其成为分析记忆过程强大工具的特征是，在关键期内可通过单侧鼻孔堵塞实现嗅觉学习的偏侧化。via 单鼻孔堵塞实现。这是因为在这一早期阶段，两侧嗅脑之间尚未发育成熟的前连合连接。本文概述了使用鼻塞进行偏侧化气味学习的行为实验方案。急性、可逆性的鼻孔堵塞可最大程度减少与长期堵塞或更侵入性方法（如烧灼）相关的组织和神经元损伤。偏侧化气味学习模型允许在同一只动物体内进行比较，因此与动物间设计相比显著降低了实验变异。该方法已成功用于探究训练引起的嗅觉系统神经回路变化。未来的研究方向包括利用该偏侧化学习模型探索气味记忆的分子机制，以及将生理变化与记忆强度和持续时间相关联。

引言

嗅觉是啮齿类动物的主要感觉方式，若缺乏嗅觉，它们将无法在环境中成功地导航或生存。对于新生幼崽而言，嗅觉尤为重要，因为在出生后的第一周内，它们既看不见也听不到，必须依靠嗅觉来寻找母体以获得食物¹。因此，可以通过简单的实验操作对新生大鼠幼崽进行条件化训练，使其对特定气味产生偏好。已有多种刺激被用作非条件刺激（UCS），以在新生个体中诱导对新异气味（条件刺激，CS）的条件化反应，包括巢穴环境^2,3、吸吮乳汁^4-6、抚摸或触觉刺激^7-12、尾部夹捏¹³、母体唾液¹³、轻度足部电击^14-18以及颅内脑刺激¹⁹。本研究采用一种已建立的早期气味偏好范式，即将一种气味（此处为薄荷）与触觉刺激结合，以在24小时 后产生对薄荷气味的偏好^10,11,20。这些气味记忆依赖于完整的嗅觉环路，主要包括嗅球（OB）^21-23和前梨状皮层（aPC）^24,25。

对早期气味偏好学习的实验研究加深并拓展了我们对哺乳动物记忆分子与生理机制的理解。该哺乳动物模型在研究记忆机制方面具有多项优势。首先，已确定非条件刺激信号的神经来源。上述各种刺激均可激活蓝斑去甲肾上腺素的释放²⁶，进而激活嗅球（OB）和前梨状皮层（aPC）中的多种肾上腺素能受体，引....

方案

使用雄性和雌性Sprague Dawley大鼠（Charles River）幼崽。于出生后第1天（PD0为出生日）将每窝幼崽数量调整至12只。母鼠维持在12小时光照/12小时黑暗循环条件下 随意摄取 可自由获取食物和水。实验程序已获纽芬兰纪念大学机构动物护理委员会批准。

1. 鼻塞构建

注意：本实验步骤改编自 Cummings et al. (1997)³⁵。

1. 获取聚乙烯-20导管和3-0丝线缝合线。
2. 将一段聚乙烯-20导管剪成约0.8 mm的小段。
3. 将丝线缝合线穿过已准备好的导管，使导管两端均留有缝合线。
4. 在导管外一端的缝合线上打一个结。
5. 将导管段沿缝合线拉下，覆盖住线结。线结应卡在导管内部。
6. 修剪缝合线的两端，使其中一端的导管外露出约2 mm的线头（见图1A）。

2. 训练前鼻腔封闭

1. 将幼鼠从母鼠身边取出，放入一个装有常规垫料的容器中，并确保其安全。
2. 使用棉签蘸取局部麻醉凝胶（2% 利多卡因），涂抹于需要堵塞的鼻孔处。
3. 让幼鼠在容器中静置约 3 分钟。
4. ....

结果

本文回顾了部分先前已建立的研究结果²⁴，以证明鼻孔闭塞法在将嗅觉输入和学习限制于单侧大脑半球方面的有效性，以及该方法的可逆性。

在早期气味偏好训练期间进行单侧鼻孔封闭会导致侧化的气味记忆²⁴。该记忆局限于未封闭的鼻孔（图3）。当幼鼠在测试时使用与训练期间相同的鼻孔封闭方式时，它们对条件化气味（例如，薄荷）表现出偏好；而当测试时使用对侧鼻孔封闭时，它们则不再表现出对该条件化气味的偏好。这些结果共同表明，气味偏好记忆仅通过经历气味+抚触联合训练的未封闭鼻孔形成并表达。

讨论

在关键时间窗口内，Hall 及其同事首次建立了大鼠幼崽偏侧化嗅觉学习与记忆模型。在一系列研究中^33,34,36，他们发现，在出生后第6天（PD 6）对大鼠幼崽的一侧鼻孔进行气味与牛奶配对，可诱导产生偏侧化的气味偏好记忆。当训练和测试期间保持同一侧鼻孔开放时，偏好记忆表现显著；而当封闭的鼻孔被打开并用于测试时，则未观察到该记忆。然而，在出生后第12天（PD 12），当前连合通路从前嗅皮层开始发挥功能时³²，未经训练的鼻孔单独即可支持在 PD 6 获得的气味偏好的表达。若损毁前连合，则恢复了记忆的偏侧化特性，使其无法再通过未经训练的鼻孔表达³³。该偏侧化学习模型已被成功复制于气味与抚触结合的范式中^24,25,31。在 PD 6 期间采用单侧鼻孔封闭并结合气味与抚触训练，可在 PD 7 观察到偏侧化记忆³¹。在 PD 3 至 PD 6 期间重复进行单侧鼻孔封闭，可产生持续至少48小时的更长久的偏侧化记忆²⁴。

偏侧化嗅觉学习方案可在单个动物体内产生“裂脑”模.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯 20 管	Intramedic	427406	非放射显影性，无毒
3-0 丝线缝合线	Syneture	Sofsilk	不可吸收
硅脂	Warner Instrument	64-0378	无味
2% 利多卡因凝胶	AstraZeneca	产品编号 061	盐酸利多卡因凝胶，可在当地药店购买
画笔	Dynasty	206R	类似尺寸或其他品牌亦可使用
薄荷提取物	Sigma-Aldrich	W284807	其他品牌也可使用
训练箱	定制	N/A	丙烯酸箱（20 × 20 × 5 cm3），见 图 2A。箱子的参数和材料并非关键，可进行修改。所用材料应无味且不吸附气味
测试室	定制	N/A	不锈钢材质（30 × 20 × 18 cm3），见 图 2B。测试室的参数和材料并非关键，可进行修改。例如，可用丙烯酸材质的测试室替代不锈钢材质
pCREB 抗体	Cell Signaling	9198	Ser 133 (87G3) 兔单克隆抗体
水合氯醛	Sigma-Aldrich	C8383	N/A
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	N/A
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378	N/A