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方法文章

离体 完整犁鼻器及副嗅球的制备

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DOI：

10.3791/51813

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2014年8月4日

 ,  , 
1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University in St. Louis

本文内容

摘要

小鼠副嗅球（AOB）在感觉编码研究中一直难以进行深入探索。本文展示了一种解剖方法，可制备出一种离体（ex vivo）标本，其中AOB神经元仍与其外周输入保持功能性连接，从而有助于开展小鼠信息素和互利素的信息处理机制研究。

摘要

小鼠副嗅觉系统（AOS）是一种专门用于检测非挥发性社会性气味、信息素和利他素的感觉通路。AOS通路中的第一个神经回路称为副嗅球（AOB），在建立性别典型行为（如领地攻击性和交配行为）方面发挥着重要作用。这个微小的（<1 mm3）回路能够通过同种个体分泌物和排泄物中的化学感觉线索，区分独特的生理状态，例如性别、品系和应激状态。尽管该系统结构紧凑，为同时记录回路中大部分区域的活动提供了独特的机会，但对AOB中感觉信息处理的研究仍然具有挑战性，主要原因是其在脑内的实验操作位置极为不利。本文中，我们展示了一种多阶段解剖方法，可从鼠类前颅单侧半球中完整取出副嗅球，同时保留其与外周犁鼻器感觉神经元（VSNs）以及局部神经回路的连接。该操作使AOB表面得以直接暴露并可视，便于在无麻醉条件下对AOB回路元件进行电生理和光学记录。通过将一根细导管插入含有VSNs的犁鼻器（VNO），可在记录AOB下游神经活动的同时，直接向周围组织施加社会性气味和信息素。该方法可实现对AOS信息处理机制的可控性研究，有助于揭示信息素暴露与行为变化之间的关联机制。

引言

哺乳动物大脑中的感觉信息处理通常涉及多个相互连接的神经环路，每个环路从感觉输入中提取特定的特征。在感觉通路中，早期的信息处理对正常的感知和行为至关重要。在副嗅觉系统（AOS）中，副嗅球（AOB）是连接感觉外周与下游结构的主要神经环路，这些下游结构决定激素平衡1,2、攻击性3和觉醒状态4。因此，该环路内的信息处理与动物行为的变化密切相关。

副嗅球位于小鼠和大鼠主嗅球（MOB）的背侧/尾侧/后侧，处于血管丰富的鼻窦下方。副嗅球接收来自犁鼻感觉神经元（VSNs）轴突的传入神经支配，这些神经元位于犁鼻器（VNO）内，VNO 是位于软腭上方吻部前端的一个细小盲端管状结构。这些轴突穿过鼻腔内侧边界处纤薄的隔膜组织。已有多个研究探讨了副嗅球神经元对辅助嗅觉系统（AOS）气味源（如小鼠尿液）的神经反应。 副嗅球，犁鼻感觉神经元，犁鼻器，主嗅球，鼻窦，软腭，轴突，隔膜组织，辅助嗅觉系统，神经反应，小鼠尿液 体内 使用麻醉小鼠5-7 或自由探索的动物8. 英勇的麻醉状态 体内 研究包括（a）气管切开术，以确保深度麻醉并防止液体刺激物被吸入5-7，（b）刺激颈交感神经节6 或犁鼻器的直接插管5,7 引入非挥发性气味，以及进行开颅手术（伴或不伴额叶切除），以允许电极进入附属嗅球（AOB）6清醒/行为学研究8-10 涉及微型驱动器的手术植入。总之，这些实验范式虽然强大，但操作极为困难，且通常需要使用麻醉。

有趣的是，已有几项研究尝试在体外（ex vivo）维持感觉结构及其下游神经回路的存活，并取得了一定成功11-15。由于犁鼻器（VNO）与前嗅核（AOB）之间的连接保持同侧分布，且中线隔膜组织可在单侧半脑中暴露于含氧灌流液，因此我们试图建立一种单侧半脑的ex vivo方法，以分离这些结构的同时维持其功能连接。我们最近已成功实现了这一目标16。该制备方法可使VNO和AOB均保持存活并具有功能连接，持续至少4至6小时，原因在于轴突（沿中线软隔膜组织）和AOB均为相对表浅的结构，深度通常小于<600 µm，能够被灌流的含氧人工脑脊液（aCSF）充分供氧。这种VNO-AOB ex vivo制备方法允许通过细导管向VNO内引入可控刺激，同时可直接观察体积较小的AOB，便于靶向电极放置和/或活体荧光显微成像。若希望在无麻醉剂干扰的条件下研究这些神经回路，该方法具有显著优势。但由于该方法切断了离心投射连接，因此不适用于探究离心通路对AOB功能的调节作用。VNO-AOB ex vivo制备技术学习难度较高，但一旦掌握，便可为研究这一强大感觉通路中的环路结构、信息处理机制及神经可塑性提供一个可靠的实验平台。

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方案

所有实验均按照美国西南医学中心机构动物照护与使用委员会批准的方案进行，并选择实验方法以尽量减少实验动物所经历的压力、不适和疼痛。

1. 解剖室

为获得最佳结果，需要使用定制的解剖室以及小而薄的塑料板（图1）。在实施本方案之前，应预先制作或获取此类解剖室。

2. 解剖溶液

  1. 配制1 L标准人工脑脊液（aCSF），用于步骤3.22–5.4。加入NaCl 125 mM、KCl 2.5 mM、CaCl₂ 2.5 mM、MgCl₂ 1.3 mM、NaHCO₃ 26 mM、NaH₂PO₄ 1.25 mM和葡萄糖10 mM。2 2 mM，MgCl2 1 mM，NaHCO₃3 25 mM，NaH2PO4 1.25 mM，肌醇 3 mM，丙酮酸钠 2 mM，抗坏血酸钠 0.4 mM，以及葡萄糖 25 mM 加入至 1 L 无热原水中。
  2. 准备初始解剖用 aCSF（200 ml），用于步骤 3.3–3.22。取 200 ml 标准 aCSF，并将 MgCl₂ 浓度提高至 7 mM。2 通过加入0.366 g MgCl将浓度提高9 mM2 六水合物
  3. 配制标准林格氏液，用于通过套管将刺激物输送至犁鼻器，在步骤4.11–5.4中使用，其成分为：NaCl 115 mM，KCl 5 mM，CaCl₂ 1 mM，葡萄糖 10 mM，HEPES 10 mM，pH 7.4。2, 2 mM，MgCl2，2 mM，NaHCO₃3 25 mM HEPES，10 mM 葡萄糖
  4. 将0.8 L的标准aCSF和0.5 L的任氏液（Ringer’s）用95% O₂2，5% CO₂2 在37 °C水浴中孵育至少15分钟，直至使用。
  5. 用95% O₂对200 ml初始解剖用aCSF进行通气2，5% CO₂2 在冰上放置气体15-20分钟，直至温度达到4 °C。

3. 原代解剖

  1. 准备解剖区域。将三个 35 mm 培养皿、充氧 aCSF、断头剪、弯头解剖剪、直头解剖剪、Adson 镊子、#11 手术刀片及刀柄和剃刀刀片置于冰上。
  2. 待充氧 aCSF 冷却至 4 °C 后，在干燥器中使用 2–5 ml Isothesia（99.9% 异氟烷）对动物进行深度麻醉。通过尾部和足部夹捏测试，确认动物已处于深度麻醉状态。
  3. 确认深度麻醉后，立即断头，并将头部迅速放入盛有冷 aCSF 的培养皿中。 注意：当组织未使用时，应将其浸没在冷 aCSF 中以保持低温。
  4. 使用弯头剪刀去除下部结构（腹侧咽部、下颌和舌）。
  5. 使用 Adson 镊子剥离（剥离）颅骨表面的皮肤和肌肉附着物。从尾侧向头侧方向剥离头皮，直至仅在门齿上方仍有附着点。使用弯头剪刀在附着点处剪断组织。用镊子夹住眼球并将其从标本上拉出以去除眼球。在去皮操作接近结束时，应避免对精细的鼻软骨施加过度力量，使用 Adson 镊子小心分离上颌骨上的肌肉附着物。 注意：使用直头剪刀从颅骨尾侧分离头皮。
  6. 使用直头剪刀从尾侧向头侧沿颅骨中线剪开，直至剪刀尖端进入额骨数毫米（紧邻鼻窦前方）。
  7. 使用 Adson 镊子去除顶骨和额骨。 注意：额骨碎片常会附着于鼻窦尾侧的鼻骨上。去除这些碎片时需小心，避免接触嗅球。
  8. 使用手术刀在鼻窦后方 2 mm 处对额叶进行冠状切口，然后移除切口后方的脑组织。确保手术刀尖接触腹侧颅骨的骨性轮廓，以完全切断后部组织。 注意：此步骤可避免对侧嗅束或嗅球施加机械应力，从而实现大部分脑组织的顺利移除。
  9. 使用直头剪刀去除暴露的腹侧颅骨尾侧部分。保留鼻窦及残留的神经组织。
  10. 使用直头剪刀去除颅骨解剖学右侧的颧弓和面部肌肉。
  11. 将吻部翻转（腹侧朝上），暴露口腔顶部。
  12. 在门齿后方立即切除并移除腭部。操作方法为将手术刀片尖端插入腭部下方，与口腔顶部平行，然后将刀片向门齿方向移动。
  13. 用 Adson 镊子夹住已松解的（头侧）腭缘，向尾侧方向拉出以移除。
  14. 在颅骨解剖学左侧，使用手术刀片从靠近磨牙的小孔开始，向尾侧延长腭大孔。操作时将手术刀片尖端插入磨牙附近的空腔，并旋转手腕。 注意：务必仅使用刀尖操作——过深切割可能损伤鼻中隔组织。
  15. 使用手术刀片尖端从腭大孔经门齿进行切割，起始于解剖学左侧犁鼻器头侧。采用多次划痕式切割。避免因刀片插入过深而损伤鼻中隔组织和犁鼻神经。
  16. 将组织翻转，使背侧颅骨朝上，然后将直剃刀片垂直（与中线平行）置于标本尾侧边缘。
  17. 在组织腹侧边缘，将剃刀刀刃紧贴中线左侧接触切割面。轻轻 rocking 刀片，并沿左侧腭大孔（第 3.14 步引入的切口区域）移动。
  18. 在组织背侧边缘，将剃刀刀刃紧贴中线左侧（小于 1 mm）放置。
  19. 保持刀片与中线平行，缓慢施加压力并 rocking 剃刀片向前方移动。当遇到筛板阻力时注意感知，一旦突破该阻力即刻停止。 注意：此时右半球已与左半球松解。两半球之间仅在筛板前方的吻部背侧仍有连接。
  20. 用戴手套的手指在尾侧附近夹住两半球，轻轻向外侧和前侧旋转以分离半球。 注意：此步骤可能引入实验变异性，尤其在鼻部偏曲或脆弱的小鼠（e.g.，老年小鼠）中。若在尝试将半球相互分离时遇到较大阻力，可在筛板前方的吻部背侧进行划痕切割以削弱结缔组织。操作时务必格外小心，避免手术刀插入过深，以免损伤鼻中隔组织和犁鼻神经。
  21. 取少量组织胶（50–100 µl），涂抹于载板上，用 Adson 镊子轻轻将右半球的外侧边缘置于胶上。用纸巾擦去标本外侧多余水分，防止胶水过早聚合或与载板粘附不牢。 注意：组织放置于胶上后，可在样本上滴加几滴冷 aCSF 以加速胶水聚合，确保组织牢固固定于载板上。
  22. 在次级解剖室中央放置少量真空脂（直径 3–5 mm，深 2 mm），将载板无组织一侧紧压于脂上。立即用冷 aCSF 填充解剖室，转移至精细解剖区域，并开始用充氧标准 aCSF 灌流。调整载板方向，使嗅球正对新鲜充氧的标准 aCSF 流向。

4. 次级解剖

  1. 使用精细镊子去除制备样本中可见的对侧（左侧）嗅球或皮层组织。将精细镊子轻轻捏合（形成一个半钝的尖端），然后将其置于组织背侧和尾侧靠近中线的区域。沿中线缓慢向前移动捏合的镊子，将组织从右侧半球逐渐剥离。彻底清除所有对侧组织，包括对侧嗅球组织。操作时需格外小心，避免刺穿组织，以防损伤附属嗅球（AOB）或犁鼻神经。
  2. 观察嗅球背侧/内侧表面的白色硬脑膜。用两对精细镊子夹住硬脑膜最白的部分，从嗅球背侧/尾侧边缘撕开并从此处向外牵拉。硬脑膜紧密包裹嗅球，在去除过程中容易切割周围组织。操作时应避免损伤嗅球内侧表面及附属嗅球（AOB）本身。 注意：如果此时硬脑膜不易撕裂，可使用精细弹簧尖解剖剪做一个小切口，以利于分离。
  3. 用精细镊子缓慢而小心地剥离额叶皮层，避免损伤下方的嗅球。在附属嗅球（AOB）后方立即可见一团呈半透明网状的血管丛。使用精细镊子将此血管网移除，以便在电生理实验中便于电极插入。当额叶皮层回缩使血管网与附属嗅球分离时，用镊子夹住该网，向后内方向轻轻牵拉去除，注意避免接触附属嗅球。待额叶皮层完全与嗅球分离后，于附属嗅球腹侧及后方用镊子剪断并移除额叶皮层。 注意：取出滤网时需格外小心，若操作过于粗暴，可能导致肾小球层受损。
  4. 在暴露的对侧鼻腔中，使用精细镊子去除残留的对侧鼻中隔组织（含血管的薄而呈淡黄色的膜状结构）。从尾侧/背侧区域（靠近鼻中隔骨）夹住该组织，然后向鼻腔前方向牵拉或提起。 注意：在半切步骤（步骤 3.20）中，可能会意外切除对侧鼻中隔组织。若出现此情况，应观察到白色的无血管中隔软骨以及略呈半透明的、有血管化的中隔骨。若如此，则可跳过步骤 4.4。
  5. 用精细镊子的尖端沿隔软骨与犁鼻器“翼”之间小心分离，以完整摘除对侧犁鼻器（犁鼻器“翼”为沿两侧犁鼻器背侧边缘走行的一片薄骨组织）。
    1. 在将翼部从软骨分离后，将镊子尖端向腹侧移动至对侧犁鼻器靠近中线的位置。沿对侧犁鼻器的头尾轴方向，在多个位置重复此操作以松解组织，随后用镊子夹住并提起，即可将其移除。
  6. 使用精细镊子在鼻中隔软骨腹侧/尾侧边缘（即软骨向鼻中隔骨腹侧边缘延伸并变窄形成的白色无血管条带处）进行剪切，准备取出鼻中隔软骨。
  7. 用精细镊子夹紧形成一个半钝性尖端，以移除鼻中隔软骨。辨认第4.6步所作的切口，将夹紧的镊子插入该切口后方（外侧），然后缓慢将软骨从中隔组织上抬起，并向吻侧方向分离。 注意：不要损伤下方的隔膜组织。抬起软骨时，应观察到下方隔膜组织因与软骨存在松散粘连而随之伸展。在此松散粘连部位，定期使用精细镊子轻轻并稳定地移动，可极大促进两种结构的成功分离。
  8. 使用一对弯头#3镊子去除筛骨。以接近与筛骨平面平行的角度接近筛骨。将弯曲的镊齿插入筛组织与筛骨之间。用镊子夹住骨块，并轻轻前后移动，直至其在筛板附近断裂。 注意：在某些情况下，筛板附近的鼻中隔骨可能难以折断。此时，可使用精细镊子在筛板前方沿背腹轴方向轻轻划痕鼻中隔骨，然后重复步骤 4.8。
  9. 用一对精细镊子夹住犁鼻器入口处前方的白色软骨，另一对精细镊子向吻侧牵拉，将其去除。
  10. 将聚酰亚胺导管连接至快速灌流装置，并通过聚酰亚胺导管以0.1–0.3 ml/min的流速开始灌流林格氏液。 注意：使用串联的小体积流量计测量流速。采用计算机控制的气动刺激切换装置可减少刺激期间的流速波动。将神经对测试刺激的反应与对模拟刺激（对照任氏液）的反应进行比较，以确保反应具有刺激特异性。
  11. 将套管与犁鼻器（VNO）入口平行放置。当套管与犁鼻器入口达到满意的平行状态时，观察到出口压力使犁鼻器“膨胀”，从而促使血管排空。立即插入套管进入犁鼻器，保持套管角度不变，使其始终与犁鼻器开口平行。 注意：可用一对精细镊子将套管固定在塑料板上，同时用另一对精细镊子将套管末端略微向上倾斜。若不慎将套管置于犁鼻器（VNO）后方，流出液也可能导致VNO血管排空，从而造成套管已正确插入的假象。可通过在任氏液中加入染料来确认套管位置是否正确。当套管位置正确时，染料应仅从VNO入口处流出。此外，还可通过观察套管是否能清晰地透过VNO半透明的内侧区域被看见，来确认其位置是否正确。
  12. 缓慢移动塑料板，直至AOB处于标准aCSF的直接灌流中，注意避免将套管从VNO中移位。解剖步骤至此完成，可立即开始生理功能的评估。步骤5简要描述了一种进行此类评估的方法。

5. 评估

  1. 使用连接至细胞外放大器和示波器的2-4 MΩ硼硅酸盐玻璃微电极穿透AOB表面。
  2. 以50 µm/min的速度将微电极缓慢推进至表面下100-200 µm的深度。 注意：在此组织深度，偶尔会记录到自发的动作电位波形，表现为微电极电压出现尖锐、短暂（约1-2毫秒）的偏转。
  3. 当遇到动作电位波形时，停止推进微电极。
  4. 在将刺激递送溶液从对照Ringer's液更换为已知的VSN活性激活剂时，观察和/或记录动作电位频率。例如，含50 mM KCl的林格氏液）。若解剖成功，可观察到刺激依赖性的动作电位频率或局部场电位的变化。 注意：并非所有AOB神经元都会对每种刺激产生放电频率升高的反应（包括含有50 mM KCl的任氏液）。刺激依赖性的放电频率降低同样表明存在功能性连接和成功的分离。如果遇到两个或更多对VNO刺激无反应的神经元，或在多次电极穿刺后仍未记录到动作电位，则提示分离不成功。若出现此情况，可从第3步重新开始新的分离操作。

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结果

成功完成该制备过程需要大量练习，并存在多个可能失败的步骤。在取得成功之前，应预期需要进行多次尝试。本方案的成功实施依赖于定制的解剖室，应在开始解剖后期阶段之前提前准备好该装置。文中所展示的解剖室设计 图1 足以满足此目的，可使用相对廉价的塑料制成，且对加工精度要求较低。若不具备自行制作该腔室的能力，可咨询本地或在线加工公司，由其有偿代为加工制作。

不同样本之间存在较大差异的一个主要来源是实验动物颅骨和吻部骨骼的密度与脆性。在半切步骤（步骤 3.14–3.20）中，目标是分离出双侧犁鼻器器官，同时保留同侧的鼻中隔组织和同侧副嗅球。然而，鼻中隔组织常常仍附着在对侧半脑，尤其是在与吻部背侧骨骼的连接部位附近。图 2 展示了有效与无效半切操作的示例。

在精细解剖过程中，常会出现其他常见的解剖错误，此时犁鼻神经的轴突可能在犁鼻器附近的鼻中隔组织（图3A 和 图3B）或在附属嗅球（AOB）附近（

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讨论

本方案中描述的VNO-AOB ex vivo 制备方法，是研究AOB功能的麻醉下in vivo5-7实验和急性活体脑片17实验的一种有效替代方案。与同样可暴露神经环路元件以进行电生理和光学记录的急性AOB脑片实验不同，该制备方法保留了全部的感觉传入纤维以及AOB内部的连接结构。尽管麻醉下的in vivo方法也能保持这些连接，但麻醉剂的使用必然改变神经元功能，特别是兴奋性/抑制性平衡，而这种平衡对于本环路及其他嗅觉环路中的信息处理至关重要18。由于该制备方法避免了麻醉剂的使用，且AOB表面完全暴露于灌流液中，因此适用于对局部神经处理机制进行药理学研究。

这种制备方法当然存在一些局限性。有证据表明，副嗅球最深层区域（即容纳大量抑制性颗粒细胞的内细胞层深部）会逐渐发生退变16。此外，在解剖过程中离心传入纤维被切断，从而使其无法参与副嗅球的正常功能活动。对犁鼻器进行插管操作会绕过犁鼻泵的正常作用，并冲走犁鼻器腔内原有的内源性液体。<...

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披露

作者无须披露重大利益冲突。

致谢

本研究由 R00 DC011780（JPM：NINDS，NIH）、F30 DC011673（GFH：NINDS，NIH）以及 UT Southwestern 启动资金（JPM）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
直剪刀Fine Science Tools14002-14
精细直剪刀Fine Science Tools14060-10
精细弯剪刀Fine Science Tools14061-10
艾德森镊子Fine Science Tools11006-12
#3 手术刀柄Fine Science Tools10003-12
#11 手术刀片Fisher Scientific3120030
直形碳钢剃刀刀片Fisher Scientific12-640
35 mm 培养皿Fisher Scientific08-772-21
解剖室定制 N/A参见 图 1
Delrin 塑料板 0.6 cm × 1.5 cm × 0.1 cm定制 N/A
Dow Corning 硅真空润滑脂Fisher Scientific146355D
#5 镊子，学生用Fine Science Tools91150-20
#5 镊子，生物学尖头Fine Science Tools11295-10
#5 镊子，学生用Fine Science Tools91150-20
Vannas 弹簧剪刀Fine Science Tools15000-08
1/16" 雄性鲁尔接头Cole-ParmerEW-45505-00
1/16" 管路Fisher Scientific14-171-129
双组分环氧树脂Grainger5E157
ValveBank 加压灌注套件AutoMate Scientific09-16
ValveLink 数字/手动控制器AutoMate Scientific01-18
NaClSigma-Aldrichvarious
KClSigma-Aldrichvarious
CaCl2 二水合物Sigma-Aldrichvarious
MgCl2 六水合物Sigma-Aldrichvarious
NaHCO3Sigma-Aldrichvarious
NaH2PO4Sigma-Aldrichvarious
myo-肌醇Sigma-Aldrichvarious
钠-丙酮酸盐Sigma-Aldrichvarious
钠-抗坏血酸盐Sigma-Aldrichvarious
HEPES 缓冲液Sigma-Aldrichvarious
葡萄糖Sigma-Aldrichvarious

参考文献

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