离体 完整犁鼻器及副嗅球的制备

摘要

小鼠副嗅球（AOB）在感觉编码研究中一直难以进行深入探索。本文展示了一种解剖方法，可制备出一种离体（ex vivo）标本，其中AOB神经元仍与其外周输入保持功能性连接，从而有助于开展小鼠信息素和互利素的信息处理机制研究。

摘要

小鼠副嗅觉系统（AOS）是一种专门用于检测非挥发性社会性气味、信息素和利他素的感觉通路。AOS通路中的第一个神经回路称为副嗅球（AOB），在建立性别典型行为（如领地攻击性和交配行为）方面发挥着重要作用。这个微小的（<1 mm³）回路能够通过同种个体分泌物和排泄物中的化学感觉线索，区分独特的生理状态，例如性别、品系和应激状态。尽管该系统结构紧凑，为同时记录回路中大部分区域的活动提供了独特的机会，但对AOB中感觉信息处理的研究仍然具有挑战性，主要原因是其在脑内的实验操作位置极为不利。本文中，我们展示了一种多阶段解剖方法，可从鼠类前颅单侧半球中完整取出副嗅球，同时保留其与外周犁鼻器感觉神经元（VSNs）以及局部神经回路的连接。该操作使AOB表面得以直接暴露并可视，便于在无麻醉条件下对AOB回路元件进行电生理和光学记录。通过将一根细导管插入含有VSNs的犁鼻器（VNO），可在记录AOB下游神经活动的同时，直接向周围组织施加社会性气味和信息素。该方法可实现对AOS信息处理机制的可控性研究，有助于揭示信息素暴露与行为变化之间的关联机制。

引言

哺乳动物大脑中的感觉信息处理通常涉及多个相互连接的神经环路，每个环路从感觉输入中提取特定的特征。在感觉通路中，早期的信息处理对正常的感知和行为至关重要。在副嗅觉系统（AOS）中，副嗅球（AOB）是连接感觉外周与下游结构的主要神经环路，这些下游结构决定激素平衡^1,2、攻击性³和觉醒状态⁴。因此，该环路内的信息处理与动物行为的变化密切相关。

副嗅球位于小鼠和大鼠主嗅球（MOB）的背侧/尾侧/后侧，处于血管丰富的鼻窦下方。副嗅球接收来自犁鼻感觉神经元（VSNs）轴突的传入神经支配，这些神经元位于犁鼻器（VNO）内，VNO 是位于软腭上方吻部前端的一个细小盲端管状结构。这些轴突穿过鼻腔内侧边界处纤薄的隔膜组织。已有多个研究探讨了副嗅球神经元对辅助嗅觉系统（AOS）气味源（如小鼠尿液）的神经反应。 副嗅球，犁鼻感觉神经元，犁鼻器，主嗅球，鼻窦，软腭，轴突，隔膜组织，辅助嗅觉系统，神经反应，小鼠尿液 体内 使用麻醉小鼠^5-7 或自由探索的动物⁸. 英勇的麻醉状态 体内 研究包括（a）气管切开术，以确保深度麻醉并防止液体刺激物被吸入^5-7，（b）刺激颈交感神经节⁶ 或犁鼻器的直接插管^5,7 引入非挥发性气味，以及进行开颅手术（伴或不伴额叶切除），以允许电极进入附属嗅球（AOB）<....

方案

所有实验均按照美国西南医学中心机构动物照护与使用委员会批准的方案进行，并选择实验方法以尽量减少实验动物所经历的压力、不适和疼痛。

1. 解剖室

为获得最佳结果，需要使用定制的解剖室以及小而薄的塑料板（图1）。在实施本方案之前，应预先制作或获取此类解剖室。

2. 解剖溶液

1. 配制1 L标准人工脑脊液（aCSF），用于步骤3.22–5.4。加入NaCl 125 mM、KCl 2.5 mM、CaCl₂ 2.5 mM、MgCl₂ 1.3 mM、NaHCO₃ 26 mM、NaH₂PO₄ 1.25 mM和葡萄糖10 mM。₂ 2 mM，MgCl₂ 1 mM，NaHCO₃₃ 25 mM，NaH₂PO₄ 1.25 mM，肌醇 3 mM，丙酮酸钠 2 mM，抗坏血酸钠 0.4 mM，以及葡萄糖 25 mM 加入至 1 L 无热原水中。
2. 准备初始解剖用 aCSF（200 ml），用于步骤 3.3–3.22。取 200 ml 标准 aCSF，并将 MgCl₂ 浓度提高至 7 mM。₂ 通过加入0.366 g MgCl将浓度提高9 mM₂ 六水合物

结果

成功完成该制备过程需要大量练习，并存在多个可能失败的步骤。在取得成功之前，应预期需要进行多次尝试。本方案的成功实施依赖于定制的解剖室，应在开始解剖后期阶段之前提前准备好该装置。文中所展示的解剖室设计 图1 足以满足此目的，可使用相对廉价的塑料制成，且对加工精度要求较低。若不具备自行制作该腔室的能力，可咨询本地或在线加工公司，由其有偿代为加工制作。

不同样本之间存在较大差异的一个主要来源是实验动物颅骨和吻部骨骼的密度与脆性。在半切步骤（步骤 3.14–3.20）中，目标是分离出双侧犁鼻器器官，同时保留同侧的鼻中隔组织和同侧副嗅球。然而，鼻中隔组织常常仍附着在对侧半脑，尤其是在与吻部背侧骨骼的连接部位附近。图 2 展示了有效与无效半切操作的示例。

在精细解剖过程中，常会出现其他常见的解剖错误，此时犁鼻神经的轴突可能在犁鼻器附近的鼻中隔组织（图3A 和 图3B）或在附属嗅球（AOB）附近（

讨论

本方案中描述的VNO-AOB ex vivo 制备方法，是研究AOB功能的麻醉下in vivo^5-7实验和急性活体脑片¹⁷实验的一种有效替代方案。与同样可暴露神经环路元件以进行电生理和光学记录的急性AOB脑片实验不同，该制备方法保留了全部的感觉传入纤维以及AOB内部的连接结构。尽管麻醉下的in vivo方法也能保持这些连接，但麻醉剂的使用必然改变神经元功能，特别是兴奋性/抑制性平衡，而这种平衡对于本环路及其他嗅觉环路中的信息处理至关重要¹⁸。由于该制备方法避免了麻醉剂的使用，且AOB表面完全暴露于灌流液中，因此适用于对局部神经处理机制进行药理学研究。

这种制备方法当然存在一些局限性。有证据表明，副嗅球最深层区域（即容纳大量抑制性颗粒细胞的内细胞层深部）会逐渐发生退变¹⁶。此外，在解剖过程中离心传入纤维被切断，从而使其无法参与副嗅球的正常功能活动。对犁鼻器进行插管操作会绕过犁鼻泵的正常作用，并冲走犁鼻器腔内原有的内源性液体。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直剪刀	Fine Science Tools	14002-14
精细直剪刀	Fine Science Tools	14060-10
精细弯剪刀	Fine Science Tools	14061-10
艾德森镊子	Fine Science Tools	11006-12
#3 手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12
#11 手术刀片	Fisher Scientific	3120030
直形碳钢剃刀刀片	Fisher Scientific	12-640
35 mm 培养皿	Fisher Scientific	08-772-21
解剖室	定制	N/A	参见 图 1
Delrin 塑料板 0.6 cm × 1.5 cm × 0.1 cm	定制	N/A
Dow Corning 硅真空润滑脂	Fisher Scientific	146355D
#5 镊子，学生用	Fine Science Tools	91150-20
#5 镊子，生物学尖头	Fine Science Tools	11295-10
#5 镊子，学生用	Fine Science Tools	91150-20
Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-08
1/16" 雄性鲁尔接头	Cole-Parmer	EW-45505-00
1/16" 管路	Fisher Scientific	14-171-129
双组分环氧树脂	Grainger	5E157
ValveBank 加压灌注套件	AutoMate Scientific	09-16
ValveLink 数字/手动控制器	AutoMate Scientific	01-18
NaCl	Sigma-Aldrich	various
KCl	Sigma-Aldrich	various
CaCl2 二水合物	Sigma-Aldrich	various
MgCl2 六水合物	Sigma-Aldrich	various
NaHCO3	Sigma-Aldrich	various
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	various
myo-肌醇	Sigma-Aldrich	various
钠-丙酮酸盐	Sigma-Aldrich	various
钠-抗坏血酸盐	Sigma-Aldrich	various
HEPES 缓冲液	Sigma-Aldrich	various
葡萄糖	Sigma-Aldrich	various