肾缺血再灌注损伤：一种小鼠损伤与再生模型

摘要

本文所述的肾脏缺血再灌注损伤小鼠模型包括右肾切除术以获取对照组织，以及夹闭左肾蒂以诱导缺血，从而导致急性肾损伤。该模型采用经腹正中切口，所有操作均通过单一手术切口完成。

摘要

肾缺血再灌注损伤（IRI）是临床上急性肾损伤（AKI）的常见病因，而在肾移植过程中，肾血流的暂时阻断不可避免。能够准确且可重复地模拟肾IRI的实验模型，对于解析AKI的病理生理机制以及开发新型治疗药物至关重要。本文介绍一种可诱导稳定且可重复AKI的小鼠肾IRI模型。该模型通过经腹正中切口入路进行手术，单一切口即可同时完成右肾切除（以获取对照组织）和左肾蒂夹闭，从而诱导左肾缺血。在缺血期间，通过精确控制夹闭位置和维持小鼠体温恒定，确保模型在功能和结构损伤方面具有良好的可重复性。于缺血再灌注24小时后处死小鼠 术后表现为肾功能丧失，血清或血浆肌酐水平升高，同时伴有急性肾小管坏死等肾脏结构损伤。在肾缺血-再灌注损伤（IRI）后的7天内，肾功能逐渐恢复，急性组织损伤也随之消退，因此该模型可用于研究肾脏再生。此肾IRI模型已被用于急性肾损伤（AKI）的分子与细胞病理生理学研究，以及后续肾脏再生过程的分析。

引言

缺血再灌注损伤（IRI）是包括肾脏、心脏和大脑在内的多个器官常见的损伤方式。肾IRI可导致患者发生急性肾损伤（AKI），目前尚无特异性治疗手段。由IRI引起的AKI具有复杂的发病机制，涉及先天性和适应性免疫应答¹。肾IRI的实验模型有助于解析参与AKI发病过程的关键细胞和介质，以及随后数天内发生的肾组织再生过程。此外，还可通过该模型评估新型治疗药物对疾病进程的影响。

本文所述肾缺血-再灌注损伤（IRI）实验模型的总体目标是诱导肾脏出现急性功能性和结构性损伤。一些研究者曾采用双侧IRI模型²。尽管双侧肾IRI模型具有应用价值，但单侧肾IRI模型的优势在于手术时可同时进行右肾切除术。右肾切除组织在涉及预处理步骤的研究中可作为宝贵的对照组织，用于评估某种基因或蛋白表达的诱导或抑制作用。例如，我们曾利用该模型评估血红素精氨酸酯（HA）在肾IRI发生前24小时注射的预处理效应³。在右肾切除对照组织中，已证实HA在IRI前成功诱导了细胞保护性酶血红素加氧酶-1（HO-1）的表达⁴。HA部分通过HO-1依赖机制减轻了老年小鼠的肾IRI。类似地，我们还利用该模型开展巨噬细胞耗竭研究，以探讨巨噬细胞在肾IRI中的作用⁵。对右肾切除组织进行免疫组织化学分析可用于验证耗竭方法的有效性。因此，右肾切除组织可用于在每只实验动物中同时确认并量化目标分子的诱导或抑制水平。该模型将对那些在诱导肾IRI前使用药物或其他化合物调控基因或蛋白表达等研究的研究人员具有重要意义。

其他研究曾采用侧腹切口来暴露肾脏。本文所述模型则通过单一的腹部正中切口，同时完成右肾切除术并诱导左肾缺血-再灌注损伤。这种手术入路可清晰显示手术视野，包括肾蒂结构以及肾蒂夹闭后出现的颜色变化。我们已发表的研究经验^4-6表明，小鼠术后恢复迅速，存活率接近100%。

最后，该模型在7天内的动力学分析表明，该模型表现出肾功能和肾小管完整性的恢复，并伴有显著的肾小管细胞增殖。

方案

注意：动物实验均遵循《1986年动物（科学实验程序）法案》所规定的指南与法规进行。所有操作均使用无菌（经高压灭菌）的外科器械和耗材。尽管本文所展示的小鼠肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型是在8周龄雄性Balb/c小鼠上实施的，但该模型亦可稳定地应用于多种品系、任一性别的小鼠，通常年龄范围为7至15周，其中以8周龄为最佳。代表性结果部分的数据来自Balb/c和FVB小鼠。实验中使用温热的生理盐水以保持肠道及手术区域湿润，但应谨慎监控并尽量减少用量，因为过量使用液体会导致血清或血浆肌酐水平出现人为性降低，而肌酐是本实验的重要观测指标。

1. 动物准备与剖腹手术

1. 使用氯胺酮（70 mg/kg）和盐酸美托咪啶（1 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，并通过反射消失确认麻醉深度 例如 脚趾捏夹。所产生的麻醉状态持续时间为4小时，足以完成整个手术过程，无需追加麻醉。
2. 去除切口周围区域的毛发，确保该区域无松散毛发残留，并使用稀释的氯己定溶液对腹部皮肤进行消毒。
3. 将小鼠仰卧置于加热的手术垫上，并使用低黏性胶带将其四肢固定在垫上。确保上肢保持在正常位置，以防止压迫肺部。在整个手术过程中监测小鼠是否出现热灼伤。如有可能，建议使用非电热源。
4. 皮下注射盐酸丁丙诺啡（0.06 mg/kg），并涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。术前给予镇痛剂有助于术后恢复。
5. 使用组织分离剪或手术刀片做正中腹切口，并钝性分离皮肤与腹膜。这使得在伤口闭合时可分别缝合皮肤和腹膜。切开无血管的白线，以进入腹膜腔。
6. 插入拉钩并覆盖小鼠，以清晰暴露手术区域。

2. 输尿管离断与右肾切除术

1. 使用经高压灭菌并以生理盐水润湿的棉签，轻柔地将肠管推向腹腔左侧，以暴露右侧肾脏和输尿管。用湿润的敷料覆盖肠管，防止其干燥。
2. 用弯头镊子提起右侧输尿管，使用6/0编织丝线对输尿管进行双重结扎。对于长期实验，所有腹部手术均应使用可吸收缝线。
3. 在两道结扎线之间切断输尿管。尽管膀胱输尿管连接处可防止尿液从膀胱渗入腹膜腔，但在长期实验中仍需结扎输尿管，以作为术后防止任何渗漏的安全措施。
4. 为便于进行右侧肾切除术，使用湿润的棉签轻柔地将肝脏向上并向右推移，并用湿润纱布固定其位置，以暴露右侧肾动脉和静脉。
5. 钝性分离右侧肾脏内侧的结缔组织和脂肪，直至暴露右侧肾动脉和静脉。
6. 通过将弯头镊子小心地从血管下方插入，于肾动脉和静脉下方创建一个通道。插入时镊尖保持闭合，然后轻轻张开镊尖并撤出，以利于通道形成。
7. 重复步骤2.6，直至镊尖透过肾动脉和静脉上方的结缔组织可见。一旦可见，轻柔地将该镊尖与另一把弯头镊子的镊尖相互摩擦，以轻柔地撕裂结缔组织。
8. 当肾动脉和静脉已清晰可及，即可对其进行阻断。将弯头镊子镊尖闭合状态下小心地插入肾动脉和静脉下方。到位后张开镊尖，将止血夹施加器从镊尖之间插入，并在靠近肾脏处牢固地夹上一个止血夹。或者，也可使用6/0编织丝线结扎肾动脉和静脉。
9. 在靠近肾脏处切断已被阻断的肾动脉和静脉，随后将肾脏连同任何残留的附着结缔组织一并移除。
10. 移除用于固定肝脏的纱布，并用棉签将肠管复位。

3. 左肾缺血与再灌注

1. 用棉签将肠管轻柔地推向腹腔右侧，以暴露左侧肾脏和输尿管，并用湿润的纱布覆盖。如有必要，可用湿润纱布将胰腺轻轻推开，以便更方便地进行操作。
2. 采用钝性分离法，轻柔地分离左侧肾动脉和肾静脉前、后方的结缔组织，然后以类似于“输尿管切断与右肾切除”步骤2.4中所述的方法，在血管下方建立一个通道。
3. 通过在肾动脉和肾静脉上放置微型Serrafine夹，诱导左肾缺血。成功的缺血可通过肾脏逐渐均匀变暗在视觉上确认。除左侧肾动脉和肾静脉外，偶尔可能有其他血管供应肾脏。若存在这些额外血管，也需使用微型Serrafine夹将其阻断，以确保整个肾脏成功诱导缺血。
4. 将肠管复位，并仔细确认无任何可能导致肠缺血从而影响实验结果的急剧扭转。用单针缝线暂时关闭腹膜。
5. 在诱导缺血后，立即将小鼠置于恒温毯上，并连接带有直肠热敏电阻探头的控制装置，以在整个缺血期间维持体温在37 °C。为确定诱导所需程度肾损伤和肾功能衰竭的合适缺血时长，建议针对每种小鼠品系和每位手术操作者进行剂量效应测试。
6. 在缺血期即将结束前，重新打开腹膜，仔细调整肠管位置，以便接触夹子并观察肾脏。如视频所示，插入牵开器并非必要步骤，仅为展示目的而进行。
7. 在缺血期结束后移除夹子。移除后，肾脏颜色将迅速由深紫红色转变为健康的深粉红色，表明再灌注成功。
8. 再次确认肠管无扭曲后，使用6/0编织丝线行毯边缝合关闭腹膜。然后使用金属皮肤夹关闭皮肤。
9. 为降低术后感染风险，应在手术区域涂抹碘酒/酒精等消毒剂。

4. 术后恢复与护理

1. 皮下注射盐酸阿替美唑（2 mg/kg）部分逆转麻醉效果，并皮下注射 1 ml 温热生理盐水，以预防术后脱水。
2. 密切监测小鼠，直至其恢复意识、表现警觉且能够自主翻身。
3. 将小鼠置于安静环境中、温度维持在 29 °C 的加热箱内恢复 24 小时。由于麻醉会影响小鼠的体温调节能力，因此将其饲养在较高温度环境中对有效恢复至关重要。可提供湿润的食物，以促进其摄入水分和营养。
4. 对于长期恢复实验，应持续给予镇痛药物，并于术后 7 天拆除皮肤夹。

5. 评估肾脏功能与结构损伤及再生

1. 实验过程中可从尾静脉采血，或在实验结束实施安乐死后通过心脏穿刺采血。采用肌氨酸酶法，使用生化离心分析仪检测血清肌酐水平，并测定血液尿素氮（BUN）以评估肾功能，具体操作如前所述。⁷在建立肾衰竭模型之前，需要确定正常健康小鼠的肾功能，因为其结果可能因所采用的分析方法不同而存在显著差异 例如 苦味酸反应法与肌酐酶法在测定肌酐时结果不同。
2. 通过苏木精和伊红（H&E）染色的石蜡包埋肾组织切片进行组织病理学检查以观察肾脏结构&E）染色或过碘酸雪夫（PAS）染色。在每只小鼠外髓外带（OSOM）区域，以200倍放大倍数采集5–10张图像。评估OSOM区域的损伤程度，因为在该模型中此区域易受缺氧影响而发生损伤。
3. 使用下述两种评分系统之一来评估急性肾小管坏死（ATN）或再生。这些系统所采用的分类代表性形态如图所示 图1.
4. 采用简单的二元系统对ATN进行评分。根据细胞完整性和形态，将肾小管标记并计数为存活（细胞形态完整）或坏死（细胞完整性受损、细胞形态异常或细胞缺失）。
   1. 将坏死小管的数量表示为小管总数的百分比（坏死小管%）。
5. 根据细胞完整性、形态和细胞核数量，采用另一种分类系统对再生情况进行分类。按照以下步骤中列出的标准，将小管标记并计数为健康、坏死、损伤或恢复中。
   1. 与ATN评分系统（详见步骤5.4）相同，将具有完整正常细胞的肾小管标记为健康，而细胞完整性受损、细胞形态异常或明显细胞脱落的肾小管应评为坏死。
   2. 若肾小管细胞质变薄且含细胞核较少，则将其归类为受损。相反，若肾小管含有较多细胞核且细胞形态趋于正常，则将其归类为正在恢复。
   3. 将每种小管分类表示为小管总数的百分比。

结果

肾小管损伤与修复可通过肾缺血再灌注损伤（IRI）后组织切片的H&E染色或PAS染色进行评估。位于外髓质部（OSOM）的小管根据细胞形态、完整性及细胞核数量被分类为健康、损伤、坏死或恢复状态（图1）。该模型中的功能性和结构性损伤程度取决于缺血持续时间。随着缺血时间以每2分钟递增，通过血浆肌酐和尿素氮（BUN）评估的肾功能障碍严重程度呈进行性升高（图2）。结构性肾损伤的程度（由急性肾小管坏死ATN评分推断）也呈现类似趋势，更严重的ATN伴随更长时间的缺血（图3）。在初步确定不同缺血持续时间的剂量效应后，该肾IRI模型应可达到接近100%的成功率，即所有小鼠在手术后均出现功能性和结构性损伤。该肾IRI模型还可实现对损伤程度的精细调控，且动物间变异较小（图2和图3）。通过采用不同持续时间的缺血处理，可评估各种治疗干预措施对不同损伤严重程度的调节能力。例如，根据缺血时间长短，所导致的损伤可被划分为轻度（20分钟）、中度（22分钟）或重度（24分钟）。上述数值适用于8周龄雄...

讨论

肾缺血再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的重要病因，目前尚无特异性治疗方法。对肾IRI的实验研究已取得重要进展，先前的工作已证实巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、调节性T细胞以及其他细胞和介质在急性损伤及修复阶段均发挥重要作用^5,8-16。此外，实验性肾IRI模型还被用于评估多种治疗药物的效果^4,17-19。

本文详细介绍的肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型采用正中腹切开术，进行右肾切除，并使用夹子阻断左肾血流以诱导缺血。如代表性实验结果所示，通过调整缺血持续时间可控制损伤的严重程度。因此，可根据具体实验需求，对该模型进行调整以诱导轻度、中度或较重程度的肾脏损伤。然而，该模型的一个局限性在于，不适合通过长时间肾缺血来诱导极重度的肾脏损伤，因为由此导致的严重急性肾功能障碍可能引起较高的死亡率。

该模型有多个关键方面，对于实现可预测且可重复的肾损伤至关重要。此模型的一个主要变异来源可能来自缺血期间的体温²⁰。因此，在整个缺血期间必须将体温维持在恒定水平并进行持续...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织剪刀	Fine Science Tools	14072 - 10
显微有齿Adson镊（大鼠齿型）	精细科学工具	11019 - 12
S&T JFA-5bTC 镊子 - SuperGrip 斜口	精细科学工具	00649-11
科利布里牵开器	Fine Science Tools	17000 - 04
微型夹钳施加器	精细科学工具	18057-14
微型锯齿刀	Fine Science Tools	18055-04
Olsen-Hegar持针器	精细科学工具	12002 - 12
Hemoclip Plus 小型结扎夹	Weck	533837
Autoclip 伤口缝合夹系统，9 mm	哈佛仪器	PY2 52-3748
6-0 丝线黑色编织缝合线	哈佛仪器公司	723288
标准加热垫
恒温毯 &放大器与控制单元	哈佛仪器
Lacri-Lube	艾尔建
Vetasept 氯己定	动物护理
维塔拉：盐酸氯胺酮			100 mg/ml 溶液
多咪静：盐酸美托咪啶			1 mg/ml
Vetergesic：盐酸布托啡诺			0.3 mg/ml
Antisedan：盐酸阿替美唑			5 mg/ml