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方法文章

多模态光学显微技术揭示加勒比造礁珊瑚息肉组织的形态与结构

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DOI：

10.3791/51824

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2014年9月5日

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

本文内容

摘要

一套综合成像技术已被用于确定加勒比珊瑚息肉的形态及组织结构 Montastraeaannularis 和 M. faveolata荧光，连续块面切片， 双光子共聚焦激光扫描显微技术已鉴定出珊瑚的叶状结构、息肉壁，并估算了色素体和虫黄藻的密度及分布情况。

摘要

已采用一套综合成像技术，以确定构成加勒比海造礁珊瑚水螅体组织的三维（3D）形态及细胞结构 Montastraeaannularis 和 M. faveolata这些方法包括荧光显微镜（FM）、连续块面成像（SBFI）和双光子共聚焦激光扫描显微镜（TPLSM）。SBFI 在物理切片后可实现深层组织成像，能够清晰呈现组织表面纹理，并对超过 2 mm 深度的组织进行三维可视化。互补的 FM 和 TPLSM 则可获得组织细胞结构的超高清分辨率图像。研究结果：（1）在单个珊瑚息肉外壁上发现了此前未见报道的叶状组织形态 以及（2）创建了色素细胞和类似藻类的甲藻的三维分布及组织密度的首张表面图谱 虫黄藻 内共生体。500 nm 和 675 nm 处的光谱吸收峰分别表明 M. annularis 和 M. faveolata 含有相似类型的叶绿素和色素体。然而， M. annularis 和 M. faveolata 在这些关键细胞组分的组织密度和三维分布上表现出显著差异。本研究聚焦于成像方法，表明SBFI在脱钙珊瑚组织的大尺度（毫米级）样本分析中极为有用。互补的FM与TPLSM可揭示微小的亚毫米级结构细节 细胞在未脱钙珊瑚组织样本中分布与密度的尺度变化。TPLSM 技术具有以下优势：（1）样本制备侵入性极小， （2）更优的光学切片能力， (3) 极小的光吸收和散射，同时仍能实现深层组织成像。

引言

全球变暖及其伴随的环境变化正直接影响热带海洋珊瑚的健康状况与分布1-4。目前观测到的多种影响包括珊瑚白化以及传染性疾病的出现5-6。然而，要更准确地预测珊瑚对未来这些环境威胁的响应，首先需要建立组织学上的“基线”，即明确“明显健康”珊瑚的组织形态、细胞组成及其分布特征。随后，可据此对“受影响”珊瑚进行定量比较。此外，该基线应在多种环境条件下对明显健康的珊瑚进行建立，以便评估珊瑚在不同环境梯度下的“健康响应”。作为建立该基线的初步步骤，已开展一项高分辨率三维研究，探讨明显健康的珊瑚息肉组织形态和细胞组成如何响应水深（WD）的增加及伴随而来的光照强度下降。研究结果将有助于建立对珊瑚适应机制的更全面理解，同时为珊瑚与其共生体的进化以及光能捕获能力的增强提供科学见解。

石珊瑚（Scleractinia）是一类群居性的海洋无脊椎动物，其体内寄居着多种复杂的微生物群落，统称为“珊瑚全共生体”（coral holobiont）7-10。本研究旨在利用一系列前沿成像技术，同步追踪表观健康的宿主珊瑚在水深增加过程中其组织色素和共生虫黄藻的变化情况。这将为表观健康的珊瑚在不同深度梯度上建立必要的组织细胞比较“基线”，并作为评估珊瑚健康状况的指标10。珊瑚组织中的色素称为“色素细胞”（chromatophores），其功能包括吸收、反射、散射、折射、衍射或以其他方式干扰入射的太阳辐射11。虫黄藻与色素细胞之间的内共生关系，促使珊瑚动物在光能捕获优化、骨骼生长策略以及营养可塑性（在自养与异养之间转换摄食策略）方面实现了协同进化12。

位于南加勒比海的岛国库拉索（原荷属安的列斯群岛的一部分）地处委内瑞拉以北约65公里，位于东西走向的阿鲁巴-拉布兰基亚群岛内图1A）。库拉索岛70公里长的南部海岸带有一条连续的现代和中新世-上新世-更新世-全新世的古代岸礁珊瑚礁带13,14库拉索岛的年平均海表温度（SST）每年约变化3 °C，从1月底的最低26 °C到9月初的最高29 °C，年平均温度为27.5±0.5 °C（NOAA SST数据集，2000–2010年）。Playa Kalki的珊瑚礁（12°22′31.63″N，69°09′29.62″W）位于库拉索岛西北端附近图1A），被选为采样点，因为该区域此前已得到充分研究，且此地的海洋生态系统始终处于新鲜、无污染的海水中7,15-19两种亲缘关系密切的石珊瑚物种， M. annularis 和 M. faveolata，被选为本研究的实验与分析对象，因为每个物种：（1）在礁体上的深度分布具有明显差异且互不重叠，且与陆架边缘及其相关的碳酸盐沉积环境存在明确关联 (M. annularis 范围 = 0-10 米 WD； M. faveolata 范围 = 10–20 米 WD20; 图1B、图2A，以及 2B）；（2）是整个加勒比海地区常见的珊瑚礁骨架构建者21；（3）具有已被深入研究的生态、生理和进化关系22.

本研究的野外采样在库拉索岛Playa Kalki近海采用标准SCUBA潜水技术进行。建立了一条从浅水至深水的地形断面，横跨陆架、陆架边缘并延伸至深水前礁环境。沿此地形断面识别出外观健康的珊瑚个体用于采样，包括：（1）三个直径约1米的M. annularis独立珊瑚个体，均位于水深5米（WD）处；以及（2）三个直径约1米的M. faveolata独立珊瑚个体，均位于水深12米WD处。光合有效辐射（PAR）在5米水深处测得为33–36% PAR，在10米水深处为18–22% PAR。采样于1月进行，当时5米和12米水深的海水表面温度（SST）均为26 °C。对这六个珊瑚个体，均在相同的空间位置（即，每个半球形珊瑚个体约北纬45°位置）进行三次重复取样。每个独立样品为一个直径2.5厘米的珊瑚组织-骨骼芯活检样本，使用清洁的弧形打孔器采集。在标准SCUBA条件下，操作人员戴手套从每个珊瑚个体上采集三个珊瑚组织-骨骼活检样本（共9个来自5米水深的M. annularis群体，9个来自12米水深的M. faveolata群体）。每个活检芯样本在水下采集后立即放入无菌的50 ml聚丙烯离心管中，旋紧管盖密封后带回水面。随后倒去每管中的海水，将每个芯样本浸入、储存并运输于4%多聚甲醛中。

SBFI成像此前已在多种生物样本上开展，包括完整的人脑和人心脏组织、完整的小鼠胚胎、斑马鱼胚胎，以及多种带有完整骨骼的动物样本23-30。这些研究大多采用光学/光镜技术，结合荧光或明场成像方法。然而，过去也有研究利用扫描电镜连续块面成像技术在超高放大倍数下进行观察31。在本研究中，我们首次开发并应用了一种改良的SBFI方案用于珊瑚样本。由于M. annularis和M. faveolata珊瑚息肉的厚度为1-2 mm，常规的光学显微技术均无法穿透整个珊瑚息肉组织的厚度。因此，我们专门针对珊瑚样本设计了SBFI样品制备方案。此外，我们还定制设计了一种立体显微镜载样装置，该装置可通过电机控制在x和y方向上移动。该设备直接对样本的块面进行成像，而无需使用传统显微切片机在显微镜前收集切片。我们还引入了另一种非线性光学双光子显微技术，用于对同一珊瑚息肉在整个珊瑚组织厚度范围内进行成像。该方法克服了SBFI在脱钙过程中可能引起的组织形态和体积（收缩）变化等由样品制备（脱水）和处理流程带来的局限性。此外，我们对珊瑚的发射光谱进行了光谱分辨，以确定其色素蛋白和共生光合虫黄藻之间荧光发射峰及变异特征。这些结果结合所采用的方法进行了评估，重点分析了各方法在数据采集时间、分析时间以及在不破坏珊瑚组织结构完整性的前提下分辨细微结构细节的能力方面的各自优势。

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方案

注意：需为珊瑚样品的连续块面成像准备试剂

1. 预浸蜡

  1. 在玻璃烧杯中熔化 3.6 g 硬脂（STEARIN）薄片，于加热板上充分混匀（60–70 °C）。
  2. 加入 400 mg 苏丹 IV（Sudan IV）（以最小化石蜡背景荧光），充分混匀，直至形成红色半透明溶液。
  3. 加入 96 ml 热的熔融石蜡（100%），充分混匀。

1.2）包埋蜡

  1. 在玻璃烧杯中熔化 7.2 g 硬脂（STEARIN）薄片，并在加热板上充分混合（60–70 °C）。
  2. 加入 0.8 g 苏丹 IV（Sudan IV），充分混合，直至形成红色半透明溶液。
  3. 加入石蜡颗粒（162 g），搅拌至石蜡完全熔化。
  4. 加入 30 g 白色颗粒状 Vybar，在同一烧杯中完全熔化；熔化后充分混合。
  5. 用盖子松松地盖上玻璃瓶，将玻璃瓶放入 60 °C 的对流烘箱中，以保持成分处于液态。所有浸润步骤均在此烘箱中进行。
  6. 将 200 ml 红色石蜡总体积分成两份，分别装入两个 100 ml 的玻璃瓶中。一份用于浸润，另一份用于最终包埋。

1.3）珊瑚组织包埋用于连续块面成像

  1. 清洗从野外采集（SI 视频 1）并保存（在4–5 °C下以多聚甲醛保存3–6个月）的珊瑚息肉，用磷酸盐缓冲液洗涤（3次，每次5分钟），并在准备成像时进行脱钙。将息肉置于ExCal溶液 中脱钙24小时，或直至息肉完全去除CaCO3。将多个脱钙后的珊瑚息肉作为一个整体，依次在25%、50%、75%和100%乙醇中孵育，随后用1倍二甲苯替代物 进行脱水处理。
  2. 将处理后的息肉置于预热至65 °C、含有100%二甲苯替代物的烘箱中。更换新鲜溶液，重复孵育两次，每次30分钟。放置息肉时应使其顶端朝下，且顶面尽可能平整。
  3. 在50 ml Falcon管中配制二甲苯替代物与预浸蜡（步骤1.1）按2:1、1:1和1:2比例混合的溶液。
  4. 将珊瑚息肉依次在上述三种浓度递增的预浸蜡溶液中孵育，随后在100%预浸蜡中孵育3次 ，每次30–60分钟 。
  5. 注意：根据样品厚度，步骤1.3.1–1.3.5可适当延长孵育时间。
  6. 在100%预浸蜡中完成3次孵育后，将样品转移至包埋蜡中（见步骤1.2.6）。
  7. 30分钟后取出包埋蜡，更换为新鲜包埋蜡，并在65 °C下继续孵育至少4小时。

1.4）红蜡包埋

  1. 拍摄包埋块的照片（即放置白色石蜡的不锈钢托盘，样本置于其上）。此步骤是必要的，因为一旦样本被包埋在石蜡中，由于包埋用的红色石蜡不透光，样本的位置将无法看见。
  2. 在新的预热不锈钢包埋模具周围滴加少量高熔点石蜡，并使其冷却。按照步骤1.2.6所述，从第二个容器中倒入少量新熔化的包埋石蜡。
  3. 迅速将珊瑚息肉朝下放置在白色石蜡点上，然后将塑料样本托置于不锈钢托盘上，并继续倒入更多包埋石蜡，使石蜡液面上升至塑料模具的表面。
  4. 将整个装置从65 °C的烘箱中取出，置于实验台或冷却表面上冷却，直至石蜡完全硬化。
  5. 此过程可能需要6小时，甚至长达一至两天。长期保存时，应将包埋块置于干燥环境中，并在4 °C冰箱中避光保存。

1.5）在连续块面切片装置上进行切片

  1. 修整包埋块，并使用切片机切割 1 μm 的切片。无需收集切下的切片，因其会碎成粉末状。请注意，我们仅对包埋块的断面进行成像。 当白色石蜡开始消失时，样品即已显现。
  2. 每次移除切片后，拍摄包含样品的平整块面图像。持续进行，直至珊瑚息肉完全消失，如SI Video 2所示。
  3. 使用单色相机配合FITC荧光滤光片，记录/采集色素细胞/珊瑚息肉自发荧光的图像。每种物种采集3-4个脱钙后的岩芯样本图像。

2. 双光子荧光显微镜下珊瑚成像

  1. 在采集地（海岸）将珊瑚息肉体芯（每个包含约10-12个直径约一英寸的息肉）收获后立即用4%多聚甲醛固定。
  2. 将样品保存在4 °C条件下直至成像。清洗后的体芯倒置于盖玻片底部培养皿（厚度0.17 mm）中的相同溶液中。
  3. 使用780 nm激发的双光子激光，通过10X (0.3 NA)物镜，以两种不同放大倍数（数字缩放）对3-4个息肉进行成像。珊瑚息肉的形状和高度在不同样品间有所差异（通常为1-2 mm），成像深度也受限于物镜的工作距离。
  4. 采用拼图扫描模式，在xy 方向每个焦平面采集约25-100张图像（5×5或10×10拼图），并在z 轴方向以10或20 µm间隔采集50-100张图像，总计每个珊瑚息肉约采集5,000-10,000张图像。
  5. 对三个至四个息肉区域进行成像，以代表一个体芯及珊瑚物种。注意：每个息肉区域的图像采集时间约为2-5小时。
  6. 将所有图像以原始数据格式存储于系统硬盘中，文件格式为LSM 5。使用三维图像分析与渲染软件进行三维重建。

3. SBFI 及双光子光谱荧光数据的三维体积渲染与可视化

  1. 使用程序中的方形裁剪工具对二维数据进行裁剪，聚焦于单个息肉以减小文件大小，并在采集软件中将其合并为单个 TIFF 文件（同时将文件保存为 8 位格式以进一步减小文件大小）。
  2. 在 Imaris Surpass 模块的体积算法下打开 SBFI 数据的组装文件（步骤 1.5.1 中采集）或双光子光学切片的拼接多层 z 栈数据（步骤 2.1.4 中采集）。
  3. 对以三维渲染的 SBFI 数据使用阴影投影进行投影。创建一个等值面模式，对体素设定阈值以生成实心表面结构（SI 视频 3）。
  4. 使用裁剪平面算法在 xy、xz 和 yz 正交模式下观察三维投影，以揭示珊瑚的三维结构与形态。
  5. 在相同的 Imaris 程序中使用关键帧动画模块对投影进行动画处理（SI 视频 3-7）。
  6. 以 5% 压缩率生成视频文件，并使用体积模式（SI 视频 4 和 6）、3D 模式及等值面模式生成 avi 格式的电影片段（SI 视频 5 和 7）。

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结果

一种定制设计的SBFI装置（专为本研究制造；图3）首次生成了M. annularis和M. faveolata珊瑚息肉外表面纹理与形态的详细三维数字高程图（DEMs）（图4及补充视频1-2）。该技术获得了此前未见描述的珊瑚组织层状结构图像，这些结构呈同心圆状从每个息肉中心向外辐射（图4B、4D和4E）。这些层状结构沿被组织覆盖的初级和次级骨骼隔片的最上端脊线堆叠排列，最外侧和最低处的隆起最终与息肉之间的共肉组织合成并融合。尽管珊瑚组织样本经历了高温渗透和包埋的多个步骤，三维息肉形态及其相关层状结构仍得到了良好保存。添加苏丹染料成功使背景呈现不透明的黑色，从而最大限度地提高了每个样本的对比度并增强了信噪比。三维图像及正交平面视图展示了荧光组分沿z轴的分布情况（图4B）。部分切片中存在石蜡碎片，有时会遮挡息肉表面细节，在生成投影图像时已将其去除以提高清晰度。该技术的主要优势在于能够揭示任意厚样本的内部细节...

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讨论

珊瑚礁研究是一项高度跨学科的研究工作，涉及对海洋环境中同时发生的物理、化学和生物现象的分析。因此，对复杂珊瑚礁生态系统的研究所采用的最佳方法是基于“十的幂次”（Powers of Ten）的框架（图 10）。该图示汇编表明，珊瑚生态系统涵盖广泛的尺度范围（10-9 至 105 m）。此外，这一分析表明，在1 mm至1 cm的中等尺度上进行地球生物学分析，是连接野外与实验室研究的关键桥梁。这一“十的幂次”框架为库拉索珊瑚礁生态系统中控制其物理、化学 和生物参数的实验、分析、建模与综合研究提供了整体背景。

本研究首次应用FM、SBFI和CLSM技术的完整整合方案，追踪表观健康的珊瑚对水深增加的响应。由于样本自身带来的多种光学限制（包括吸收、散射及其他现象），可用于成像完整组织或较厚生物样本的光学显微技术一直受到限制。仅在过去的十年中，SBFI扫描电子显微镜已在超高清分辨率下得到应用，同时基于宽场的SBFI光学显微成像也被用于多种生物样本。这些应用包括从脑组织到完整心脏组织的分析，甚至涵盖含...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（UIUC）基因组生物学研究所的组织学技师Donna Epps在样品制备和切片过程中提供的出色技术支持。本研究得到了美国海军研究办公室向B.W. Fouke提供的研究资助（项目编号：N00014-00-1-0609）。此外，C.A.H. Miller获得了UIUC地质学系Wanless奖学金、UIUC地质学系Leighton基金以及UIUC地质学系Roscoe Jackson野外工作基金的资助。本文所提出的解释仅代表作者观点，未必代表资助机构的立场。我们还感谢位于库拉索的加勒比生物多样性研究与管理（Carmabi）实验室在采集珊瑚组织活检样本过程中所提供的支持与合作。我们感谢IGB媒体传播专家Claudia Lutz在语言修改方面提供的有力帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
珊瑚组织骨架来自自然生境的2.5 cm活检样本
环钻取样装置C.S. Osborne and CompanyNo. 149用于珊瑚活检样本采集
多聚甲醛Electron Microscopy SciencesRT 1570016% 预稀释液
Histoclear/Safeclear IIElectron Microscopy SciencesRT 64111-04无毒替代二甲苯，用于脱水和脱石蜡
二甲苯和乙醇Fisher Scientific脱水
石蜡Richard Allen ScientificType H REF 8338浸润溶液
VybarThe Candle Maker红色石蜡组分
硬脂酸The Candle Maker红色石蜡组分
苏丹IVFisher ChemicalS667-25红色石蜡——不透明背景染色
麦胚凝集素（WGA）Life TechnologiesW32466用于标记  珊瑚黏液
Prolong GoldLife TechnologiesP36095抗荧光淬灭封片介质
Fluoro DishWorld Precision InstrumentsFD-35-100用于双光子成像
XY轴电机、驱动器与控制器Lin Engineering211-13-01R0, R325, R256-ROXY平面平移运动
加热板CorningDC-220熔化所有石蜡
对流烘箱YamatoDX-600浸润与包埋
组织处理仪LeicaASP 300脱水、浸润
切片机LeicaRM2055一次性刀片
体视显微镜Carl ZeissStereolumar V 121.5倍（30 mm工作距离）物镜
带ApoTome的荧光显微镜Carl ZeissAxiovert M 200, ApoTome I 系统息肉体薄切片成像：虫黄藻
Axiocam相机Carl ZeissMRm单色相机，1388×1040像素
Axiovision软件Carl ZeissVersion 4.8图像采集程序
双光子激光器SpectraphysicsMaitai eHP, 脉冲激光器（70 fs）配备DeepSee模块
激光扫描显微镜Carl ZeissLSM 710 带光谱检测器34通道PMT检测
Zen软件Carl Zeiss2010或更高版本用于双光子和光谱图像采集
Imaris Suite软件Bitplane, Inc.,Version 7.0或更高版本三维体积重建、等值面渲染、可视化

参考文献

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珊瑚息肉成像连续块面成像双光子显微镜荧光显微镜组织形态学分析色素细胞分布虫黄藻定位脱钙珊瑚组织石蜡包埋技术切片机切片
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