方法文章

多模态光学显微镜方法在加勒比海礁珊瑚显示息肉组织形态和结构

DOI：

10.3791/51824

⸱

2014年9月5日

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一个集成的成像技术套件已经被应用于确定息肉形态学和组织结构在加勒比海珊瑚Montastraea annularis和M. faveolata。荧光，串行块面，和双光子激光扫描共聚焦显微术已经确定叶形结构，息肉墙壁，和估计的色素细胞和虫黄藻密度和分布。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一个集成的成像技术套件已经被应用来确定三维（3D）的形态学和细胞息肉组织结构，包括加勒比礁珊瑚Montastraea annularis和M. faveolata。这些方法包括荧光显微技术（FM），串行块面成像（SBFI），和双光子激光扫描共聚焦显微镜（TPLSM）。 SBFI提供物理切片后深层组织成像;它详细说明了组织表面纹理和三维可视化到组织的深度超过2毫米。组织细胞结构的互补性调频和TPLSM产量的超高分辨率图像。结果：（1）确定的个别珊瑚虫的外壁和先前未报告叶形组织的形态（2）创建的色素细胞和藻类状藻虫黄内共生体的三维分布和组织密度的第一表面上的地图。光谱吸收豌豆500 nm和675 nm的KS，分别提示M. annularis和M。 faveolata包含相似类型的叶绿素和色素细胞的。然而，M annularis和M。 faveolata呈现的组织密度，对这些关键细胞成分的三维分布显著差异。本研究着重于影像学方法表明SBFI是对脱钙珊瑚组织大型毫米级样品的分析非常有用。免费FM和TPLSM揭示nondecalcified珊瑚组织样本中的细胞分布和密度微妙的亚毫米尺度的变化。该TPLSM技术能提供：（1）微创样品制备，（2）优良的光学切片的能力，以及（3）最小的光的吸收和散射，同时仍允许深部组织成像。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全球变暖和相应的环境变化都直接影响热带海洋珊瑚1-4的健康和分布。多重影响正在被观察到，包括珊瑚白化和传染病5-6的出现。然而，未来的珊瑚应对这些环境威胁更准确的预测将需要进行组织学“基线”成立，它定义了组织形态和细胞的组成和分布“看起来健康”的珊瑚。反过来，“影响”珊瑚然后可以定量比较。此外，该基线应建立在外表健康的珊瑚在各种环境条件下，使“健康反应”也可以跨越环境梯度来衡量。由于对建立这一基础的第一步，高分辨率3D已开展研究如何看起来健康的珊瑚虫组织形态和细胞成分响应增加水深（WD）和随附的跌幅在阳光辐照度。结果可以用来确定珊瑚适应更全面的机械理解，以及深入了解珊瑚共生演进和捕光增强。

石珊瑚（ 石珊瑚 ）是殖民地的海洋无脊椎动物中发挥主机到复杂的组合等微生物，统称为珊瑚holobiont 7-10。在本研究中所进行的研究旨在利用一套先进的成像技术，同时跟踪随水深组织颜料和看起来健康的宿主珊瑚共生的虫黄藻的变化。这将建立所需要的比较组织细胞的“基线”跨越水深梯度看起来健康的珊瑚，并作为珊瑚老天指标LTH 10。珊瑚色素，称为色素细胞 ，起到吸收，反射，散射，折射，衍射，或与入射太阳辐射11以其他方式干扰。虫黄藻，色素细胞内共生关系，使中高屋建瓴捕光优化和骨骼成长战略的协同进化，以及营养的可塑性（移喂养策略回来的往复从自养到异养）的珊瑚动物12。

库拉索岛南部的加勒比海岛国（荷属安的列斯以前部分）位于委内瑞拉以北约为65公里，东西走向的阿鲁巴岛香格里拉Blanquilla群岛（ 图1A）内。库拉索岛的70公里长的南海岸包含一个连续的现代化和中新世-上新世-更新世-全新世古岸珊瑚礁道13,14。年平均海温的变化库拉索岛约3℃的nually，从一月下旬最低26℃，最高29℃，在九月初，有27.5±0.5ºC的年平均温度（NOAA海温资料集2000-2010）。珊瑚礁的Playa Kalki（12°22'31.63“N，69°09'29.62”W），躺在库拉索（ 图1A）的西北尖端，被选为抽样，因为它之前已经充分研究和在这个位置上的海洋生态系统正沐浴在清新无污染海水中7,15-19。 。两个密切相关的石珊瑚物种，M. annularis和M faveolata，被选择用于实验和分析在本研究中，因为每个物种：（1）相对于所述货架断和上礁道呈现明显不同的和不重叠的等深线分布相关的碳酸盐沉积的沉积环境（M. annularis范围= 0-10米的WD; 米faveolata范围= 10-20米WD 20; 图1B，2A和2B）; （2）在整个加勒比海21一 ​​个共同的珊瑚礁框架构建;和（3）具有充分研究的生态，生理和进化关系22。

现场取样本研究采用离岸滩Kalki库拉索岛的标准水肺潜水技术进行的。浅到深的水中测深断面成立跨架子跑了，过了保质突破，并进入深水区前礁环境。显然，健康的珊瑚头，然后确定了采样沿着这条测深断面，其中包括：（1）三个人约1米直径的珊瑚M的头annularis，所有这些都是以5m水深度（WD）; （2）三个独立的约1米直径的珊瑚M的头所有这些faveolata，是在12米WD。光合有效辐射（PAR）的测定为33-36％的PAR为5m的WD和18-22％的PAR以10米的WD。采样是在1月​​进行，当海温为26℃时的水深均5米和12米每六珊瑚头进行采样，一式三份，在同等空间位置（ 即约45°北纬每六个半球状珊瑚头）。每个单独的样本包括收集与清洗拱冲，一个直径为2.5厘米的珊瑚组织构架核心活检。三珊瑚组织，骨骼活检取样标准潜水用戴手套的手从每个珊瑚头（从9 米annularis为5m的WD殖民地，从9 米faveolata在12米WD）。后立即收集在深度，每个活检核心样品置于无菌50毫升聚丙烯离心管中，螺旋盖密封，并返回到表面。海水从每个离心管中倾出，每个核心活检后，浸渍，储存，并在4％多聚甲醛输送。

SBFI成像之前已在广泛的生物样品，包括全脑和全心脏的人体组织，完整的小鼠胚胎中，斑马鱼胚胎中，并且多种类型的动物样品的具有完好骨头23-30的进行。这些研究大多利用光/光镜带任何荧光或明场技术。然而，研究已经在利用扫描电子串行块面成像，在过去的31超高放大倍率进行。在本研究中，修饰SBFI协议已被开发用于与施加到珊瑚首次。由于M。 annularis和M。 faveolata珊瑚虫是1-2毫米的厚度，没有任何的常规光显微技术将能够穿透珊瑚息肉组织的整个厚度。因此，我们有专门为珊瑚样本设计SBFI样品制备协议。此外，我们的定制设计了立体支架，该机动化地在X和Y两个方向上移动。该装置采用的样本的块面的图像，而不是使用常规的切片在显微镜的前收集的部分。我们还介绍了另一种非线性光学双光子显微技术将图像的同一珊瑚虫整个珊瑚组织的整个厚度。这克服了由SBFI在脱钙的术语，并且可以由样品制备（脱水）和处理协议来诱导组织的形态和容积（收缩）的变化的可能性，所施加的限制。此外，从珊瑚排放剖面，光谱分辨识别色素细胞和虫黄藻光合作用的高峰排放量和变化。这些结果在使用该方法的情况下和其有关的采集时间个别的优点，分析时间，并解决精细结构细节不损害str中的能力进行了评价珊瑚组织uctural完整性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

被珊瑚样品的连续块面成像试剂准备：注意

1 Preinfiltration蜡

  1. 熔融3.6克硬脂薄片在玻璃烧杯中。在热板（60-70℃）拌匀。
  2. 添加400毫克苏丹红四号的（最小化蜡背景荧光）。搅拌均匀，等到红色半透明的解决方案来实现的。
  3. 新增96毫升热熔融石蜡（100％），搅拌均匀。

1.2）嵌入蜡

  1. 熔体7.2克硬脂精片的玻璃烧杯中搅拌均匀的热板（60-70℃）。
  2. 添加0.8克苏丹四。搅拌均匀，等到红色半透明的解决方案来实现的。
  3. 添加石蜡粒（161克），搅拌至融化石蜡完全。
  4. 加入30克白色粒状VYBAR并在相同的烧杯中完全熔化;一旦融化，混匀。
  5. 松散关闭有盖的玻璃瓶。将玻璃瓶在60℃对流OV烯以保持各组分在液体状态。开展这一炉的所有渗透。
  6. 分裂200毫升红蜡的总体积中，以两片玻璃瓶每次100毫升。使用一个等分试样进行渗透，另一个用于最终嵌入。

1.3）嵌入珊瑚组织的串行块面成像

  1. （在4-5℃，在多聚甲醛3-6个月）在磷酸盐缓冲盐水（3×5分钟）洗涤收集在字段（SI视频1），并存储在珊瑚虫和脱钙当准备进行成像。除垢在ExCal解决方案息肉24小时，或者直到为息肉是完全没有的CaCO 3。培育若干脱钙珊瑚虫为单块的25，50，75，和100％的乙醇系列，其次是1X二甲苯替代品脱水的样品。
  2. 将处理过的息肉含100％二甲苯代替预热65℃的烘箱。樟宜孵育30分钟两次ng到新鲜的解决方案。定向成这样的息肉的息肉的顶端朝下，顶表面是尽可能平坦。
  3. 使2解决方案：1，1:1和1:2二甲苯替代品和preinfiltration蜡（步骤1.1）在50毫升猎鹰管。
  4. 孵育珊瑚虫与这三个浓度增加preinfiltration蜡中，随后3次温育在100％preinfiltration蜡，每次30-60分钟。
  5. 注意：根据样品的厚度，步骤1.3.1-1.3.5可以随时间较长。
  6. 将样品包埋蜡（见步骤1.2.6）在100％preinfiltration蜡3×孵育后。
  7. 30分钟后，取出嵌入蜡。更换新鲜嵌入蜡，继续培养至少4小时在65℃。

1.4）在红蜡嵌入

  1. 拍摄所述块（不锈钢托盘，其中的白色蜡放置并在其顶部的SAMPLE放置）。这是必要的，因为一旦嵌在蜡中，样品的位置将变得不可见的嵌入红蜡是不透明的。
  2. 放置小滴的高熔点蜡围绕新的预热的不锈钢包埋模具并使其冷却。如步骤1.2.6声明倒入少量从第二个容器新鲜融化的石蜡包埋的。
  3. 位置朝下在白蜡点很快的珊瑚虫，然后放置一个塑料的样品架的不锈钢托盘上，倒更嵌入蜡，使得蜡过来对塑料模具的表面上。
  4. 以整个安装了65℃烘箱中，并允许它在长凳或阴凉表面冷却，直到蜡完全变硬。
  5. 这可能需要6小时，最多两天。放置在4℃下干燥处理的冰箱挡，避光，长期储存。

1.5）切片的串行块面设置

  1. TR即时通讯块切成1微米的部分用切片机。不收的部分，因为它们会变成粉末。请记住，我们只是成像的块面。样品在白色蜡开始消失出现。
  2. 捕捉到光滑的块面，其中包含的样本部分被删除，每次的图像。继续下去，直到珊瑚虫消失在SI视频2。
  3. 用FITC标记的荧光滤镜拿起自动荧光色素细胞/珊瑚虫的录制/撷取用黑白摄像机的图像。图片来自每个品种3-4脱钙核心。

2，成像珊瑚在双光子荧光显微镜

  1. 修复珊瑚虫核心，以收集（海边）网站每个包含大约10-12息肉直径约一英寸，在4％多聚甲醛，只要它们在水中收获。
  2. 保持样品在4°C，直到成像。洗涤芯被放置在第ê同一个解决方案中的玻璃盖底部盘倒挂（0.17毫米厚）。
  3. 利用双光子激光在使用10X（0.3 NA）的物镜780 nm激发，像3-4息肉两种不同的放大倍率（数码变焦）。珊瑚息肉形状和高度的样品（通常为1-2毫米），该成像深度之间的差异也只限于通过成像物镜的工作距离。
  4. 使用瓦片扫描模式收集约25-100（5×5或10×10瓦）到z轴中的xy每焦平面图像和50-100的图像10或20微米的间隔，总数约为5,000-10,000的图像/珊瑚虫。
  5. 图片三时五十七息肉领域，代表了核心和珊瑚的物种。注：2-5小时/息肉区域之间的图像采集时间不同。
  6. 存储原始数据格式的所有图像在系统的硬盘作为LSM 5渲染3D在3D图像的分析和渲染软件。

3，三维体绘制与可视化Ñ​​SBFI和双光子荧光光谱数据

  1. 裁剪二维数据通过专注于一个单一的息肉用在程序中广场裁剪工具，以减少文件大小和编译成一个单一的TIFF文件（减小文件的大小也通过保存在8位格式的文件）的采集软件。
  2. 在程序中了Imaris超越模块下的体积算法打开SBFI数据的汇编文件（收集步骤1.5.1）或平铺多个z栈的双光​​子光学部分（收集步骤2.1.4）。
  3. 项目中使用了一层阴影投射在3D渲染的SBFI数据。创造一个体素是阈值化创造了坚实的表面图案（SI视频3）的等值面模式。
  4. 使用可视化的剪取平面算法在XY，XZ的3D投影和YZ正交模式，揭示珊瑚三维结构和形状。
  5. 在相同了Imaris程序使用关键帧动画模块的动画投影（SI六DEOS 3-7）。
  6. 生成的视频文件，在5％的压缩和使用量生成AVI格式的影片剪辑（SI影片4和6），三维等值面和方式（SI视频5和7）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

定制设计的SBFI设备（专门针对本研究制造; 图3）产生的第一个详细的三维数字高程外表面质感的米和形态的地图（数字高程模型） annularis和M。 faveolature珊瑚虫（ 图4和SI视频1-2）。此得到的珊瑚组织同心地从每个息肉（ 图4B，4D和4E）的中心向外辐射的先前未描述的堆叠凸起的图像。这些瓣沿堆叠组织覆盖中小学骨骼隔的最高山脊，与径向最外侧和最下层的高度叶最终合成和息肉之间的共肉组织合并。三维息肉形状和关联瓣被保存完好，尽管通过若干步骤的高温渗透和嵌入有消失的珊瑚组织样本。在additioÑ​​苏丹染料的成功掩蔽的背景为不透明的，与黑颜色具有有助于最大化各样品的对比度和提高信号噪声比。三维和正交平面的观点表明沿z轴（ 图4B）的荧光成分的分布。有飞机用蜡片，有时掩盖息肉表面细节，这在创建预测时，被拆除的清晰度。该技术的主要优点是在揭示任何厚的样品的内部细节，因而无需采取多个部分并对齐它们在以后的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

珊瑚礁研究是一个高度跨学科的研究工作，包括分析，同时物理，化学和生物现象工作在海洋环境。复杂的珊瑚礁生态系统的研究中上下文框架（ 图10）中的“十国”，因此最好的完成。此图编制说明，珊瑚生态系统涵盖了广泛的空间尺寸（10-9至10 5米）。此外，这次演习表明地球生物学在中间长度比例为1毫米1厘米分析是结合现场和实验室分析所需的桥梁。十大框架这是权力的背景下进行的实验，分析，建模和综合的物理，化学，以及控制库拉索岛珊瑚礁生态系统的生物参数。

本研究是首次应用完全集成套件Ø˚F调频，SBFI和激光共聚焦显微镜技术来跟踪表面健康的珊瑚，以增加水深的响应。可将图像的全部组织或厚的生物样品光学显微镜工具已经因各种各样的由样品本身，它包括吸收，散射，以及其他现象所造成的光学条件的限制。在刚刚过去的十年中，SBFI扫描电子显微镜使用几种生物样品的基于宽视场成像SBFI用于超高分辨率31以及光显微成像。这包括了从脑到整个心脏组织甚至含有骨骼进行研磨，抛光，标记的样品的分析，并成像在之后的每个部分被制...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 （UIUC） 基因组生物学研究所的组织学家 Donna Epps，感谢她在样品制备和切片方面的有力技术帮助。这项工作得到了海军研究办公室 （N00014-00-1-0609） 对 BW Fouke 的研究资助的支持。此外，C.A.H. Miller 还获得了 UIUC 地质系 Wanless 奖学金、UIUC 地质系 Leighton 基金和 UIUC 地质系 Roscoe Jackson 实地考察基金的资助。本手稿中提出的解释是作者的解释，可能不一定代表资助机构的解释。我们还感谢位于库拉索岛的加勒比生物多样性研究与管理 （Carmabi） 实验室在收集珊瑚组织活检样本方面的支持和合作。我们感谢 IGB 媒体传播专家 Claudia Lutz 的出色语言纠正。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
珊瑚组织骨架2.5 厘米 来自自然栖息地的活检
拱形打孔取芯装置CS Osborne 和公司编号 149用于珊瑚活检采集
多聚甲醛电子显微镜科学RT 1570016% 预稀释
Histoclear/Safeclear II电子显微镜科学RT 64111-04二甲苯的无毒替代品，脱水和脱氢
二甲苯和乙醇Fisher Scientific脱水
蜡Richard Allen ScientificH 型 REF 8338浸润溶液
Vybar红蜡蜡烛制造
蜡烛制造成分
Fisher ChemicalS667-25红色蜡不透明背景
小麦胚芽凝集素 （WGA）Life TechnologiesW32466用于标记 珊瑚粘液
延长黄金Life TechnologiesP36095防褪色封固剂
氟盘World Precision InstrumentsFD-35-100用于双光子成像
XY 电机、驱动器和控制器Lin Engineering211-13-01R0， R325， R256-ROXY 平移运动
热板康宁DC-220熔化所有蜡
对流烘箱YamatoDX-600浸润和包埋
组织处理器LeicaASP 300脱水、浸润
切片机LeicaRM2055一次性刀
立体显微镜Carl ZeissStereolumar V 121.5x （30 mm WD） 带
ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200，ApoTome I 系统成像 息肉的薄片：虫黄藻
Axiocam 相机卡尔蔡司MRm单色相机 1388x1040 像素
Axiovision 软件卡尔蔡司4.8版 图像采集程序
双光子激光光谱物理学麦泰 eHP，脉冲激光 （70 fs）带 DeepSee 模块
激光扫描显微镜卡尔蔡司带光谱检测器的 LSM 71034 通道 PMT 检测
Zen 软件Carl Zeiss2010 或更高版本，用于双光子和光谱图像采集
Imaris Suite 软件Bitplane， Inc.，版本 7.0 或更高版本3D 体积、等值面渲染、可视化
石硬脂的成分 红蜡苏丹 IV 的 的物镜荧光显微镜

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535(2013).
  2. Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
  3. Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
  4. Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
  5. Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
  6. Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
  7. Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
  8. Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
  9. Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
  10. Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
  11. Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3(2006).
  12. Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
  13. Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
  14. Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
  15. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
  16. Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
  17. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
  18. Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
  19. Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
  20. van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
  21. Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
  22. Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
  23. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591(2012).
  24. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
  25. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575(2012).
  26. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
  27. Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
  28. Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
  29. Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
  30. Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
  31. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  32. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
  33. Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
  34. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章