在啮齿类动物强制运动中实现依从性：评估运动对衰老相关疾病影响的关键标准

摘要

运动可能缓解与神经退行性疾病相关的行为障碍。尽管针对运动介导效应机制的研究在疾病模型中有所增加，但伴随这些疾病（特别是衰老）的神经生物学背景可能尚未得到充分考虑。本文阐述了提高老年大鼠运动实验范式成功率的若干措施。

摘要

目前，人们越来越认识到运动对改善多种具有神经生物学基础的疾病状态具有积极作用，包括改善认知功能和身体机能。因此，采用运动干预的动物研究数量不断增加。有观点认为，强制运动的一个内在优势在于研究者能够控制可能影响运动对行为结果作用的各种因素，尤其是运动频率、持续时间和运动方案的强度。然而，强制运动方案的依从性可能成为一个问题，特别是需要避免使用足底电击等潜在干扰因素时。同样重要的是，由于大多数认知和运动功能障碍发生在老年个体中，因此在评估运动对这些功能障碍的影响时，应考虑使用老年啮齿类动物模型，并尽可能提高其依从性，以减少实验所需动物数量。本文将介绍并讨论在老年啮齿类动物模型中实现接近100%跑台运动依从性所需的关键步骤和注意事项。无论研究者采用何种具体的运动方案，本方案均可为那些特别关注强制运动对衰老相关功能障碍（包括衰老相关的帕金森综合征和帕金森病）潜在影响的研究人员提供参考。

引言

作为维持健康与福祉的可行方法，那些能够预防或减轻与衰老相关的认知和运动功能损伤的非侵入性生活方式策略正受到越来越多的关注^1,2。例如，中年男性每周坚持进行中等到高强度的规律锻炼，其运动能力相较于同龄人会随着年龄增长而显著增强³。此外，越来越多的证据表明，此类生活方式干预（如体育锻炼）能够缓解甚至逆转与帕金森病（Parkinson’s disease, PD）等神经退行性疾病相关的功能损伤⁴。

为了理解与衰老相关功能障碍的分子机制，研究工作也致力于探索非侵入性策略（如运动）如何逆转或减轻导致此类功能障碍的机制。跑步机运动便是其中一种策略，目前在帕金森病（PD）^5-7 和认知功能障碍¹ 的动物模型中日益被采用，但其改善运动或认知功能的具体机制仍有待阐明。然而，必须指出的是，衰老是帕金森病的神经生物学基础。因此，任何在动物模型中观察到的运动益处若要转化为人类临床应用，就必须充分考虑衰老的神经生物学背景。例如，在帕金森病进展过程中，原本可延缓运动功能障碍的代偿机制可能因衰老过程本身而受损⁸。因此，有必要开发出相应的运动干预范式，不仅要考虑在存在或不存在疾病病理情况下衰老的影响，还应能够在老年啮齿类动物中启动并长期维持。

因此，在考虑衰老的神经生物学背景时，研究者应审慎选择大鼠品系。目前有多种大鼠品系可用于衰老研究， notably 包括 Fischer 344 和 Brown-Norway/Fischer 344 F₁（BNF）杂交品系。常用的 Sprague Dawley 大鼠（一种远交系）也适用于此类研究，因其常被用于神经退行性疾病模型，例如 6-羟基多巴胺帕金森病模型。本实验室在衰老及神经退行性疾病研究中同时使用 Sprague Dawley 和 BNF 品系。在本报告中，我们将展示采用这两种品系的运动干预实验结果。对于专注于年龄相关研究的研究者而言，BNF 品系具有一些重要优势。首先，与其他品系相比，该品系对衰老相关疾病（如肿瘤）的易感性较低，且寿命极长（典型寿命超过 30 个月）。此外，其在多种生理和行为学指标上的个体间变异性较小⁹_，也适用于研究干预衰老进程的策略。此外，诸如强制运动等实验需要研究者进行大量操作，而 BNF 品系性情温顺，具有明显优势。BNF 大鼠在纹状体和中脑多巴胺组织含量以及运动活动方面的衰老相关变化与灵长类动物相似^10-11。本实验室在 BNF 品系中对纹状体和中脑多巴胺信号传导及运动活动的表征与调控方面也积累了丰富的经验^12-16。因此，鉴于随着年龄增长，其他神经生物学相关疾病的风险增加，神经退行性疾病的动物模型应考虑选用在衰老研究中具有长期应用记录的啮齿类品系。

本文所述方案还涉及研究者在解读运动实验所获结果时必须考虑的一些关键问题。啮齿类动物跑台装置（本报告将重点介绍其使用方法）通常在跑台每条跑道后方配备可关闭的电击线圈。然而，当这些电击线圈被激活时，实验动物一旦接触到线圈便会受到轻微足底电击。这种策略在运动研究中常被用于促进动物对跑台运动的依从性。这一点尤其值得重视，特别是对于那些从事受多巴胺或去甲肾上腺素信号通路影响的行为学研究的研究人员而言。足底电击是一种生理应激刺激，其对上述两种神经递质系统的影响已有充分文献记载，可导致酪氨酸羟化酶活性显著升高^17-18。因此，任一神经递质生物合成的增加都可能干扰对运动效应的准确解读，使研究者难以判断运动后观察到的行为变化究竟是源于运动方案本身，还是由电击应激所致。重要的是，本研究所提出的强制运动方案在整个跑台适应期和运动训练期间均未使用任何形式的足底电击。

成功的运动方案还需要受试对象对运动的最高依从性。当因变量指标与受足底电击影响的神经递质信号通路相关时（如前所述），使用足底电击来实现依从性可能会干扰实验结果的解释。因此，挑战在于如何使啮齿类动物，尤其是老龄啮齿类动物，依从于运动方案。任何运动方案的理想目标都是实现接近100%的依从性，因为这将减少完成该运动方案所需的动物数量。具体而言，通过以下几项运动前处理措施，可在本运动方案中实现对运动的最高依从性，并准确解释运动方案的结果：1）采用反转的光-暗循环，使动物在其活跃（清醒）周期内进行运动；2）确保在将动物分入对照组和运动组之前，其运动能力基线水平相等；3）让受试对象经历一个适应期，在此期间逐步引入运动方案的各项要求。本文将评估并介绍上述实验考虑因素及必要步骤，以实现老龄啮齿类动物（>18月龄）对跑台运动接近100%的依从性。最后，与运动相关的环境本身可能具有应激性，从而为确定仅由运动引起的生理效应带来潜在混杂因素。本实验方案还通过以下方式控制跑台环境可能引起的应激影响：非运动组在适应期的每个阶段均参与所有程序（包括轻度跑台运动），并在跑台运动训练期间被放置于静止的跑台上。因此，该方案旨在描述准确评估单纯运动生理效应所必需的各项措施。

方案

以下所有操作均按照路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校的机构动物照护与使用委员会的规定进行，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

1. 运动前准备步骤

注意：本强制运动方案中所有相关操作的时间线如图1所示。

图1. 强制运动方案时间线。该时间线详细列出了研究期间每周运动方案各阶段的重要事件。前适应阶段（第1-2周）包括实验人员对大鼠的抓握操作及基础运动活动评估。在适应阶段（第3-4周），所有大鼠首先经历3天的适应性训练，期间其静置于静止跑台上，随后进行为期10天的跑台适应训练。在运动训练阶段（第5-10周），必须至少完成两轮运动训练（每轮=连续12天），每轮之间间隔2周休息期。可在这些休息期间进行行为学和/或神经化学指标的测量。此外，该方案可调整为在此阶段包含多轮运动训练。在整个研究的各个阶段，均需每周测量一次体重，并在每个阶段开始前（首次训练）和结束后（最后一次训练）分别记录体重。跑台运动训练评分在全部适应和运动训练结束后进行评定，评分范围为1-4分，4分为最高分。具体而言，若大鼠在整个训练过程中无需协助即可完成训练，则评为4分；若大鼠在训练过程中需要少量协助（定义为：协助时间少于训练总时长的25%），则评为3分；若大鼠需要较多协助（定义为：协助时间超过训练总时长的25%），则评为2分；最后，对于不配合且无法完成训练的大鼠，评为1分。

1. 到达动物房后，将所有实验动物分开放置，并单只饲养于标准鞋盒式笼具中。提供食物和水 随意摄取 在整个研究过程中对受试者进行。
2. 在动物饲养区维持12小时颠倒的光暗循环（光照时间为1800至0600），并让实验动物至少适应此循环一周以上。所有行为学实验均应在动物活跃期（黑暗期）进行，且在光暗循环转换前1-2小时完成。
3. 在进行任何行为学实验前两周开始，每天对所有实验对象进行数分钟的抓握操作，以使其熟悉实验人员，并降低因接触新环境（如运动活动箱和跑步机）而引发的新奇性应激反应。
4. 每周测量每位受试者的体重一次，并在每次主要运动阶段的前后（首次和最后一次训练 session）立即进行测量。

2. 基线运动活动评估：确定强制运动分组

1. 连续5天，每天评估受试动物60分钟的自发性运动活动，以建立其基础运动能力。运动活动测试在自动化开放场运动活动记录箱中进行，该记录箱由一个亚克力盒（45 × 45 × 20 cm³）构成，盒内水平和垂直方向安装有红外光束网格，具体设置参照产品说明书建议。
2. 每天运动活动评估开始前，启动并设置与开放场运动活动记录箱连接的计算机及软件程序，用于记录每次测试期间的光束中断次数（即运动活动量）。
3. 每次测试前，在运动记录箱底部铺入约两杯松木屑垫料。
4. 在运动活动测试开始前，将动物从饲养室以其原饲养笼具转移至测试室，并在红光条件下将其放入指定的运动记录箱中。动物放入后，立即在计算机上启动60分钟的测试程序。
5. 运动活动测试结束后，在红光条件下将动物从记录箱中取出，并立即送回原饲养笼具，随后将其送回动物饲养室。
6. 每次测试结束后，清除箱内垫料，并用50%乙醇清洁记录箱的箱壁和底部。
7. 根据需要，每天重复步骤2.3–2.6，进行额外的运动活动测试，直至所有动物均完成测试。所有运动活动测试均应在黑暗环境中进行，且安排在动物活跃周期内，光照-黑暗周期转换前1–2小时。
8. 为避免动物对测试箱产生习惯化效应，每天轮换各动物所使用的记录箱，确保其每天在不同的箱中进行运动活动测试。
   1. 若一天内需进行多次测试，应调整测试顺序，使动物在每次测试中的测试顺序与前一次不同。
9. 根据用于测量运动活动的软件所生成的数据，采用以下5项运动参数确定每只动物的基础运动活动水平：总移动距离（cm）、水平活动量（光束中断次数）、运动次数（主动发起的运动次数）、运动持续时间（秒）以及运动速度（cm/sec）。
   1. 为划分运动组与非运动组（对照组），计算上述步骤2.9中列出的5项运动参数在全部5次测试中的平均值。
10. 根据这5项参数，将动物划分为运动组与非运动组（对照组），确保两组在运动活动水平上具有相近的分布范围。具体方法为：将运动能力相近的两只大鼠配对，其中一只分配至运动组，另一只分配至非运动组。例如，将5项运动参数平均值最高的两只大鼠配对，随机分配其中一只至运动组，另一只至非运动组。对剩余动物重复此配对过程。
    1. 在整个强制运动干预期间及所有数据分析过程中，保持初始配对关系不变。
11. 若研究者关注运动对运动活动能力的影响，可在最后一次跑台运动结束后次日，采用与步骤2.1–2.8.1相同的流程测量运动后的运动活动能力。注：若研究者感兴趣且/或所用自动化运动活动分析软件支持，可进一步分析与焦虑相关的行为指标（即动物在记录箱周边区域与中心区域的停留时间），以评估动物在运动活动测试期间的相对焦虑水平。

3. 跑台适应性训练

1. 在动物活跃周期内，且在明暗周期转换前1-2小时，使用带有透明聚碳酸酯隔板分隔跑道的电动啮齿类动物跑台进行所有与跑台运动相关的操作。
2. 用专为跑步机设计的亚克力挡板取代每个跑道后方的电击线圈，使受试对象能够持续运动而不会接触到电击线圈。为防止训练过程中挡板滑动，使用一个1.5英寸的C型夹将挡板固定到位。
3. 由于跑步机运动训练需要实验人员进行操作，所有跑步机运动训练均应在光照条件下进行。
4. 将大鼠置于其饲养笼中，运送到跑台旁，紧接进行跑台运动训练。当跑台静止时，将大鼠按指定跑道放入跑台，轻轻上推挡板至足以让动物从挡板下方通过的位置，待大鼠进入跑带位置后，再将挡板滑回至静止位置。在所有大鼠均被准确放置于本次训练指定跑道之前，不得启动训练程序。
   1. 在适应期的第一阶段，将每只大鼠置于静止跑台的四条跑道之一（如步骤3.4所述），每天5-10分钟，连续3天。随后每天逐渐增加每次训练的时间。例如， 第1天5分钟，第2天7分钟，第3天10分钟，使大鼠逐渐熟悉跑台装置，以减少因装置新颖性引起的压力。重要提示：切勿将大鼠放置在跑台的任何运动部位例如， 除固定皮带外，此阶段应断开所有电击线圈的电源。
5. 在适应性训练的第二阶段，将每只大鼠放置于静止跑台的一个跑道上，位于挡板前方。当所有受试动物就位后，启动跑台至慢速行走速度（例如， 6 米/分钟）。无论实验分组如何，此阶段均需训练所有大鼠在跑步机上行走，以确保从强制运动方案中观察到的任何潜在效应源于运动训练本身，而非单纯源于运动能力。
6. 当跑台的传送带开始转动时，确保所有大鼠均向前行走。必要时通过调整方向或轻柔触碰引导大鼠，直至其向前移动。在适应性训练期间，训练大鼠在跑台上持续行走，直至其能够在无需实验人员协助的情况下连续自主行走。
   1. 在连续10天内，每天让大鼠在跑台上进行5-10分钟的适应性训练，逐渐增加跑台速度以完成适应过程。为提高大鼠对跑台运动的依从性，在前5次适应性训练中以较低速度（6-8 m/min）进行5-10分钟的训练，在后5次适应性训练中逐步提高至中等速度（9-10 m/min），每次持续5-10分钟。
   2. 确保所有大鼠在适应性训练期的最后一次训练中均能以9-10 m/min的速度持续跑动10分钟。
7. 跑台适应性训练结束后，按照步骤3.4所述的装载方式，将受试动物从跑台上移下。立即将其放回原饲养笼，并运送回动物饲养室。
8. 每次跑台运动训练结束后，使用50%乙醇擦拭每个单独的跑道，包括侧壁和跑带。
9. 通过在每次每日训练结束时分配跑台运动评分，评估每只大鼠在各运动训练阶段的运动能力。当大鼠在整段训练过程中无需协助即可完成时，给予训练评分4分；当大鼠需要少量协助（定义为：在训练时段内接受协助的时间少于25%）时，给予训练评分3分；当大鼠需要大量协助（定义为：在训练时段内接受协助的时间超过25%）时，给予训练评分2分；最后，对于不配合且未能完成运动训练的大鼠，给予训练评分1分。
   注意：该运动评分系统部分借鉴自其他研究¹⁹.
   1. 排除因不配合和/或受伤而无法完成适应期，导致不能进行运动的实验大鼠例如， 这包括在连续多天的适应性训练中，每天跑步机运动训练评分均达到1分的大鼠。
10. 将每个训练阶段的跑步机评分取平均值（例如， 适应性训练和运动训练）以确定每个受试动物的运动能力。在适应期结束时，确保所有大鼠在一次训练过程中均能达到跑台运动评分4分。
    1. 如果某些大鼠在整个训练过程中无法适应其他大鼠维持的最高运动速度，可为这些大鼠调整速度，使其能够在相同训练时长内以较慢速度持续运动。在此情况下，将运动较慢的大鼠安排在单独的训练阶段进行训练，并随着动物对较慢速度的适应逐步提高运动速度。
11. 为避免跑台训练期间跑台上可能存在跑道偏差，每次训练时应在可用的跑台跑道之间轮换每只大鼠，使其在随后的每次运动训练中均于不同跑道进行训练。

4. 跑台运动训练

1. 在最后一次适应性训练结束后的第二天开始运动训练，并持续对大鼠进行连续12天的训练。训练应安排在动物的活跃周期内，并在光-暗周期转换前1-2小时进行。
2. 每次跑台运动训练的设置程序应与适应性训练期间所用的程序相同，具体操作如步骤3.2和3.4所述。
3. 每次训练开始时，将跑台速度设定为低于正式训练速度的热身速度（8 m/min），正式训练速度将在后续训练过程中维持在9-11 m/min。每次训练开始阶段以该热身速度持续运行5-10分钟，随后将速度调整至9-11 m/min，并在整个训练阶段保持此速度。在为期12天的运动训练期间，每次训练平均持续30分钟。
4. 每次运动训练结束后，使用步骤3.9中所述的相同运动评分系统，对运动组所有大鼠进行跑台运动评分。非运动组大鼠在训练期间不进行训练评分。
5. 运动组与非运动组的训练应分别进行。非运动组大鼠应置于静止的跑台上，停留时间与对应运动组大鼠每次训练的持续时间相同。
6. 如步骤3.11所述，每次训练时在可用的跑台通道之间轮换每只大鼠，确保其在后续每次训练中使用不同的通道。
7. 完成一轮运动训练后，让受试动物休息14天。注：该休息周期的选择依据来自图2A和图2B中所述的预实验研究结果。
8. 如需评估，可在12天训练期结束后进行各种行为学和/或神经化学检测。或者，在14天休息期结束后继续开展下一轮运动训练。

结果

强制运动方案三个阶段中所有事件时间线的示意图见图1。除了颠倒明暗周期外，还在任何实验测试前进行每日抓取操作，并实施第1阶段的适应性训练，即受试动物在静止跑台上静坐5–10分钟/天，连续3天，以提高其对强制运动方案的依从性。这些操作被加入实验方案中，旨在减少动物因接触新环境而产生的应激反应，使其在已熟悉静止装置的基础上，更愿意在运动跑台上行走。如图1所述的这些程序是在一项针对BNF大鼠的预实验研究后引入的，此前在Sprague Dawley大鼠中进行的强制运动方案中有50%的受试动物表现出不依从。在该强制运动方案中，18月龄的Sprague Dawley大鼠作为实验对象，以最高15 m/min的速度进行每日30分钟、连续12天的运动（图2）。这些初步结果表明，一轮运动（连续12天）可能增加动物的运动活动能力（图2A），且运动对运动活动能力的影响可持续至运动结束后一周。此外，在经过一个月的静息期后，重复相同的12天运动方案，观察到运动活动能力相对于原始基线水平出现反弹性升高（图2B

讨论

有证据表明，生活方式干预策略（如运动）可能降低慢性年龄相关性疾病及其主要症状的风险，其中包括阿尔茨海默病和帕金森病（PD）等神经退行性疾病²⁰。强制性跑步机运动相较于自主性跑轮运动的优势在于，研究者可精确控制运动的频率、速率和/或强度，以及每次运动的持续时间。因此，在采用特定运动方案后，可预测或预期出现某些特定的运动后效应，例如运动能力或认知功能的提升。此外，强制性跑步机运动的研究结果向人类情况的转化具有很高的可能性。事实上，近期针对帕金森病患者的研究表明，当患者遵从教练在双人自行车上设定的运动方案进行锻炼时，其运动功能评分的改善程度显著优于仅按自身节奏锻炼的帕金森病患者⁴。

神经退行性疾病的发病率随着衰老显著增加。因此，在设计旨在将潜在研究结果转化为人类疾病状况的研究时，年龄是一个重要的考虑因素。例如，利用青少年或成年动物模型研究神经退行性疾病时，并未考虑到衰老是此类疾病的神经生物学基础。这可能导致在临床转化任何可观测效应时产生混淆，因为这类研究未充分纳入年龄这一生理因素。因此，在研究运动对运动功能或认知表现的影响时，应考虑使用老龄动物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠用 Exer-4 跑台	Columbus Instruments	96157-2	Columbus 提供多种适用于动物的跑台，具有不同数量的跑道及其他可选功能，例如代谢参数测量
动物活动监测仪：Opto-Varimex 4-Auto Track	Columbus Instruments	0170-R4	Columbus 提供多种活动室选项，具有不同大小的活动区域、光束间距和传感器配置