小鼠角膜移植：研究最常见实体器官移植形式的模型

摘要

小鼠已被用作研究多种移植形式的模型，包括角膜移植。本文报道了一种用于急性期和远期角膜移植研究的小鼠模型。

摘要

角膜移植是美国最常见的器官移植形式，每年进行的手术数量在45,000至55,000例之间。目前已有多种该手术的动物模型，其中小鼠是最常使用的物种。选择小鼠的原因包括使用该物种的相对成本较低、存在大量基因型明确的品系可用于研究免疫反应，以及有丰富的试剂可用于进一步界定该物种中的免疫应答。该模型已被用于确定角膜中导致该组织具有相对免疫豁免状态的因素，从而使角膜同种异体移植物在不使用免疫抑制治疗的情况下能够避免急性排斥反应。该模型还被用于鉴定在同种异体移植物排斥反应中起关键作用的因素。因此，目前我们对角膜同种异体移植物接受与排斥机制的大部分认识，均源于采用小鼠角膜移植模型的研究。除了描述急性角膜同种异体移植物排斥反应模型外，我们还首次提出了一种晚期角膜同种异体移植物排斥反应模型。

引言

角膜移植是人类实施的最成功且最常见的移植类型之一。实施该手术的原因包括外伤、感染性疾病¹或其他形式的非感染性角膜疾病²。美国眼库协会的数据显示，2011年实施的角膜移植手术超过46,000例（参见网站：restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html）。其成功的一个指标是，同种异体角膜移植物的一年失败率在10%至15%之间，而五年成功率超过70%^3-8。大量研究表明，角膜同种移植物的成功直接与眼部具有免疫豁免地位这一事实相关。角膜具有免疫豁免地位的因素包括角膜中缺乏血管和淋巴管、抗原呈递细胞相对缺失、角膜产生的抑制免疫效应功能的因子^9-15、主要组织相容性复合物（MHC）抗原表达水平较低¹⁶，以及Fas配体（FasL）的表达^17-20。

然而，尽管存在这些有利于移植成功的因素，这些移植物仍会发生排斥反应^3-7。因此，阐明介导这种排斥反应的机制，并测试各种预防排斥的治疗方法，具有极其重要的意义。为此，本文介绍了一种已使用超过20年的鼠类角膜移植模型，用于在可控的实验环境中研究角膜移植。由于移植反应涉及多种不同因素的协同作用，最终决定移植组织的成功或失败，因此无法通过任何体外（in vitro）模型来充分理解这些因素的作用。因此，必须利用完整的动物模型来确定哪些因素对移植组织的....

方案

注意：本实验所使用的所有动物均依照眼科与视觉研究中动物使用声明（由视力研究协会制定）以及圣路易斯大学动物监管委员会制定的指南进行处理。
注意：所有手术器械和溶液在手术前均已灭菌，以减少眼部微生物感染的风险。 需要指出的是，尽管动物在该操作过程中会经历一定程度的疼痛，但我们并未使用镇痛剂。 原因是所有镇痛剂均具有抗炎作用，而角膜移植反应涉及炎症过程，使用抗炎药物将影响我们对角膜移植物失败相关因素的判断。

1. 麻醉

1. 通过腹腔注射氯胺酮（86.98 mg/kg）和赛拉嗪（13.04 mg/kg），使供体和受体小鼠进入全身麻醉状态。
2. 在整个手术过程中保持受体小鼠处于麻醉状态，手术通常持续30分钟至1小时。因此，需持续监测小鼠是否出现恢复意识的迹象。
3. 动物麻醉后，向不进行手术的一侧眼睛涂抹Puralube眼膏，以防止角膜干燥。

2. 角膜移植

1. 获取供体角膜片。
   1. 动物完全麻醉后，滴入几滴1%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素眼药水，以实现充分的散瞳。
   2. 将供体动物的头部水平固定在置于稳固可移动支架上的板上，用一条胶带穿过颈部固定头部，确保在整个操作过....

结果

角膜移植的小鼠模型已被成功用于研究角膜同种异体移植物排斥^19-23和角膜同种异体移植物接受^{13,15,16,18, 24-27}的机制，应用历史已超过20年。该模型曾用于确立FasL表达在角膜同种异体移植物接受中的重要性，缺乏FasL的动物无法接受角膜同种异体移植物¹⁵。该模型还被用于证明，血管内皮生长因子受体1的吗啉代（morpholino）处理可显著提高角膜移植物的存活率²⁸。在最近的一篇报道中，该模型被用于检测小鼠在角膜移植前使用皮质类固醇预处理是否具有治疗益处²⁹。作者发现此类预处理确实可提高角膜同种异体移植物的存活率²⁹。这些研究明确表明，该模型的主要优势在于可在活体动物中研究那些被认为对人类角膜移植成功至关重要的因素。

本实验室先前的研究报道，角膜同种异体移植物排斥的主要机制之一是针对角膜移植物所表达的特异性同种异体抗原而建立的全身性迟发型超敏反应（DTH）^19,20.......

讨论

本文所述的小鼠角膜移植模型使研究者能够在预测与角膜同种异体移植物排斥^{15,17,18,20,26-30}和接受^21-25最相关因素方面，开展具有预测价值的研究。与人类角膜移植不同，在人类角膜移植中，患者通常接受局部或全身性皮质类固醇治疗以治疗或预防排斥反应³¹，而该模型通常用于确定在无此类治疗情况下与同种异体移植物排斥相关的因素。除了急性角膜同种异体移植物排斥模型（通常发生在移植后30至40天内）外，我们还提供一种晚期排斥模型，该模型在小鼠移植后45 天发生，模拟了晚期和慢性排斥反应的多种特征^32,33，而此类特征迄今为止在动物模型中尚未得到成功复制。

该模型的优势在于，可以剖析导致角膜异体移植接受率相对较高的各种机制，同时也能确定哪些机制是导致角膜异体移植失败的主要原因。该模型还允许在具有与人类免疫系统非常相似的免疫系统的动物体内测试多种治疗策略。此外，由于存在大量可与小鼠因子发生反应的试剂，以及转基因和基因靶向小鼠品系，使得能够评估的影响因素远多于其他物种。这种能够评估众多与角膜异体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔡司手术显微镜	Zeiss	翻新
1 ml 注射器	BD	305122
3 ml 注射器	BD	309657
10 ml 注射器	BD	309602
Vannus 剪刀	Stortz	E-3387
11-0 缝合线	Alcon	717939M
2.0 mm 角膜环钻	Katena	K 2-7520
1.5 mm 角膜环钻	Katena	K 2-7510
0.5% 盐酸三卡因	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
镊子	FST	11251-20
7-0 缝合线	Alcon	8065
2.5% 盐酸去氧肾上腺素	Alcon	NDC 61314-342-02
1% 托吡卡胺	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton 注射器	Hamilton	7654-01
33 号针头	Hamilton	90033
细胞筛（100 μm 尼龙）	BD Falcon	352360
血细胞计数板	Cardinal Health	B3175
台盼蓝	Sigma	T8154