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方法文章

小鼠角膜移植：研究最常见实体器官移植形式的模型

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DOI：

10.3791/51830

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2014年11月17日

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saint Louis University

本文内容

摘要

小鼠已被用作研究多种移植形式的模型，包括角膜移植。本文报道了一种用于急性期和远期角膜移植研究的小鼠模型。

摘要

角膜移植是美国最常见的器官移植形式，每年进行的手术数量在45,000至55,000例之间。目前已有多种该手术的动物模型，其中小鼠是最常使用的物种。选择小鼠的原因包括使用该物种的相对成本较低、存在大量基因型明确的品系可用于研究免疫反应，以及有丰富的试剂可用于进一步界定该物种中的免疫应答。该模型已被用于确定角膜中导致该组织具有相对免疫豁免状态的因素，从而使角膜同种异体移植物在不使用免疫抑制治疗的情况下能够避免急性排斥反应。该模型还被用于鉴定在同种异体移植物排斥反应中起关键作用的因素。因此，目前我们对角膜同种异体移植物接受与排斥机制的大部分认识，均源于采用小鼠角膜移植模型的研究。除了描述急性角膜同种异体移植物排斥反应模型外，我们还首次提出了一种晚期角膜同种异体移植物排斥反应模型。

引言

角膜移植是人类实施的最成功且最常见的移植类型之一。实施该手术的原因包括外伤、感染性疾病1或其他形式的非感染性角膜疾病2。美国眼库协会的数据显示，2011年实施的角膜移植手术超过46,000例（参见网站：restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html）。其成功的一个指标是，同种异体角膜移植物的一年失败率在10%至15%之间，而五年成功率超过70%3-8。大量研究表明，角膜同种移植物的成功直接与眼部具有免疫豁免地位这一事实相关。角膜具有免疫豁免地位的因素包括角膜中缺乏血管和淋巴管、抗原呈递细胞相对缺失、角膜产生的抑制免疫效应功能的因子9-15、主要组织相容性复合物（MHC）抗原表达水平较低16，以及Fas配体（FasL）的表达17-20。

然而，尽管存在这些有利于移植成功的因素，这些移植物仍会发生排斥反应3-7。因此，阐明介导这种排斥反应的机制，并测试各种预防排斥的治疗方法，具有极其重要的意义。为此，本文介绍了一种已使用超过20年的鼠类角膜移植模型，用于在可控的实验环境中研究角膜移植。由于移植反应涉及多种不同因素的协同作用，最终决定移植组织的成功或失败，因此无法通过任何体外（in vitro）模型来充分理解这些因素的作用。因此，必须利用完整的动物模型来确定哪些因素对移植组织的成功或失败具有重要意义。

尽管其他动物物种已被用于角膜移植研究，但与使用其他物种相比，小鼠模型具有多项优势。首先，存在多种小鼠品系，它们表达特定的转基因，或经过基因靶向处理而缺失某些免疫因子的表达，从而可更深入地研究这些因子在移植过程中的功能。此外，目前有大量针对小鼠的试剂（包括重组因子和可中和因子的抗体），而这些试剂在许多其他动物物种中并不存在。由于上述因素的存在，该模型已被广泛用于鉴定参与急性角膜同种异体移植物反应的相关因子15,17,18,20-29。此外，已知参与角膜移植的许多因子在其他组织移植中也具有功能。

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方案

注意：本实验所使用的所有动物均依照眼科与视觉研究中动物使用声明（由视力研究协会制定）以及圣路易斯大学动物监管委员会制定的指南进行处理。
注意：所有手术器械和溶液在手术前均已灭菌，以减少眼部微生物感染的风险。 需要指出的是，尽管动物在该操作过程中会经历一定程度的疼痛，但我们并未使用镇痛剂。 原因是所有镇痛剂均具有抗炎作用，而角膜移植反应涉及炎症过程，使用抗炎药物将影响我们对角膜移植物失败相关因素的判断。

1. 麻醉

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（86.98 mg/kg）和赛拉嗪（13.04 mg/kg），使供体和受体小鼠进入全身麻醉状态。
  2. 在整个手术过程中保持受体小鼠处于麻醉状态，手术通常持续30分钟至1小时。因此，需持续监测小鼠是否出现恢复意识的迹象。
  3. 动物麻醉后，向不进行手术的一侧眼睛涂抹Puralube眼膏，以防止角膜干燥。

2. 角膜移植

  1. 获取供体角膜片。
    1. 动物完全麻醉后，滴入几滴1%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素眼药水，以实现充分的散瞳。
    2. 将供体动物的头部水平固定在置于稳固可移动支架上的板上，用一条胶带穿过颈部固定头部，确保在整个操作过程中眼睛保持水平位置。
    3. 使用直径为2 mm的角膜刀（其刀尖已用甲基蓝染色），标记中央角膜移植物区域的轮廓。
    4. 用锋利的刀片刺入角膜，并向眼前房注射海伦（healon），以加深前房，减少对供体角膜内皮细胞及下方晶状体造成损伤的风险。 
    5. 使用Vannas剪刀切除供体移植物，并将其置于含有Hanks’平衡盐溶液的培养皿中备用。
    6. 在供体移植物被取出后，通过吸入CO2对供体小鼠实施安乐死。
  2. 准备移植物床。
    1. 对受体动物重复步骤2.1.1至2.1.2中的相同操作。
    2. 使用直径为1.5 mm的角膜刀，标记受体角膜上的移植物区域轮廓。
    3. 用锋利的刀片刺入角膜，并向眼前房注射海伦（healon），以加深前房，减少对下方晶状体造成损伤的风险。
    4. 使用Vannas剪刀将受体角膜上已标记的中央角膜片切除并丢弃。
  3. 缝合移植物。
    1. 将供体角膜覆盖于受体角膜的移植物床上。确保供体角膜下方有足够的海伦（healon），以防止供体角膜内皮细胞因直接接触晶状体而受损。
    2. 使用超细尖显微镊，将11-0尼龙缝线的第一针从供体侧进入，穿透供体组织至全层厚度的90%，再穿至受体侧，然后打结固定。
    3. 一旦角膜被固定到位，进行中位间断缝合，使角膜总共缝合8至10针，确保供体角膜与受体角膜移植物床准确对齐并牢固附着。
  4. 加深前房。
    1. 通过向眼前房注射HBSS或空气泡来加深前房，并用纤维素海绵轻轻检查角膜移植物是否漏液。
      注：如果无法重建前房，则发生白内障的概率较高，这将使后续对移植角膜的评估变得非常困难，并可能导致供体角膜内皮功能障碍，从而引起移植物失败。
  5. 最终评估。
    1. 观察眼睛，确认瞳孔呈圆形，前房深度正常。
      注：如果瞳孔不呈圆形，表明在缝合过程中虹膜受到损伤，该移植物被视为技术性失败。
    2. 在眼部涂抹抗生素软膏。可选：使用7-0丝线缝合眼睑。
    3. 观察小鼠直至其完全清醒，然后将其单独饲养，术后至少两天内不得合笼。

3. 拆线

  1. 若使用眼睑缝线，按上述方法麻醉小鼠，并在48小时时拆除眼睑缝线。
  2. 术后第7天对小鼠进行麻醉，拆除固定角膜移植物的缝线。缝线拆除且动物完全苏醒后，将其放回笼中。

4. 临床评估

  1. 检查眼睛是否存在手术并发症的迹象，包括白内障（晶状体混浊）、前房积血（前房内出血）、前房深度异常或角膜明显混浊。将出现上述并发症的动物视为“受损”个体，并通过吸入 CO2 实施安乐死。
    1. 所有检查均应在未麻醉的小鼠上进行。用一只手固定小鼠，使其保持稳定，以便另一只手可轻柔地突出眼球，从而更清晰地观察眼部结构。完成观察后，将动物放回笼中。
  2. 安排对治疗分组不知情的观察者每周 2 至 3 次评估移植角膜，以检测角膜移植物排斥反应或角膜移植物失败的迹象。可使用手术显微镜或水平裂隙灯生物显微镜进行这些观察。
    1. 使用 0 至 5 的评分标准评估每个角膜的混浊程度。评分标准定义如下：
      1. 若角膜无任何混浊迹象，则评分为 0。
      2. 若角膜仅显示轻微表层混浊，则评分为 1。
      3. 若角膜呈现轻度且较深层的混浊，但下方的瞳孔和虹膜仍可辨认，则评分为 2。
      4. 若角膜出现基质层混浊，无法清晰观察虹膜细节，仅能分辨瞳孔边缘，则评分为 3。
      5. 若角膜呈现致密的基质层混浊，且无法观察到任何下方结构，则评分为 4。
      6. 若角膜呈现完全混浊并伴有严重的基质水肿，瞳孔和虹膜完全不可见，则评分为 5。
    2. 同时使用 1 至 8 的评分标准评估每个角膜的血管浸润程度（新生血管形成）。具体方法为：将角膜分为四个相等的象限，分别评估每个象限内的血管分布情况，评分范围为 0（无血管）至 2（该象限内血管广泛增生）。将四个象限的评分相加，得出最终的新生血管化总评分。
    3. 若角膜在术后 5 周内连续两次观察评分均为 3 分，则将其归类为急性排斥。
    4. 若小鼠在术后 5 周时角膜清晰，但在移植后 >45 天出现混浊，并在连续两个时间点评分达到 3 分，则将其归类为晚期角膜同种异体移植物排斥。采用 Kaplan-Meier 生存曲线分析移植物存活率。

5. 模型的操控

  1. 从脾脏制备单细胞悬液。
    1. 为制备单细胞悬液，首先处死供体小鼠，然后取出脾脏。
    2. 将脾脏置于细胞滤器中，用3 ml注射器的活塞研磨破坏组织。
    3. 洗涤细胞，并重悬于10 ml的Hanks平衡盐溶液中。
    4. 取10 μl细胞悬液加入10 μl 0.4%台盼蓝溶液，混匀。取混合液滴加至血细胞计数板，计数中央方格内的细胞数。试管中细胞总数为：细胞计数值 × 104 × 2（台盼蓝稀释倍数）× 10（试管中液体体积，单位为ml）。
  2. 前房注射。
    1. 按前述方法麻醉小鼠。
    2. 在解剖显微镜下进行注射操作。每次前房内注射使用106个脾细胞，注射体积为0.005 ml，采用装有33 G 针头的0.25 ml微量注射器。
      注意：可通过给予动物特定试剂（作为激动剂或拮抗剂）来对模型进行其他干预，以确定某一特定因子在原位角膜异体移植术后可能发挥的作用。

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结果

角膜移植的小鼠模型已被成功用于研究角膜同种异体移植物排斥19-23和角膜同种异体移植物接受13,15,16,18, 24-27的机制，应用历史已超过20年。该模型曾用于确立FasL表达在角膜同种异体移植物接受中的重要性，缺乏FasL的动物无法接受角膜同种异体移植物15。该模型还被用于证明，血管内皮生长因子受体1的吗啉代（morpholino）处理可显著提高角膜移植物的存活率28。在最近的一篇报道中，该模型被用于检测小鼠在角膜移植前使用皮质类固醇预处理是否具有治疗益处29。作者发现此类预处理确实可提高角膜同种异体移植物的存活率29。这些研究明确表明，该模型的主要优势在于可在活体动物中研究那些被认为对人类角膜移植成功至关重要的因素。

本实验室先前的研究报道，角膜同种异体移植物排斥的主要机制之一是针对角膜移植物所表达的特异性同种异体抗原而建立的全身性迟发型超敏反应（DTH）19,20...

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讨论

本文所述的小鼠角膜移植模型使研究者能够在预测与角膜同种异体移植物排斥15,17,18,20,26-30和接受21-25最相关因素方面，开展具有预测价值的研究。与人类角膜移植不同，在人类角膜移植中，患者通常接受局部或全身性皮质类固醇治疗以治疗或预防排斥反应31，而该模型通常用于确定在无此类治疗情况下与同种异体移植物排斥相关的因素。除了急性角膜同种异体移植物排斥模型（通常发生在移植后30至40天内）外，我们还提供一种晚期排斥模型，该模型在小鼠移植后45 天发生，模拟了晚期和慢性排斥反应的多种特征32,33，而此类特征迄今为止在动物模型中尚未得到成功复制。

该模型的优势在于，可以剖析导致角膜异体移植接受率相对较高的各种机制，同时也能确定哪些机制是导致角膜异体移植失败的主要原因。该模型还允许在具有与人类免疫系统非常相似的免疫系统的动物体内测试多种治疗策略。此外，由于存在大量可与小鼠因子发生反应的试剂，以及转基因和基因靶向小鼠品系，使得能够评估的影响因素远多于其他物种。这种能够评估众多与角膜异体...

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披露

作者没有竞争性财务利益。

致谢

作者谨向众多致力于完善该技术并在本实验室及其他实验室中推动大量论文产出的研究人员表示感谢。本研究得到了美国国立卫生研究院基金项目 EY12707（PMS）以及防盲研究组织向眼科系提供的无限制性基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔡司手术显微镜Zeiss翻新
1 ml 注射器BD305122
3 ml 注射器BD309657
10 ml 注射器BD309602
Vannus 剪刀StortzE-3387
11-0 缝合线Alcon717939M
2.0 mm 角膜环钻KatenaK 2-7520
1.5 mm 角膜环钻KatenaK 2-7510
0.5% 盐酸三卡因AlconNDC 0065-0741-12
HealonAbbottHealon OVD
镊子FST11251-20
7-0 缝合线Alcon8065
2.5% 盐酸去氧肾上腺素AlconNDC 61314-342-02
1% 托吡卡胺Bausch & LombNDC-24208-585-59
Hamilton 注射器Hamilton7654-01
33 号针头Hamilton90033
细胞筛（100 μm 尼龙）BD Falcon352360
血细胞计数板Cardinal HealthB3175
台盼蓝SigmaT8154

参考文献

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