用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

摘要

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。

摘要

表达NG2的细胞（多突胶质细胞，少突胶质细胞前体细胞）是中枢神经系统中的第四类主要胶质细胞群体。在胚胎期和出生后发育过程中，这些细胞活跃增殖并生成形成髓鞘的少突胶质细胞。以往通常在原代分离培养、神经元共培养以及固定组织中对这些细胞进行研究。利用新近可用的转基因小鼠品系，可通过脑片培养系统研究前脑和小脑灰质与白质区域中少突胶质细胞谱系细胞的增殖与分化。脑片培养物取自出生早期的小鼠，可在体外培养长达1个月。在培养期间可对这些脑片进行多次成像，以研究细胞行为及其相互作用。该方法可实现对NG2细胞分裂过程及向少突胶质细胞分化各阶段的可视化观察，同时能够对不同脑区依赖性的NG2细胞和少突胶质细胞功能异质性进行详细分析。这是一种强大的技术，可在高度接近体内（in vivo）的细胞环境中，随时间推移研究影响这些细胞的内在与外在信号。

引言

中枢神经系统器官型脑片培养已被证明是在半完整系统中研究神经元和胶质细胞生物学的极为有效的手段^1–4。这类培养方法相对易于建立，同时保留了原代分离细胞培养的诸多优势，例如可调控细胞外环境，并便于进行长期重复的活细胞成像和电生理记录^5–9。此外，脑片培养能够维持组织的三维细胞结构、区域性的神经连接，且系统中存在绝大多数主要的细胞类型。这些特性使得脑片培养成为研究单个细胞行为与生理功能及其与细胞和环境相互作用的独特而便捷的系统。

NG2细胞是哺乳动物中枢神经系统中的一类胶质细胞，在胚胎期和出生后发育过程中持续增殖并生成有髓鞘的少突胶质细胞¹⁰。这类细胞已在分离的原代细胞培养体系中得到广泛研究，而近年来建立的在NG2细胞中特异性表达荧光蛋白的转基因小鼠品系，为活体命运图谱绘制以及急性脑片标本中的电生理记录提供了便利。in vivo 尽管已有这些研究，目前对NG2细胞增殖及少突胶质细胞分化的时间动态仍知之甚少。虽然分离细胞培养因其在药理学和遗传学操作上的相对便利而被广泛应用，但它并不适用于探究这些细胞在不同脑区中的功能差异，尤其是在需要维持细胞微环境背景的情况下。脑片培养则提供了一种简便的替代方法，适用于进行药理学干预，并已被用于研究少突胶质细胞的髓鞘形成^11,12、溶血卵磷脂（LPC）或抗体诱导脱髓鞘后的细胞反应^13,14，以及通过药物处理诱导再髓鞘化的过程¹⁵。

本文介绍了一种用于研究前脑和小脑来源的器官型脑片培养物中NG2细胞增殖及少突胶质细胞分化的活体成像和固定组织（或后固定）分析的方法。该方法可用于研究单个NG2细胞分裂后的细胞命运¹⁶，并揭示生长因子诱导的NG2细胞增殖在不同脑区和年龄阶段的差异¹⁷。这一相对简便的技术易于推广，有助于进一步探究调控这些胶质细胞生理功能的细胞内在机制和/或微环境因素，以及它们对神经元活动或髓鞘损伤的响应。

方案

注意：所有动物实验操作均遵循相关指南，并已获得康涅狄格大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：在这些实验中，分别使用了组成型 NG2cre¹⁸（JAX#008533）和诱导型 NG2creER¹⁶（JAX#008538）转基因小鼠，与 Z/EG¹⁹（JAX#003920）或 gtRosa26:YFP 报告基因小鼠²⁰（JAX#006148）杂交，以成像 NG2 细胞及其子代。为成像成熟的少突胶质细胞，使用了 PLPDsRed 转基因小鼠²¹。为保证一致的存活率，可从出生后第 10 天以内的小鼠前脑和小脑中分离脑片。

1. 切片制备

1. 在超净工作台中，将组织培养小室放入六孔板，并加入 1 ml 切片培养基（配方见试剂部分）。在解剖前至少 2 小时，将六孔板置于 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中。
2. 用 70% 乙醇对所有工具和组织切片机进行灭菌。
3. 将解剖缓冲液（配方见试剂部分）在冰上用 95%  O₂ 和 5% CO₂ 气体饱和至少 15 分钟 ，解剖开始前完成此步骤。
4. 根据批准的动物实验方案，将幼鼠置于冰上麻醉 5–10 分钟。通过轻捏尾部和脚趾确认动物无反应，以判断麻醉深度是否合适。
5. 按照动物实验规程，使用锋利的剪刀将动物断头。使用已灭菌的工具，先做矢状切口，再做侧向切口，迅速移除覆盖前脑和小脑的颅骨。通过轻轻将脑组织侧向翻转，小心切断脑干腹侧的颅神经。
6. 将组织放入含有冰冻且充氧的无菌解剖缓冲液的 35 mm 培养皿中。
7. 使用剃须刀片将小脑和前脑分离，然后沿中线做矢状切口，将左右半球分开。
8. 使用手动组织切片机切割前脑和小脑的 300 μm 厚的冠状面或矢状面切片。注：手动组织切片机可在无需琼脂糖包埋的情况下，实现从解剖到培养孵育的快速处理。也可使用振动切片机，方法如前所述⁹。
9. 将分离的脑片转移至盛有新近充氧的冷解剖缓冲液（置于冰上）的培养皿中。
10. 使用小型解剖铲或称量铲分离单个脑片，并将其转移至预先孵育的含组织培养小室的六孔板中。
11. 使用一次性移液管或 P200 移液器吸头，吸除培养小室表面多余的解剖缓冲液。每个培养小室可放置 2–3 个前脑切片或 3 个小脑切片。
    注：为了获得稳定的前脑培养结果，建议选取跨越胼胝体前三分之一区域的切片（图 1A），以便在同一脑片中同时研究灰质和白质区域。每只动物通常可获得 6 个前脑切片和 6 个小脑切片。
12. 将六孔板放入孵箱中培养，并在脑片制备后的第 1 天更换 1 ml 新鲜切片培养基，之后每隔一天更换一次，直至脑片固定。
13. 根据实验需要，在培养 5–7 天后使用脑片。仅使用在培养最初几天内变得透明的脑片，弃用存在不均匀浑浊区域的脑片。注：脑片内的浑浊区域肉眼可见，在相差显微镜下表现为成团的暗色细胞。当技术熟练后，死亡或浑浊的脑片发生率极低，通常少于 1–5%。

2. NG2细胞分裂和少突胶质细胞分化的延时成像

注意：为了对NG2细胞的增殖和分化进行延时成像，我们使用NG2cre:ZEG小鼠¹⁶，该小鼠在NG2细胞及其子代细胞中表达EGFP（图1C-E）。该品系中的报告基因表达足够强，可在脑片切片后立即进行活体成像，并在至少四周的时间内持续观察到GFP+细胞。在培养的最初3-5天，脑片经历一个初始变薄阶段，此后可获得最清晰的图像。

1. 整个实验过程中，将脑片置于37 °C的细胞培养孵育箱中，仅在短暂时间内（每片少于15分钟）取出，成像时保持六孔板的盖子盖好。
2. 使用配备数字相机的倒置荧光显微镜，采用10倍物镜在第一个时间点采集图像。注意：首个时间点根据实验设计而定，可以是脑片制备当天，也可以是之后的任意时间点。
3. 在第一个时间点，对脑片的灰质和白质区域内的多个部位进行成像。通过脑片内的特定解剖标志以及在示意图上标记图像位置来记录成像区域，以便后续成像会话时准确定位。可用的解剖标志包括脑片边缘和/或白质纤维束的走向。每个时间点在每片脑片上采集4至8个位置的图像。
4. 若研究NG2细胞分裂及少突胶质细胞分化，则后续图像采集间隔为4–6小时，理想情况下持续5–7天。
5. 在最后时间点对所有区域进行最终成像，随后立即固定脑片。向培养插件底部加入1 ml固定液（含0.1 M L-赖氨酸和0.01 M偏亚硫酸氢钠的4%多聚甲醛），再在脑片上方加入1 ml固定液。注意避免将固定液直接喷洒在脑片上，以防脑片从膜上脱落。固定组织30分钟 ，然后按照第4节所述方法，使用发育阶段特异性标记物进行免疫组织化学染色。
6. 用0.2 M磷酸钠缓冲液清洗脑片，每次10分钟，共洗3次。如有必要，可在免疫染色前将脑片在4 °C的0.2 M磷酸钠缓冲液中保存1–3天，但最好在24小时内完成染色。随后按照下文第4节所述方法进行免疫组织化学染色，以确定分化为少突胶质细胞的细胞比例（图2D–F）。

3. 利用可诱导型报告转基因小鼠在脑片培养中对NG2细胞子代进行命运图谱分析

注意：为了追踪培养过程中某一特定时间点 NG2 细胞的命运，可使用可诱导型 NG2creER:YFP 转基因小鼠。

1. 通过向培养基中添加溶于乙醇的100 nM 4OHT，诱导Cre重组及报告基因表达。注意：报告基因阳性细胞应在1-2天内出现，诱导效率约为20-25% YFP+NG2+/NG2+细胞；在此时间点，所有阳性细胞均处于NG2细胞阶段（图2A-C）
2. 在不同时间点对经过各种处理（见2.5和2.6节）的脑片进行固定和洗涤。

4. 切片免疫组织化学

1. 使用手术刀将带有切片的膜从插入物中切割下来。
2. 用镊子将切片转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板的各个孔中，注意在夹取膜时避免破坏切片结构。
3. 将切片转移至含有封闭液（含5%正常山羊血清（NGS）和0.1% Triton-X100的PBS）的24孔板中，室温孵育1小时。
4. 在4 °C条件下，将切片与一抗在含5% NGS的PBS中孵育过夜。为鉴定处于NG2细胞阶段的细胞，使用针对NG2和PDGFRα的抗体；为鉴定已分化的少突胶质细胞，使用针对腺瘤性息肉病蛋白抗原（APC；克隆CC1）的抗体。
5. 第二天，用PBS清洗切片，每次15分钟，共洗3次；然后在室温下将切片与含5% NGS的PBS中的二抗孵育1小时。再次用PBS清洗切片，每次15分钟，共洗3次，随后将切片转移到载玻片上。放置时切片朝上，膜面朝向载玻片，以确保膜不会位于物镜与组织之间。

结果

以下展示了使用P8阶段NG2cre:ZEG、NG2creER:YFP和PLPDsRed转基因小鼠品系的前脑和小脑脑片培养所获得的代表性数据。NG2细胞可在前脑和小脑脑片中进行数天的活体成像（图1B-D，视频1），并在固定后通过NG2和CC1抗体免疫染色确定这些细胞的表型（图1E）。除了活体成像外，还可通过针对细胞增殖标志物（如Ki67）的免疫组织化学染色来评估细胞增殖情况（图1F）。这些数据可在单细胞水平上对NG2细胞分裂后少突胶质细胞分化的时间动态进行详细分析。在NG2creER:YFP小鼠脑片中加入4OHT诱导cre重组后，可对NG2细胞进行命运图谱追踪（图2）。在向培养基中添加4OHT两天后，培养物中即可检测到表达YFP报告基因的NG2+细胞（图2A）。4OHT诱导六天后，部分YFP+细胞已分化为CC1+少突胶质细胞（图2B）。这些结果表明，在脑片培养体系中可对NG2细胞进行命运图谱追踪，并可通过调控细胞外环境，研究药理学试剂或各...

讨论

中枢神经系统中的髓鞘形成对高效的神经元通讯和轴突存活至关重要²²。NG2细胞在整个成年期持续生成可形成髓鞘的少突胶质细胞，同时在大多数脑区维持一个稳定的细胞群体^16,23–25。尽管已有研究描述了一些调控这些细胞分化的遗传和分子机制，但仍有许多未知有待探索。由于脑片培养体系能够保持解剖区域的完整性、便于操控细胞外环境、具有较强的髓鞘形成能力，并包含所有主要的细胞类型，因此成为研究这些机制的便捷工具。这些特性有助于研究NG2细胞、少突胶质细胞与轴突之间短期和长期的相互作用^11,26。此外，细胞移植在该体系中较易操作，可用于研究不同脑区对细胞行为的区域依赖性差异¹⁷。同时，可通过向培养基中添加药理学试剂，研究影响NG2细胞增殖和/或分化的分子机制，适用于正常^17,27,28及脱髓鞘培养模型^15,29。最后，利用脑片培养体系在技术上可行地开展高通量化合物筛选，以鉴定能够促进NG2细胞增殖或分化的分子，甚至可在脱髓鞘损伤后进行此类筛选³⁰。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
切片培养基
最低必需培养基	Invitrogen	11090	50%
Hank’s 平衡盐溶液	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030	1mM
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
马血清	Hyclone	SH30074.03	25%
用 NaOH 调节至 pH 7.22，使用瓶顶滤器过滤，并在 4 摄氏度下保存
解剖缓冲液
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4（无水）	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
腺苷	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
使用瓶顶滤器过滤，并在 4 摄氏度下保存，使用前用 95%O2 和 5%CO2 气体混合物充氧
其他试剂与耗材
4-羟基他莫昔芬（4OHT）	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
多聚甲醛（PFA）	EM Sciences	19200	4%
L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
偏高碘酸钠	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
兔抗 NG2 抗体	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
小鼠抗 CC1 抗体	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
小鼠抗 Ki67 抗体	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
小鼠抗 NeuN 抗体	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
种属特异性二抗	Jackson Immunoresearch
正常山羊血清（NGS）			5%
吐温 X-100			0.10%
含 DAPI 的封片剂	Vector Labs	H-1200
Millicell 培养膜插件，孔径 0.45μm	Fisher Scientific	PICM03050
瓶顶滤器	Fisher Scientific	09-740-25E
乙醇
95% O2 与 5% CO2 气体混合物
磷酸盐缓冲液（PBS）
无菌六孔板
解剖（海马）或称量用刮勺
手动或自动组织切片机
刀片
一次性移液管
35 mm 和 60 mm 无菌培养皿
体视显微镜
倒置相差显微镜
层流罩
组织培养箱
倒置荧光显微镜