为了全面探索O-连接聚糖的多样性，采用了一种新的凝胶内还原性β-消除方法，结合完全甲基化和快速相分离技术，直接从SDS-PAGE分离的糖蛋白中释放O-连接聚糖，并适用于后续通过质谱进行的糖组学分析。
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本文内容
摘要
摘要
通过SDS-PAGE分离蛋白质，随后对分离的蛋白条带进行凝胶内蛋白酶消化，已实现对生物样品的高分辨率蛋白质组学分析。类似的方法若用于深入分析经SDS-PAGE分离的糖蛋白所携带的糖链，则在使用质谱（MS）作为检测手段时，需特别考虑以最大化回收率和检测灵敏度。获得高质量数据的主要障碍之一是去除干扰质谱分析的凝胶来源污染物。本文所介绍的样品处理流程具有良好的稳健性和高效性，且无需在质谱分析前进行在线HPLC纯化。含有目标蛋白质的凝胶小块通过乙腈、水和乙酸乙酯洗涤，以去除包括聚合丙烯酰胺片段在内的污染物。O-连接糖链通过凝胶内还原性β-消除法从目标蛋白上释放，并通过高效、简便的纯化步骤进行回收。该流程的一个优势在于提高了对硫酸化糖链的检测与表征的灵敏度。这些操作可在质谱分析前通过快速相分离，有效分离硫酸化全甲基化糖链与非硫酸化（唾液酸化和中性）全甲基化糖链，从而增强对经SDS-PAGE分离的糖蛋白进行糖组学和硫酸化糖组学分析的能力。
引言
糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与生物体生理功能、组织病理过程以及细胞识别1-3。尽管糖科学分析技术取得了重大进展，但对特定蛋白质上完整糖链多样性的表征仍是一项极具挑战性的任务，尤其是从原始生物来源中分离的蛋白质。然而，糖蛋白糖链的微不均一性常常会影响其与其他蛋白质的功能性相互作用。因此，对糖链多样性的表征对于理解细胞和组织糖基化的生理意义至关重要4,5。为了阐明糖蛋白糖基化在组织生理与病理生理中的作用，稳健、灵敏且全面的糖组学分析技术变得日益重要。在蛋白质组学分析中，通常通过LC-MS/MS对胰蛋白酶消化产生的肽段进行分析来实现蛋白质鉴定6。蛋白质消化可使用纯化后的蛋白质进行，也可对经SDS-PAGE分离的蛋白质进行胶内酶解，常用的蛋白酶包括胰蛋白酶7-9。通过SDS-PAGE对蛋白质混合物进行预富集，可提高蛋白质鉴定的深度与准确性。开发适用于糖蛋白糖基化分析的类似策略，正处于糖科学研究的前沿。
糖链的两大主要类别通过N-连接或O-连接方式附着于蛋白质骨架上。N-连接糖链连接在天冬酰胺（Asn）残基上，该残基是Asn-X-Ser/Thr/Cys序列基序（其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸）的一部分，可通过肽-N-糖苷酶（PNGaseF或A）在溶液中、凝胶内或印迹上进行酶解释放10-12。O-连接糖链主要连接在丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基....
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方案
注意：实验室安全事项
遵循标准的实验室最佳实践，需注意以下事项。将所有有机溶剂存放在合适的场所。所有废弃材料应置于带有明确化学成分标签的化学废液容器中。由于本实验方案中使用的多种试剂可能具有致癌性或会产生易燃挥发性气体，因此所有试剂操作均应在通风良好的通风橱内进行。在使用有机溶剂时，应佩戴个人防护装备，如手套、实验服和护目用具。
图1. 凝胶内O-糖组学操作流程。（A）目标蛋白质通过SDS-PAGE分离，经适当染色方法（考马斯亮蓝或银染）检测后切取。将切下的凝胶条块切成小块，脱色，并用乙酸乙酯洗涤以去除可能干扰后续质谱分析的杂质。部分凝胶条块可保留用于凝胶内胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS进行后续蛋白质组学表征。（B）通过凝胶内还原性β....
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结果
凝胶内还原性β-消除前乙酸乙酯处理的影响
通过凝胶内还原性β-消除法从牛黏蛋白中释放的O-连接聚糖样品的甲基化衍生物的代表性质谱图如图3所示。使用乙酸乙酯洗涤凝胶碎片可有效去除十二烷基硫酸钠（SDS）和聚丙烯酰胺类污染物，这些杂质会干扰后续的质谱分析27。
图 3. 在凝胶内还原性 β-消除反应前，用乙酸乙酯洗涤聚丙烯酰胺凝胶小块可增强释放聚糖的检测灵敏度。（A）未用乙酸乙酯洗涤时，通过凝胶内 β-消除法从牛颌下腺.......
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讨论
将凝胶内还原性β-消除反应与水-有机相萃取相结合，可显著提高从小量黏蛋白型糖蛋白中分离得到的硫酸化及非硫酸化O-连接糖链进行结构表征时所获取数据的灵敏度和深度，这些糖蛋白通过SDS-PAGE与其他蛋白质分离。本研究中所提出技术方法的关键改进在于：（a）通过简单的洗涤步骤即可有效去除凝胶来源的污染物；（b）在快速的水-二氯甲烷（DCM）相分离后，可实现硫酸化糖链完全甲基化产物在水相中的定量回收。本文所述工作流程显著提升了对生物样品中生理表达水平糖蛋白所释放的硫酸化与非硫酸化糖链进行检测的灵敏度。
尽管此处所述方法在严格遵循标准分析实践时具有良好的稳健性和高度可重复性，但仍需简要提及一些可能的污染来源。确保所有玻璃器皿极为洁净，且无灰尘和洗涤剂残留，这一点至关重要。当在质谱（MS）图谱中观察到污染物峰时，应彻底清洗所有玻璃器皿，并在最终干燥前用甲醇（MeOH）冲洗。另一污染来源是使用橡胶衬垫的螺旋盖，而非聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖。由于橡胶衬垫缺乏对有机化学品的耐受性，会导致样品被干扰性的聚合物化合物污染。尽管本方案专门设计用于在离子阱质谱仪上通过纳升电喷雾电离质谱（NSI-MS）进.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究工作得到了美国国立心肺血液研究所/国立卫生研究院（NHLBI/NIH）基金项目P01HL107151的资助。作者还衷心感谢美国国立普通医学科学研究所/国立卫生研究院（NIGMS/NIH）基金项目P41GM103490所提供的仪器设备支持与使用权限。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水，去离子水 | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV，用于高效液相色谱 |
| 冰醋酸 | Fisher | A38-500 | 经认证的ACS级，≥99.7% w/w |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV，用于高效液相色谱，≥99.9% |
| 碳酸氢铵 | Fluka | 09830-500G | BioUltra，≥99.5% (T)，步骤1 |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus，用于高效液相色谱，≥99.9%，步骤1 |
| 乙酸乙酯 | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV，步骤1 |
| 硼氢化钠 | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus，99%，步骤2 |
| 碘甲烷 | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus，99.5%， 步骤6。 使用前于4 °C保存。 使用前置于室温下平衡。 |
| 氢氧化钠溶液，50% w/w | Fisher | SS254-1 | 经认证，步骤6 |
| 无水二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 276855-1L | 无水，≥99.9%，步骤6 |
| 无水甲醇 | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | 无水，99.8%，步骤6 |
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®，用于高效液相色谱，≥99.8%，含戊烯作为稳定剂，步骤7 |
| Dowex 50WX8 氢型 100-200 目 | Sigma-Aldrich | 217506-500G | 步骤3 |
| AG 50W-X8 树脂 | Bio-Rad | 142-1441 | 步骤3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg 固相萃取柱，聚丙烯，十八烷基（C18）反相 | JT Baker | JT-7020-01 | 步骤5和8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX 预制胶 | Bio-Rad | 步骤1 | |
| Bio-Safe 考马斯亮蓝染色液 | Bio-Rad | 161-0786 | G-250，步骤1 |
| 用于质谱分析的银染试剂盒 | Pierce | 24600 | 步骤1 |
| 寡糖试剂盒（麦芽三糖，Dp3: R474140） | Supelco | 47265 | |
| 寡糖试剂盒（麦芽四糖，Dp4: R474135） | Supelco | 47265 | |
| 一次性巴斯德吸管，玻璃，短头 | VWR | 14673-010 | 使用前清洗 |
| PYREX 13 x 100 mm 一次性圆底螺纹培养管 | Corning | 99447-13 | 使用前清洗 |
| PYREX 16 x 125 mm 一次性圆底螺纹培养管 | Corning | 99447-16 | 使用前清洗 |
| 带聚四氟乙烯覆面橡胶衬垫的酚醛盖帽/密封盖 | Kimble | 45066C-13 | 使用前清洗 |
| 带聚四氟乙烯覆面橡胶衬垫的酚醛盖帽/密封盖 | Kimble | 45066C-15 | 使用前清洗 |
| Hamilton 高效液相色谱注射器 | HAMILTON | 81265 | 容积 500 μl，针头规格 22 G |
| Hamilton 高效液相色谱注射器 | HAMILTON | 81165 | 容积 250 μl，针头规格 22 G |
| Hamilton 高效液相色谱注射器 | HAMILTON | 81065 | 容积 100 μl，针头规格 22s G |
| Hamilton 高效液相色谱注射器 | HAMILTON | 80965 | 容积 50 μl，针头规格 22s G |
| Hamilton 校准注射器 | HAMILTON | 80300 | 容积 10 μl，针头规格 26s G |
| 玻璃培养皿 100 mm x 15 mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | 使用前清洗，步骤1 |
| Bard-Parker 外科刀片 | Fisher | 371310 | 步骤1 |
| Reacti-Therm 加热/搅拌模块 | Pierce | 18870 | 步骤1、4和7 |
| 加热块 | Fisher | 125D | 步骤2 |
| Pyrex 玻璃纤维棉，硼硅酸盐，孔径 8 μm | Aldrich | CLS3950 | 步骤3 |
| 熔融石英切割器，管路切割器 | alltech | 3194 | 步骤3 |
| 多管涡旋振荡器 | VWR | 444-7063 | 步骤6 |
| 冻干机 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| 离心机 | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
参考文献
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeye....
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重印与许可
