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结合母细胞磁性分选与波动试验分析有丝分裂细胞衰老过程中 Saccharomyces cerevisiae 的基因组不稳定性

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DOI：

10.3791/51850

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2014年10月16日

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1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

本文内容

摘要

通过波动试验测定年轻Saccharomyces cerevisiae细胞的突变率，用于预测不同复制年龄的母细胞的突变频率。随后利用磁性分选和流式细胞术测量母细胞的实际突变频率及其年龄，以识别与预测突变频率之间的任何偏差。

摘要

Saccharomyces cerevisiae 一直是研究基因组不稳定性机制及其后果的优良模型系统。从该酵母模型中获得的信息适用于包括人类在内的多种生物，因为DNA修复和DNA损伤应答因子在不同物种间高度保守。然而，由于技术限制，目前尚未充分利用 S. cerevisiae 来全面探究突变累积速率是否会随着复制性（有丝分裂）年龄的增加而发生变化。例如，通过显微操作测量酵母复制性寿命的方法仅涉及极少量的细胞群体，因而无法检测到稀有突变。已有遗传学方法通过诱导子代细胞死亡来富集群体中的母细胞，但群体规模仍受限于随机突变干扰筛选系统的发生频率。本实验方案利用磁性分选技术对表面标记的酵母母细胞进行分离，从而获得足够数量的老化母细胞群体，以便通过表型筛选来定量稀有突变。首先通过波动试验测定年轻细胞的突变率和突变频率，并据此预测不同复制年龄母细胞中的突变频率。随后测定分选后母细胞的突变频率，并通过流式细胞术检测细胞分裂过程中在细胞表面形成的芽痕——使用可特异性识别芽痕的荧光试剂染色——以确定母细胞的年龄。将基于细胞分裂次数所预测的突变频率与特定复制年龄母细胞实际观测到的突变频率进行比较，即可判断突变累积速率是否存在与年龄相关的变化。该基本方案的多种变体可用于研究特定基因功能改变或特定环境条件对突变累积的影响，进而揭示复制性衰老过程中基因组不稳定的潜在机制。

引言

微生物，例如酵母Saccharomyces cerevisiae，是研究突变率的优良模型，但这些模型尚未被充分用于研究细胞有丝分裂衰老过程中突变的积累。人们假设核基因组中突变的积累会通过导致基因功能的逐步丧失（或变异）而促进衰老1。利用微生物系统研究衰老过程中突变积累的机制及其后果，可能极大地加快对影响该过程的遗传和环境因素的鉴定，这得益于微生物简便的遗传操作系统以及易于量化稀有表型变化的优势。DNA修复因子和DNA损伤应答蛋白在多种物种间高度保守2，且已在从S. cerevisiae到哺乳动物等差异较大的生物中发现有机体衰老存在基本相似性3，因此酵母研究所得结果很可能适用于多种生物的衰老过程。

对S. cerevisiae的衰老研究利用了两种衰老模型，分别用于测量细胞的时序性衰老或复制性衰老。时序性衰老表现为由于营养耗竭而处于非分裂状态（静止期）的酵母细胞群体中活力的逐渐丧失3。时序性衰老模型已被用于证明突变会随着年龄增长而累积4，因为该模型易于获得大量细胞群体，从而可对突变细胞进行表型筛选。在此情况下，突变的累积似乎受到生长信号通路和氧化应激的影响5，而这两个因素均与多细胞真核生物衰老机制的理解相关3。复制性衰老模型则利用S. cerevisiae母细胞与子细胞之间的不对称分裂，来研究随细胞代次增加而发生的衰老过程3。酵母复制性衰老通常通过显微操作少量母细胞和子细胞群体进行测量，或更近来通过微流控装置中酵母细胞小群体的视频显微镜观察来实现6,7。由于细胞群体规模有限，除非从单个细胞获取全基因组信息或检测极高频率的遗传变化，这些方法难以适用于有丝分裂衰老过程中突变累积的研究8。单细胞全基因组测序可为研究突变累积提供大量数据集，但表型筛选系统具有重要优势，即能够测量突变率，从而有助于研究突变累积背后的机制。目前尚未见报道通过单倍体酵母菌株在复制性衰老过程中利用表型筛选来检测突变频率和突变率的研究。

突变率通常通过波动试验进行测定9。突变频率值反映的是在一个群体中携带某个基因序列突变的细胞总数，其中包括发生独立突变的细胞，以及继承了已有突变的子代细胞。相比之下，通过波动试验测得的突变率表示每一代细胞中新发生的独立突变的数量。这类试验通常包括：以较低细胞密度接种多个重复培养物，以降低目标序列中已有突变细胞被引入的可能性；将培养物生长至接近饱和状态；并通过在选择性培养基上的生长情况来鉴定突变细胞。随后，利用多个数学模型之一，根据在重复群体中鉴定出的突变细胞数量，估算在培养过程中新出现的独立突变数量9。将独立突变的数量与平均群体大小进行比较，即可得到突变率的估计值。在S. cerevisiae中，常使用URA3和CAN1基因来测定突变频率和突变率，因为这些基因的功能缺失突变会产生可筛选的表型。URA3功能的丧失使细胞对5-氟乳清酸（5-FOA）产生抗性，因为URA3基因编码的蛋白会将5-FOA转化为有毒分子10。CAN1功能的丧失则使细胞对刀豆氨酸（一种有毒的精氨酸类似物）产生抗性，因为CAN1基因编码的蛋白负责将精氨酸和刀豆氨酸转运进入细胞11。

遗传学和物理分选策略均已成功用于获得更大量的酿酒酵母（S. cerevisiae）母细胞，以促进对复制性衰老的研究。遗传学策略包括在群体中选择性地抑制子代细胞存活的巧妙方法。母细胞富集程序（MEP）通过β-雌二醇仅在子代细胞中诱导Cre重组酶的表达，导致含有loxP位点的两个必需基因发生子代特异性破坏12。MEP菌株在无诱导剂条件下可正常生长，但在诱导后仅母细胞能够继续分裂，而子代细胞通常在其第一次细胞周期进程中停滞于M期12。尽管该系统尚未广泛用于研究衰老过程中的突变累积，但它已被用于研究杂合性缺失——这是二倍体酵母菌株中一种相对频繁的基因组不稳定性形式，以及衰老母细胞中的生化变化13,14。类似地，子代阻滞系统涉及在子代细胞中特异性表达酿酒酵母的URA3基因15。子代阻滞菌株在未添加5-FOA的培养基中正常生长，一旦向培养基中加入5-FOA，表达URA3的子代细胞将死亡，而母细胞则继续生长15。这些系统可用于富集母细胞，但其有效性依赖于构成筛选系统的基因功能的维持。筛选系统中一个或多个组分发生随机突变可能导致子代细胞逃逸筛选并呈指数增殖。在MEP菌株的开发过程中，已确定合适的群体规模以避免出现可逃逸筛选的突变子代细胞12。然而，这种群体规模的限制会影响在复制性衰老过程中对罕见基因组不稳定性形式的检测。这一群体规模的限制可通过使用每个筛选相关基因均有两个拷贝的二倍体酵母菌株部分克服，因为大多数突变可能是隐性的12。然而，与单倍体酵母细胞相比，使用二倍体菌株会限制易于检测的突变事件类型。

物理分选策略包括通过分离带有标记细胞表面的母细胞与未标记的子代细胞，从而富集大量母细胞群体。已有研究发现，S. cerevisiae 子代细胞的细胞表面蛋白（细胞壁蛋白）在出芽过程中为新合成，该特性已被用于特异性地标记母细胞而不标记其产生的子代细胞16。例如，可首先对一群表面用生物素标记的酵母细胞进行培养，随后利用抗生物素磁珠和磁性分选技术将其子代细胞分离，因为由初始群体产生的子代细胞表面不含生物素16。通过连续培养与分选，可逐步获得并分析年龄逐渐增加的母细胞群体。该方法已成功用于研究酵母复制性衰老过程中细胞生理学及基因表达的变化13,14,17,18。本方法改进了上述生物素标记与磁性分选技术，用于富集母细胞，以检测可能罕见的突变积累或其他通过表型筛选评估的基因组不稳定性形式。连续培养与物理分选使得能够在年龄逐渐增加的母细胞及其子代细胞群体中分析突变的积累情况。通过测定每代的突变率，可计算出经历特定次数细胞分裂的母细胞的预期突变频率。由于预期频率值基于细胞分裂轮次增加所导致的累积增长，因此观察到的突变频率与预期值之间显著偏离，可作为突变积累速率随年龄变化的证据。利用本实验方案，可通过荧光染色标记母细胞表面对应于细胞分裂位点的芽痕，并结合流式细胞术分析，快速确定分选前后细胞群体的年龄分布。此外，也可在本方案中使用其他荧光试剂，例如用于检测活性氧的试剂。总体而言，该方案可在一种非常适合研究影响衰老相关基因组不稳定性遗传与环境因素的模式生物中，高效分析基因组不稳定性随年龄变化的特征，并具备与衰老相关的细胞生理变化进行关联分析的潜力。

方案

1. 培养基与溶液的制备

  1. 采用酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）丰富培养基进行细胞培养，作为标准操作流程。YPD 培养基的配制为：2% 胰蛋白胨、1% 酵母提取物、2% 葡萄糖溶液，若需制备固体培养基则添加 2% 琼脂19。经高压灭菌以实现无菌。如需测试特定生长条件或突变酵母菌株，可使用其他替代培养基。
  2. 制备缺乏精氨酸并含有 60 mg/L 刀豆氨酸的固体合成完全培养基（SC-arg + canavanine），用于筛选刀豆氨酸抗性突变株。配制溶液：0.67% 无氨基酸酵母氮源基础培养基、2% 葡萄糖、0.2% 无精氨酸完全补充混合物（dropout mix）以及 2% 琼脂19。高压灭菌后冷却，再加入来自 20 mg/ml 储存液（滤膜除菌，4 °C 保存）的刀豆氨酸19。
    1. 制备含有 5-氟乳清酸（5-FOA）的固体合成完全培养基。将 500 ml 溶液配制成含 1.34% 无氨基酸酵母氮源基础培养基、4% 葡萄糖、0.4% 完全补充混合物和 0.2% 5-FOA，并进行滤膜除菌19。另将 500 ml 4% 琼脂溶液高压灭菌后短暂冷却，再与上述 500 ml 滤膜除菌的营养溶液混合。针对其他突变检测实验，应使用相应的替代培养基。
  3. 用于生物素标记时，配制 500 ml 含有 137 mM 氯化钠、2.7 mM 氯化钾、10.14 mM 磷酸氢二钠和 1.77 mM 磷酸氢二钾的 1x 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 8.0。4 °C 保存，使用时置于冰上。
  4. 用无菌超纯水新鲜配制 5 mM 生物素储存液。
  5. 为终止生物素标记反应，配制 500 ml 含 1x PBS 和 100 mM 甘氨酸的淬灭缓冲液。4 °C 保存，使用时置于冰上。
  6. 根据所用细胞数量和实验持续时间，配制 1–2 L 珠标记缓冲液，含 1x PBS、2 mM EDTA 和 0.5% 牛血清白蛋白。经滤膜除菌并脱气处理。4 °C 保存，使用时置于冰上。
  7. 在 1x PBS 中配制 0.4% 台盼蓝溶液，滤膜除菌后室温避光保存，用于细胞活力测定。
  8. 将麦胚凝集素（WGA）荧光偶联物分装成小体积（约 100 µl），置于铝箔包裹（或不透光）的微量离心管中，-20 °C 保存，用于细胞年龄鉴定。

2. 突变率和突变频率的测定

  1. 在标准培养条件下，通过波动试验测定每细胞世代的基础突变率。从初始密度为 1,000–5,000 个细胞/ml 开始，培养 7 至 11 个重复的 1 ml 培养物，直至进入早期稳定期（约 108 个细胞/ml）。
    1. 对于每个重复培养物，将细胞稀释 1:2,000，取 1–4 µl 涂布于非选择性培养基（YPD）上，以测定每毫升的菌落形成单位数。将剩余细胞在微量离心机中以约 2,400 × g 离心 1 分钟，收集沉淀后重悬于 100 µl 水中，涂布于选择性培养基上以鉴定突变体。将平板在 30 °C 下培养三天后计数菌落（可根据细胞生长速率适当调整培养时间）。
    2. 根据在选择性培养基上获得的突变菌落数（r），确定试验中发生的独立突变数（m）。使用 Lea-Coulson 中位数估计法，将突变菌落的中位数代入以下公式中的 r 来计算 m9。然后代入 m 的数值，使方程左侧几乎等于零。
      方程：r/m - ln(m) - 1.24 = 0；数学公式分析。
    3. 为确定突变率，首先将各重复培养物的平均菌落形成单位数（每毫升）与涂布到选择性培养基上的培养物体积（毫升）相乘，计算涂布到选择性培养基上的平均活细胞数。将步骤 2.1.2 中得到的 m 值除以该平均活细胞数，即可获得每细胞世代的突变率。
  2. 按照步骤 2.1.3 所述方法，分别计算每次试验中每个重复培养物涂布到选择性培养基上的活细胞数。将某一培养物获得的突变菌落数（r）除以涂布到选择性培养基上的活细胞数，得到该培养物的突变频率。采用步骤 2.1 中各重复培养物突变频率的平均值或中位数作为基础突变频率。
  3. 在细胞生物素标记前后（步骤 3.2 和 3.4）分别进行频率测定，以判断标记步骤是否引起突变频率的变化，从而在检测突变累积的年龄特异性变化时予以考虑。

3. 生物素标记

  1. 从 -80 °C 的甘油菌种中挑取 S. cerevisiae 菌株，划线接种至 YPD 培养基，于 30 °C 培养 1–3 天。
  2. 使用无菌移液器吸头，从划线平板上取菌落转移至 1 ml（或更多）水中，注意划线上生长浓密部分约 1–1.5 cm 可提供约 108 个细胞。使用血细胞计数板测定准确的细胞密度。
  3. 为每种菌株（或处理条件）在每个采样时间点标记 108 个细胞，或准备足够数量的细胞群体，以确保在选择性培养基上每次取样可获得至少 5–10 个突变菌落（依据步骤 2.2 中测定的突变频率）。每种菌株/条件额外保留 108 个细胞用于基线值测定。
  4. 按照试剂生产商的标准操作进行生物素标记，但使用 5 mM 生物素试剂储备液，并在孵育过程中轻轻摇动。所有离心步骤均在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 5 分钟，因为高于 4 °C 的温度可能导致细胞损失增加。最后一次洗涤后，将细胞重悬于水中，浓度为 108 个标记细胞/ml。
  5. 使用台盼蓝染色检测细胞活力。取 10 µl 细胞悬液，加入 23 µl 水和 67 µl 的 0.4% 台盼蓝（溶于 1× PBS），混匀。室温孵育至少 40 分钟后，使用血细胞计数板计数活细胞（未染色）和死细胞（染色）。
  6. 测定基因组不稳定性、细胞年龄及其他相关特征的基线值（见第 5、6 和 7 节）。
  7. 将生物素标记的细胞按每 108 个细胞加入 20 ml YPD 培养基，置于锥形瓶中（终浓度约为 5 × 106 个细胞/ml）。在 20 °C 下培养 16–18 小时，使细胞密度达到约 108 个细胞/ml（约经历四至五个细胞世代），但避免细胞进入静止期。若需优化培养和采样时间，可在加入培养基前将生物素标记的细胞在 4 °C 保存数小时。30 °C 培养时应缩短孵育时间。

4. 磁珠标记与磁分选

  1. 生长期结束后，取部分培养物稀释，使用血细胞计数板测定细胞密度。在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液。
  2. 加入 30 ml 磁珠标记缓冲液，通过涡旋振荡重悬细胞沉淀，然后参照步骤 4.1 进行离心并弃去上清液。重复洗涤一次。
  3. 每 108 个总细胞用 50 µl 磁珠标记缓冲液充分重悬（通过涡旋振荡）。每 108 个总细胞加入 2 µl 磁珠，短暂涡旋混匀。冰上孵育 10 分钟，期间定期颠倒混匀（修改自在线方案 http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf）。
  4. 用 30 ml 磁珠标记缓冲液洗涤细胞三次。
  5. 每 108 个总细胞加入 0.5 ml 磁珠标记缓冲液，中等强度涡旋振荡至细胞完全重悬。将悬液通过 40 µm 细胞滤网转移至 50 ml 离心管中，以去除任何残留的细胞团块。如需，可在上柱前将细胞置于冰上静置 1–2 小时。
  6. 按照磁性分离柱生产商推荐的方案，进行磁珠标记母细胞的结合、洗涤和洗脱。为提高标记细胞的回收率，每 2 × 109 个总细胞至少使用一根分离柱。
    1. 上样时若出现气泡应予以去除，因其会阻碍液体流动。每次洗涤之间应取下并重新安装分离柱至磁力架上，以防止细胞被困在磁珠之间（修改自在线方案 http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf）。
    2. 如需分析母细胞产生的子代年轻细胞，可保留结合和洗涤步骤中的穿流液。按步骤 4.7 所述方法浓缩细胞。
    3. 使用多柱磁力架可同时处理多个样品。将同一样品的多个柱洗脱液收集至同一收集管中，以减少操作时间并降低细胞损失。
  7. 将洗脱得到的母细胞在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 5 分钟进行浓缩。每 108 个初始生物素标记细胞保留约 1 ml 缓冲液，其余吸除。短暂涡旋振荡，使细胞在残留缓冲液中重悬。
  8. 取部分细胞稀释后用台盼蓝染色，使用血细胞计数板测定细胞密度和细胞活力（参见步骤 3.5）。计算回收的细胞总数。
    1. 若细胞数量显著高于预期，可将洗脱样品再次通过另一根柱子，以尝试去除污染的年轻细胞。若细胞数量显著低于预期，可将之前保存的穿流液样品通过另一根柱子，以提高母细胞的回收率。
  9. 将细胞用于后续分析，具体方法见第 5 和第 6 节。或者，可将细胞再次在 YPD 液体培养基中培养以增加其复制年龄（步骤 3.7），然后进行磁珠标记与分选（步骤 4.1–4.8.1），无需重复生物素标记步骤。

5. 复制年龄的测定

  1. 本节所有步骤均在室温下以 5,000 × g 离心 2 分钟。取 25 µl 回收的细胞（约 108 个细胞/ml）加入 1.5 ml 离心管中，用 1 ml 1× PBS 洗涤两次，吸除上清液。
    1. 解冻一份 WGA-偶联物，涡旋混匀，短暂离心以去除蛋白聚集体。将细胞重悬于 180 µl 1× PBS 和 20 µl 荧光分子标记的 WGA 中，用于标记细胞表面的出芽瘢痕。用铝箔包裹 1.5 ml 离心管，在 30 °C 下轻轻振荡孵育 30 分钟。
    2. 用 1 ml 1× PBS 洗涤三次。
  2. 进行荧光显微镜观察时，按照标准流程对载玻片进行标记并封片，使用抗荧光淬灭剂。将载玻片在避光条件下完全固化（最多数天），再封固盖玻片，以避免成像过程中细胞移动。每份样品至少统计 50 个细胞的出芽瘢痕数量，以获得具有代表性的细胞年龄测量值。如需，载玻片可保存长达 1 个月用于观察出芽瘢痕。
    1. 或者，在步骤 5.1.2 之后，将细胞重悬于 1 ml 1× PBS 中，通过流式细胞术检测 WGA-偶联物的荧光信号强度。检测 WGA-Alexa 488 时使用 405 nm 激光激发，530/30 nm 发射滤光片，并配备 505 nm 长通滤光片。每次采集均需设置未染色对照。
  3. 以显微镜计数的年轻细胞和老化细胞的出芽瘢痕数为纵坐标（y 轴），以相同细胞群体 WGA-偶联物荧光信号的归一化几何均值（染色样本几何均值 / 未染色样本几何均值）为横坐标（x 轴）作图。拟合该关系的线性趋势线方程。在后续实验中，将待测细胞群体的 WGA-偶联物荧光强度归一化几何均值代入该方程的 x 值，求解 y 值，即可确定样品的平均细胞年龄。

6. 突变频率

  1. 将步骤 4.7 中用缓冲液重悬的已分选母细胞按步骤 2.1.1 所述方法分别涂布于 YPD 培养基和选择性培养基上。选择性培养基使用 1 ml 重悬的母细胞，于 5,000 × g 离心 1 分钟。
    注意：随着细胞年龄增加，为补偿老年细胞群体中活力下降及衰老细胞数量增多的情况，应将稀释后的细胞取较大体积涂布于 YPD 培养基。
    1. 将步骤 6.1 中的 YPD 培养基和平板选择性培养基分别在 30 °C 下培养 3 天和 4 天。对于非常老的细胞或生长缓慢的菌株，可将培养时间延长至一周。按步骤 2.2 所述方法计算突变频率。

7. 计算特定复制年龄下的预测突变频率

  1. 通过从相关分选的分选后母细胞的平均年龄中减去初始细胞群体的平均年龄，计算实验过程中生物素标记细胞的复制年龄平均增加值。使用步骤 5.2 或步骤 5.2.2 中计算得到的细胞年龄。
  2. 将步骤 2.1.3 中获得的突变率乘以步骤 7.1 中计算得到的平均细胞年龄增加值。将该值加至步骤 2.2 中计算得到的初始群体的基础突变频率，以确定相应复制年龄细胞的预测突变频率。

结果

流程图 图1 展示了该实验流程的整体步骤，包括突变率、突变频率和细胞年龄的测量节点。准确测定年轻细胞群体中突变的频率和速率（或其他形式的基因组不稳定性）是重要的第一步，因为这有助于选择适合的细胞群体规模用于标记和磁性分选。突变率的数值可通过波动试验（fluctuation tests）来确定。9. BY4741 遗传背景酵母菌株的示例结果20 选择用于基因突变的 CAN1 赋予鸟氨酸抗性的基因或基因突变 URA3 赋予对5-FOA抗性基因如图所示 图2细胞在以下条件下培养： 20 °C 用于代表性速率实验，以及在 20 °C 和 30 °C 用于代表性频率实验。采用这些温度是因为在初始细胞群体培养时 30 °C 随后在 20 °C 用于后续的代表性分选实验。对于某一菌株，初始细胞群体与生物素标记后细胞在独立重复实验中的速率值具有可比性。 CAN1 基因位于其在5号染色体上的正常位置，距离左臂端粒约32千碱基对（www.yeastgenome.com) (图2A，薰衣草色柱状图）。该突变率 CAN1 在第二种酵母菌株的初始群体中显著更高，该菌株具有一个基因的缺失 CAN1 基因从其在五号染色体上的正常位置缺失，并插入 CAN1 在第八号染色体右臂上，距端粒约25千碱基对处21 (图2B). CAN1 初始细胞群体与生物素标记细胞在任一生长温度下的基因突变频率也具有可比性图 2A，蓝色柱状图）。然而，在以下情况下获得的突变频率 20 °C 高于突变频率 30 °C. 为了检验这种温度效应是否仅限于 CAN1 基因，我们检测了突变 URA3 通过使用具有5-FOA抗性筛选的酵母菌株 CAN1 插入到第八号染色体上。该菌株还具有以下基因缺失： URA3 从其在五号染色体上的正常位点发生缺失及插入 URA3 位于第八号染色体右臂，距端粒约40千碱基对处21突变频率在此处也更高 20 °C 用于 URA3 在此染色体位置（图 2C总体而言，这表明生长温度会影响突变频率，但生物素标记似乎不会影响突变频率。因此，初始种群的突变率和突变频率必须在与后续增殖和分选轮次相同的生长温度下进行测定。在将该方案用于研究其他类型的突变或基因组重排之前，建议验证生物素标记是否会影响基因组稳定性。

正如预期，图2A中显示的突变率数值比相应的频率测量值低数倍。这种差异的原因在于，突变率衡量的是每轮细胞分裂过程中出现携带新突变细胞的频率，而突变频率则衡量的是在生长周期结束时群体中突变细胞的累积数量。这些实验的突变率及其95%置信区间表明，通过每次实验使用七份重复培养物，可以获得可重复的结果，这也是本方案建议的最少重复数。

在确定初始突变频率和速率值后，应选择适当的细胞群体规模，以确保经过多轮分选后仍有足够数量的细胞，从而可靠地测定突变频率。当突变频率和速率与图2A所示相近时，针对每个时间点分析衰老过程中的细胞群体，标记108个细胞是合适的。该决策还取决于每轮分选后标记的母细胞回收效率。可通过血细胞计数板快速简便地评估标记母细胞的回收效率：统计每次分选从柱子中洗脱的细胞数量，并观察细胞形态。示例性回收效率数据（图3A）说明了两个主要问题：第一轮分选后回收的细胞数量可能高于预期，且随着持续分选，细胞数量会逐渐轻微减少。某些实验中第一轮分选后细胞数量高于预期，可能是由于初始群体中部分细胞的芽体也被标记所致。在确定需用生物素标记的细胞数量时，带芽的酵母细胞通常被计为单个细胞。然而，若初始群体中的芽体也被标记，则由这些芽体发育而来的子细胞在分选过程中也会被保留在柱子上。这种情况对回收效率测定的影响取决于初始细胞群体中带芽细胞所占的比例。第一轮分选后细胞数量偏高的另一个可能原因是，此时间点较大芽体的细胞比例较高，这些细胞可能在分选过程中完成分裂。因此，仍与母细胞相连的大芽体可能被一同分选，但在洗脱后观察时则表现为独立的细胞。尽管每轮生长和分选过程中均会损失部分细胞，但本方案通常可在每轮分选后稳定保留80–90%的细胞。建议充分练习该操作流程，以确保每轮分选中至少有80%或更多的标记细胞被成功分离，从而避免因回收效率低而需要标记过大的初始细胞群体。在第一轮分选后对细胞施加轻度应激处理（YPD培养基中含1 mM过氧化氢，处理30分钟）并不会影响后续多轮生长和分选中的细胞高效回收，尽管应激处理后的首轮分选回收率存在一定波动（图3A）。

观察细胞形态和活力对于确认母细胞分离是否成功，以及调整在非选择性培养基上铺板细胞时所用的稀释倍数或体积以测定菌落形成单位密度，均具有重要意义。随着母细胞老化，其体积逐渐增大且形态变得不规则，而子代细胞则无此特征（图3B）。因此，随着每一轮分选实验的进行，母细胞样品应主要由体积较大、形态不规则的细胞组成。若存在大量形态规则的小椭圆形细胞，则可能表明母细胞与子代细胞未能充分分离。母细胞的活力也应随着每一轮生长和分选而逐渐下降，尽管在前五至十个细胞世代中变化可能不明显。由于衰老细胞的形成，能够形成菌落的细胞数量下降幅度通常远大于通过细胞完整性直接染色法测定的活细胞数量下降幅度。当直接染色法检测到的细胞活力首次开始下降（约降至80%或更低）时，可能需要提前调整用于测定菌落形成单位密度的稀释倍数和加样体积，以应对活细胞形成菌落能力的显著下降（下降幅度可达2倍甚至更高）。

在分析母细胞突变频率数据以研究突变速率随年龄变化的特征之前，需确定已分选群体和对照群体的复制年龄。这可通过人工计数母细胞上的出芽疤痕来实现。图4）或通过流式细胞术定量芽痕检测试剂的信号（图5）。使用WGA-荧光偶联物可对芽痕进行标记，且背景信号相对较低（图4C). 图 4A 表明分选过程中流穿样品的大多数细胞具有零个或一个芽痕。从柱子洗脱的细胞主要为老化母细胞（图4B 和 5）。通常， >洗脱的细胞中90%为母细胞，这一点从流式细胞术结果中可以更清楚地观察到 图5芽痕较少的细胞（<6）经过两轮以上分选后获得的细胞可能代表未被生物素标记的污染细胞，这些细胞在相应的生长轮次中经历了数次细胞分裂，而并非是分裂非常缓慢的母细胞。如果群体中并非所有细胞均以相同速率生长，则随着分选轮次的增加，细胞年龄的异质性可能会增大。

如果建立了WGA-荧光信号强度与每个细胞的出芽疤痕数量之间的线性关系，则可以更快地利用较大规模的细胞群体来评估细胞年龄。在此分析中，通过将染色细胞的信号除以相应的未染色细胞群体（子代或母代细胞）的信号，对所有WGA-荧光信号强度进行归一化处理，以校正老年细胞中背景荧光增强的影响。图4和图5展示了对同一代表性细胞群体的分析结果。人工计数确定子代细胞群体（图4A）和母代细胞群体（图4B）的平均复制年龄分别为0.95和11.4。将这两个群体以及另外三个群体（平均年龄分别为3.0、6.9和14.4）的归一化WGA信号强度，与各群体的平均出芽疤痕数进行作图（图5B）。该线性关系可在后续实验中结合相同菌株和试剂使用，通过流式细胞术获得的归一化WGA信号来确定细胞的平均年龄，从而实现对细胞年龄的快速且准确的评估。仍应包含对照群体，以验证不同实验之间的染色效率具有一致性。

在获得突变率数值、高效分选细胞以及确定细胞年龄等前期步骤完成后，便可探讨年龄对突变累积的影响。能够测定突变频率的时间点数量取决于生物素标记细胞群体的大小，以及在选择性培养基上铺板所需细胞的数量，以获得可靠的结果。如果突变率随年龄发生变化，则衰老母细胞中观察到的突变频率应不同于仅基于额外细胞分裂轮次所预期的频率。通过比较观察到的突变频率与预测的突变频率，可识别出突变累积速率中与年龄相关的变化。如方案第7节所述，预测频率可通过初始细胞群体的基础突变率与母细胞复制年龄增加倍数的乘积，再加上初始群体的突变频率来获得。在CAN1位于V号染色体正常位置的菌株中（图6A），以及在CAN1位于VIII号染色体右臂的菌株中（图6B），均观察到随着细胞平均年龄增加，CAN1突变频率上升的现象。由于图6A中母细胞的观察突变频率与预测频率相近或略低于预测值，该数据未提供突变率存在年龄特异性变化的证据。相比之下，CAN1位于VIII号染色体上的菌株其母细胞突变频率高于预测值（图6B）。请注意，图中预测频率看似增长不大，是因为观察到的突变频率大幅上升，导致y轴必须采用对数刻度。因此，图6B的结果确实提供了支持突变累积速率存在年龄特异性增加的证据。图6A与6B两组数据结果的差异很可能源于CAN1在基因组中的不同位置。这类观察结果为建立假说提供了起点，可用于研究细胞衰老过程中影响突变率的机制，并建立模型以解释随复制年龄变化的突变累积现象。

细胞衰老示意图；生物素标记、孵育、分选；突变率、频率分析。
图1. 检测酵母复制性衰老过程中突变累积的整体流程图。 黑色文字和箭头表示实验的主要步骤。弯曲箭头表示对相同细胞进行额外的再生长和分选循环，以获得年龄逐渐增加的细胞。紫色箭头和文字表示进行所述测量的步骤。Freq – 频率。

在20°C和30°C下对IP和PB样品进行实验的突变率和频率柱状图
图2. 年轻细胞群体中突变频率和突变率的测定。（A） 通过将细胞涂布于SC-arg + 刀豆氨酸培养基上筛选突变菌落，以选择CAN1基因的功能缺失型突变，并与涂布于选择性培养基上的活细胞总数进行比较，从而计算突变频率/突变率。初始群体细胞（IP，生物素标记前）或生物素标记后细胞（PB）在YPD培养基中从初始密度5,000个细胞/ml开始培养，直至接近饱和状态。浅紫色柱表示在指定温度（20 °C和30 °C）下测得的突变率，蓝色柱表示突变频率。每次实验培养七组重复培养物，并进行两到五次独立实验。图中显示了各独立实验计算出的突变率值，误差线代表使用在线计算器确定的95%置信区间22。突变频率数据以均值和标准差表示。（B） 使用第VIII号染色体右臂携带CAN1基因的菌株，按照A部分所述方法获得并表示的CAN1突变率。（C） 使用第VIII号染色体右臂携带URA3基因的菌株，在5-FOA培养基上筛选突变菌落后获得的突变频率。其余实验方法同A部分，数据为三到四次独立实验的均值及标准差。

柱状图和细胞显微镜图像；生物素标记后细胞标记分析及分选实验结果。
图3. 通过计算每轮分选后洗脱细胞数量确定的分选效率示例。(A) 每个起始细胞群体在生物素标记后的总细胞数设为1，每轮磁性细胞分选后洗脱样品中的细胞总数除以该初始值，得到标记细胞的比例。总细胞数通过血细胞计数板计数获得。橙色柱表示按照标准方案进行的三次独立实验的平均值和标准差。蓝色柱表示在第一次分选后立即用1 mM过氧化氢处理30分钟的两次独立实验的平均值和标准差。(B) 生物素标记后（标记后）以及经过三轮磁性分选后回收的母细胞（第三次分选母细胞）的细胞大小和形态，采用标准明场显微镜和20倍物镜观察。背景中的白色线条为标准血细胞计数板上可见最小方格的边界线。请点击此处查看该图的放大版本。

酵母细胞分析；出芽痕直方图（A，B）和细胞结构显微图像（C）
图 4. 通过人工计数出芽痕测定复制年龄。 采用共聚焦显微镜对经WGA-荧光偶联物标记的单个细胞上的出芽痕进行计数（激发波长488 nm，检测使用458/543 nm带通滤光片与505 nm长通滤光片组合）。（A） 经过第三轮磁性分选后流穿组细胞（子代细胞）的人工出芽痕计数（n = 62）。（B） 经过第三轮磁性分选后洗脱细胞（母细胞）的人工出芽痕计数（n = 54）。（C） 经WGA-荧光偶联物染色后，使用63倍油镜并放大3倍拍摄的第三轮磁性分选后保留的母细胞图像。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术荧光强度图，子代细胞与母代细胞；芽痕数量与WGA荧光信号关系图。
图5. 利用流式细胞术测定复制年龄。 对经WGA-荧光染料偶联物染色的10,000个细胞样本，采用488 nm激发光，并结合530/30带通滤光片和505长通滤光片组进行流式细胞术分析。(A) 直方图显示经过三轮磁性分选后，子代细胞群体或流出液（母代细胞）中具有特定WGA-荧光强度的细胞数量。这些细胞群对应于图4中分析的群体。蓝色垂直线表示子代细胞群体在母代细胞直方图中的主要位置。(B) 计算A图中各细胞群体以及另外三个细胞群体（平均年龄分别为3.0、6.9和14.4）荧光信号的归一化几何均值，该值为染色细胞群体几何均值与相应未染色细胞群体几何均值的比值。将这些数值与各总群体的平均芽痕数进行比较作图（参见图4及未显示数据）。图中给出了该比较趋势线的R2值。

突变频率与细胞年龄的柱状图，显示带有误差线的实验结果。
图6. 复制性衰老过程中预测突变频率与实际观察突变频率的比较。 突变发生在CAN1基因的细胞系如图2所述进行筛选，所用菌株中CAN1基因位于V号染色体正常位置(A)，或位于VIII号染色体右臂(B)。细胞在生物素标记前于30 °C固体培养基中培养，之后在20 °C下培养。橙色柱表示观察到的突变频率（Obs），棕色柱表示对衰老细胞预测的突变频率（Pre）。每张图中的第一列显示了四次独立实验在生物素标记后初始突变频率的均值和标准差（PB）。柱下方的数字表示各细胞群体的平均出芽痕数量（细胞年龄）。独立的预测值根据方案第7节所述方法计算，使用图2A（IP列）和2B中所示的各个初始速率值，然后对这些独立值取平均。观察值为三次实验的均值。误差线表示标准差。

讨论

本方案结合多种方法，使酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模型系统中可用的资源与技术能够高效地应用于有丝分裂细胞衰老过程中基因组不稳定性研究。通过表型筛选来量化不同类型基因组不稳定性的一系列检测方法，可与磁性分选技术结合，用于研究特定类型的突变或染色体重排在积累过程中可能存在的年龄特异性变化。尽管全基因组测序方法可提供关于基因组随年龄发生改变的整体类型更详尽的信息，但利用表型筛选系统测定突变率，并优先分离特定类型遗传改变的能力，对于研究衰老相关基因组不稳定的机制具有重要意义。简化细胞年龄的确定过程，并结合流式细胞术平行检测生理变化，为在特定年龄阶段将基因组不稳定性与其他细胞变化相关联提供了高效手段。要确定突变积累速率是否存在潜在的年龄依赖性变化，需满足以下条件：1）精确测定年轻细胞群体中的突变速率；2）准确判定细胞年龄；3）能够可靠地富集足够数量的老年母细胞群体，以便在老年阶段可重复地测量基因组不稳定性。该方法使酵母模型系统有助于揭示有丝分裂活跃细胞中基因组不稳定性速率和/或频率随年龄变化的潜在机制。此外，还可快速评估遗传与环境因素对年龄依赖性基因组不稳定性的影响。最终，这些特征分析可能推动建立解释突变在复制性衰老过程中积累模式的理论模型。

该方法依赖于通过可选择的表型出现来检测突变或其他类型的基因组不稳定性，从而测量此类事件的发生频率。然而，通过富有创造性的实验设计，可以研究基因组不稳定的多个方面。例如，可将 URA3 和 CAN1 基因置于不同的基因组位点，以检验基因组位置对结果的影响。通过特定无功能基因等位基因回复为有功能等位基因的过程，可检测特定的突变机制。此外，引入一个基因的多个失活等位基因，或在基因两侧添加重复序列，可分别用于通过基因功能的恢复或丧失来检测重组事件。波动试验（fluctuation tests）是测定这些不同类型基因组不稳定性事件发生率的标准方法9。本实验方案采用广泛接受且相对简便的Lea-Coulson中位数估计法来确定突变率，以使不同背景的研究人员更易于操作，尽管MSS-最大似然估计法被认为是测定突变率的最佳方法9。MSS-最大似然估计法已有详尽的综述9，可作为替代方法使用，但其计算更为复杂。此外，已有免费软件可用于通过该方法计算突变率22。要获得可重复的突变率测量结果，需注意实验设计中的若干方面，包括使用足够数量的重复培养物、以足够低的初始细胞密度接种培养物，使种群数量增长至少10,000倍，以及选择合适的培养体积，以便将整个细胞群体均匀涂布于选择性培养基上。针对最后一点，可使用先前描述的公式，根据所检测培养物的比例对突变率进行校正9。培养物生长速率的差异可能会影响突变率测定的可重复性，最近已描述一种基于中位数的改进估计方法，可能在这些情况下提供更可重复的结果23。

准确测量细胞年龄的能力是另一个重要因素，有助于确定老年细胞中基因组不稳定性频率是否与年轻细胞中事件发生率所预期的数值不同。我们发现，与钙荧光白染色相比，WGA染色在背景和灵活性方面更具优势，因为WGA可与不同的荧光分子偶联。这种灵活性为使用荧光试剂同时检测其他细胞特征提供了更多机会。通过初步工作建立WGA染色信号强度与细胞芽痕数量之间的对应关系后，即可通过流式细胞术更快速地测定细胞年龄。该方法还可使用比常规显微镜检查更大的细胞群体规模，从而提高测量的可重复性。尽管所有年龄测定均可通过显微镜观察完成，但我们认为流式细胞术方法更有利于快速筛选影响年龄依赖性基因组不稳定性的因素。

除了可靠地测量细胞年龄外，还需考虑母细胞在每一轮生长和分选过程中所能经历的细胞分裂次数。使用较小的初始细胞数量或较大的培养体积，可使细胞在达到目标细胞密度前经历更多次细胞分裂。例如，其他研究人员仅通过两轮分选即获得了非常老的酵母细胞16，这种方法显然具有实验步骤更少的优势。在考虑是否增加培养体积以使细胞在分选前完成更多次分裂时，需注意单个分选柱所能处理的细胞总数存在上限。使用更大的培养体积可能需要采用多个分选柱来处理同一批细胞群体。此外，若在每次分选或采样时间点之间的细胞分裂轮数较少，则可在寿命过程中不同时间点更频繁地观察到突变频率偏离预期的情况。例如，仅在寿命早期和晚期进行采样可能得到突变频率持续上升的数据，而在寿命期间增加中间时间点的采样则可能揭示突变频率快速上升后趋于平稳的变化模式。然而，由于本方案能够分离出老化的母细胞，因此提供了更直接评估突变率随年龄变化的机会。可通过使用不同年龄的母细胞进行波动试验，来确定其突变率是否与使用年轻细胞测得的速率存在差异。尽管这些波动试验中的培养物在生长过程中会成为老细胞与年轻细胞的混合群体，但与起始使用年轻细胞所得结果之间的任何差异，均可归因于起始细胞群体年龄较老所致。

可重复地获得足够数量的老化母细胞群体，以准确测量基因组不稳定性，对于该方法的成功至关重要。尽管本实验方案描述了使用特定的磁性分选系统来实现此目的，但其他研究团队已采用不同的系统对酵母母细胞进行分选14,18（参见材料表）。这些替代系统也应适用于本方法，但可能需要对厂商提供的操作流程进行一定的优化。无论使用何种具体系统，所需细胞群体的规模取决于所研究的突变类型或基因组重排的发生频率。最低要求是必须拥有足够数量的母细胞，以确保每个群体中至少能获得一个突变克隆，从而计算突变频率。实际上，若预期从某一细胞群体中仅获得零到五个突变克隆，则结果可能具有较大变异性；而即使略微增加群体规模，使预期突变克隆数达到五个至十个，也能显著提高实验的可重复性。在对起始群体进行生物素标记时，每次分选的回收效率都需纳入考虑，以帮助确定为准确测定老年母细胞中突变频率所需的适当群体规模。若每次分选后母细胞的回收率为90%，经过五轮生长与分选后，仅能回收原始群体的59%。若每次分选过程中标记母细胞的回收率仅为80%，则经过五轮生长与分选后，原始群体的回收率将下降至约33%。在检测低频事件时，测量并最大化回收率至关重要，因为群体规模减少两到三倍，就可能导致每群体中突变克隆数量不可靠。

有多种选择可以扩展或修改本方案，以更全面地理解有丝分裂细胞衰老过程中的基因组不稳定性。简单的例子包括分析基因功能改变、培养基变化或其他环境条件变化如何影响突变随年龄的累积。可通过测量年轻细胞在基因功能改变或特定条件下的突变率，并据此判断突变的累积是否与基于突变率预测的结果不同，以及是否与对照细胞群体存在差异。在复制性衰老过程中不同时间点的细胞群体可暴露于特定应激因素，例如活性氧（ROS）或DNA损伤剂。短暂且轻度的氧化应激并未显著影响细胞分选的能力（图3），但更强烈的应激可能使细胞恢复变得复杂。初步实验有必要验证特定应激处理后母细胞是否仍能被高效回收。此外，还可对分离得到的母细胞进行详细的细胞特征分析，包括活性氧水平、线粒体和液泡形态，以及其他与衰老相关的生理特征3。进一步地，这些母细胞也可作为后续处理或操作的起始群体。由于在实验过程中母细胞与子细胞已被物理分离，子细胞仍可用于分析。例如，可将子细胞生理特征的变化，或受损大分子在酵母母细胞与子细胞之间的不对称遗传现象24，与突变频率/速率中任何有趣变化的时间点进行比较。也可测定子细胞群体的突变频率，以尝试建模在复制性衰老过程中是否存在突变的不对称遗传。总之，将磁性细胞分选富集母细胞的方法与波动试验相结合，能够高效利用S. cerevisiae模型系统的优势，深入探究有丝分裂细胞衰老过程中遗传改变累积的机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院国家衰老研究所授予 P. H. M. 的 R00AG031911 项目基金资助。本文内容不一定反映美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335100 mg
抗生物素微珠Miltenyi Biotec130-090-4852 ml 微珠，偶联单克隆小鼠抗生物素抗体（同种型：小鼠 IgG1）
MACS LS 柱Miltenyi Biotec130-042-40125 根适用于 QuadroMACS 分离器的柱
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotec130-090-976仅分离器
QuadroMACS 起始试剂盒Miltenyi Biotec130-091-051包含：QuadroMACS 分离器（130-090-976）、MACS 多功能支架（130-042-303）、LS 柱（130-042-401）、MACS 15 ml 管架（130-091-052）、1 个 2 ml 单位的 MACS 微珠。注意：替代系统包括 Dynabeads Biotin Binder 和 MagnaBind 磁珠
BD Falcon 细胞滤网，40 µmBD Biosciences35234040 µm，用于 BD Falcon 50 ml 圆锥管，每包 50 个
台盼蓝Sigma-AldrichT6146粉末，溶解后过滤以去除颗粒物至关重要
麦胚凝集素 Alexa Fluor488Life TechnologiesW11261也可使用具有不同激发/发射光谱的偶联物
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP3693010 ml，也可使用其他抗荧光淬灭封片剂

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