钙参与多种生理和病理生理信号通路。活细胞成像需要专门的设备，且耗时较长。本研究优化了一种快速、简便的方法，利用流式细胞仪检测悬浮状态下的贴壁上皮细胞胞质钙的相对变化。
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摘要
摘要
多种生理和病理生理过程均需要或受钙离子调控，例如胞吐作用、线粒体功能、细胞死亡、细胞代谢以及细胞迁移等。细胞质中的钙离子浓度通常维持在低纳摩尔水平；而内质网、线粒体基质及细胞外空间中的钙离子浓度则处于高微摩尔至毫摩尔范围。在受到刺激时，细胞质钙离子浓度会出现短暂升高，从而触发下游事件。检测细胞质钙离子变化通常采用活细胞成像系统，结合钙离子结合染料，这些染料在结合钙离子后会表现出荧光强度增强或发射波长发生偏移。然而，并非所有研究人员都能方便地使用活细胞成像系统。已有其他检测方法被优化用于免疫细胞的流式细胞术分析，以及非免疫性贴壁细胞的荧光酶标仪检测。本文中，我们描述了一种使用单波长钙离子结合染料，通过流式细胞术检测上皮细胞钙离子变化的优化且简便的方法。将通常难以负载染料的贴壁性肾近端小管上皮细胞在丙磺舒存在下负载荧光可渗透的钙离子结合染料，制成细胞悬液后，分别在加入毒胡萝卜素（thapsigargin）、衣霉素（tunicamycin）和离子霉素（ionomycin）前后监测钙离子信号。
引言
钙是一种重要的第二信使，负责细胞生理和病理生理信号的传递1。细胞质中的钙离子浓度通过钙泵和钙交换体的活性维持在较低水平。肌浆网/内质网钙离子ATP酶（SERCA）以ATP依赖的方式将钙离子重新泵入内质网（ER），作为“泵-漏”系统的一部分；而质膜钙离子ATP酶（PMCA）则以ATP依赖的方式将钙离子排出至细胞外空间2。生理信号分子（如激素或神经递质）通过G蛋白偶联受体传递信号，激活磷脂酶C，后者水解质膜上的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2），生成二酰甘油和三磷酸肌醇（IP3）3。其中，二酰甘油保留在质膜中，而IP3扩散至细胞质，与位于内质网膜上的IP3受体（IP3Rs）结合；IP3Rs是一类配体激活的钙离子通道，其激活导致内质网腔内储存的钙离子释放，最终引起细胞质钙离子浓度升高4。钙离子进入细胞质的另一途径是通过质膜上存在的钙离子通道和交换体。这两个区室之间存在串扰：一种是钙诱导的钙释放（CICR），即细胞外钙离子诱导内质网储存钙的释放5；另一种是储存耗竭型钙内流（SOCE），即当内质网钙库耗竭时，STIM蛋白感知该状态，并引起质膜上的Orai钙通道开放，促进内质网钙库的重新充盈6。
在病理生理条件下，细胞钙反应失调，胞质钙浓度在缺乏生理性刺激因子的情况下升高1。钙反应可能以多种方式受到影响：钙信号持续延长、胞质钙清除延迟....
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方案
1. 试剂与溶液的准备
- 配制改良的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（单位：mM：136.9 NaCl，5.37 KCl，0.34 Na2HPO4，0.44 KH2PO4，4.17 NaHCO3，pH 7.2，不含酚红）。4 °C保存。
- 使用蒸馏水配制1.5 M CaCl2和2 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（pH 7.2）的储备液。
- 配制250 mM的丙磺舒储备液。对于游离酸形式（通常称为水不溶性），将丙磺舒粉末溶于1 N NaOH中，加入蒸馏水至最终体积的四分之三，再缓慢滴加1 N HCl至pH 7.4。4 °C保存。
- 将荧光膜通透性钙结合染料溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1 mM的储备浓度。避光保存于-20 °C。
- 每次实验前，新鲜配制含丙磺舒的HBSS灌流（PHF）缓冲液：将改良HBSS与以下成分混合（终浓度）：1.5 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.2）、5%胎牛血清、2 mM丙磺舒和5.55 mM葡萄糖。预热至37 °C。
2. 细胞培养
- 在6孔板或35 mm培养皿中，每孔接种2.5 × 105个肾近....
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结果
为了提高细胞质钙水平，将两种药理学化合物应用于负载了细胞膜通透性钙结合染料 Fluo-3-AM 的肾近端小管细胞（WKPT-0293 Cl.2）。未经处理的对照样本在存在丙磺舒的情况下加载钙结合染料，并进行混合，但不添加任何化合物。毒胡萝卜素（Thapsigargin, TG）是一种经典的 SERCA 泵抑制剂，可导致内质网中的钙泄漏，从而引起细胞质钙浓度升高。衣霉素（Tunicamycin, TUN）通过阻断蛋白质的 N-糖基化，激活未折叠蛋白反应，同时也可增加细胞质钙水平18,21。作为阳性对照，使用钙离子载体离子霉素（ionomycin, IONO），其可使细胞膜对细胞外钙离子通透。在分析时，通过在 SSC/FSC 散点图中选择一个区域（图1中的 R1）来圈定细胞群体。针对每个数据文件生成荧光强度随时间变化的密度图。利用象限分析功能，将散点图划分为四个区域，分别代表化合物添加前后以及高于或低于基础荧光水平的 Fluo-3 荧光强度。通过计算各象限中圈定细胞群体所占的百分比，可评估细胞质钙浓度的升高情况。在此示例中，3 µM TG 导致右上象限细胞百分比增加，表明钙信号被成功诱.......
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讨论
钙作为第二信使信号分子以及内质网与线粒体之间通讯的媒介，在多种细胞过程中发挥关键作用。检测胞质游离钙浓度变化的能力是一种有用的技术，可应用于细胞生物学的各个领域。目前有多种方法可用于检测胞质钙信号。传统上，通过荧光成像系统监测比率型钙指示剂（如 Fura-2）在活细胞中的信号，并通过测定最小和最大荧光强度来推算出绝对钙浓度。然而，该技术需要专门的设备，例如荧光显微镜、活细胞成像系统及分析软件。本文介绍一种利用流式细胞术检测贴壁上皮细胞胞质中钙离子的简便方法，该方法大多数实验室均可实现。
上皮细胞拥有一系列负责代谢物、外源性物质和药物转运的转运蛋白。其中尤为重要的是SLC22A超家族，包括有机阳离子转运蛋白和有机阴离子转运蛋白22，以及ATP结合盒（ATP）超家族，后者包含多药耐药P-糖蛋白ABCB1和多药耐药蛋白（MRPs）等成员23。最初使用大鼠肾近端小管细胞系WKPT-0293 Cl.2进行的实验，如Gergely et al.16论文中所述。将细胞悬浮并用Fluo-3 AM负载，但在使用10 .......
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致谢
实验室研究工作由德国慕尼黑弗里茨-本德基金会（Fritz-Bender Foundation）（资助T.D.）以及维滕/黑尔德克大学校内研究基金（资助W.-K.L.）提供支持。谨此感谢弗兰克·特沃诺德教授（Frank Thévenod）博士（生理学与病理生理学研究所） & 毒理学，维滕/黑尔德克大学）提供的有益建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | 细胞可渗透 |
| 丙磺舒 | Sigma-Aldrich | P-8761 | 水不溶，溶于1 N NaOH |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 毒胡萝卜素 | Tocris Bioscience | 1138 | |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur 流式细胞仪 + CELLQuest 软件 | Becton Dickinson | ||
| 流式细胞术Windows多文档界面（WinMDI） | Joe Trotter，斯克里普斯研究所 | 请注意，这是一个较旧的16位应用程序，可读取符合FCS 2.0标准的文件，但无法识别FCS 3.0数字数据。 | |
| WKPT-0293 Cl.2 大鼠肾近端小管细胞系 | 由乌尔里希·霍普弗博士（生理学系）提供 & 生物物理学，凯斯 凯斯西储大学，克利夫兰，俄亥俄州 |
参考文献
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J.
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重印与许可
