用于高效杀伤的杀手型人工抗原呈递细胞（KaAPC） 体外 耗竭人抗原特异性T细胞

摘要

本文介绍了杀伤性人工抗原呈递细胞（KaAPC）的制备指南，KaAPC是一种高效的工具，用于 体外 耗竭人类抗原特异性T细胞，以及在不损害其余免疫系统的前提下，以抗原特异性方式治疗T细胞介导的自身免疫性疾病的细胞免疫治疗替代方案。

摘要

目前对T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗主要依赖于全身性免疫抑制策略，而长期使用这类方法会伴随不良副作用，例如控制感染或恶性肿瘤的能力下降。因此，需要开发新的治疗方法，能够仅靶向致病细胞，同时保持免疫系统的其余部分完整无损。在过去十年中，已开发出多种基于细胞的免疫治疗策略，用于调节T细胞介导的免疫反应。这些方法大多依赖于诱导免疫耐受的抗原呈递细胞（APC）。然而，这类基于细胞的疗法不仅技术上复杂且操作繁琐，还极易受到细胞毒性T细胞反应的影响，从而限制了其治疗潜力。本文介绍一种非细胞型杀伤性人工抗原呈递细胞（KaAPC）的制备方案，该方法可在不影响其余免疫系统功能的前提下，选择性清除致病性T细胞。KaAPC是一种细胞免疫治疗的替代方案，有望通过抗原特异性方式调控异常的T细胞反应，用于治疗自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应。

引言

在过去的二十年中，人们对自身免疫性疾病的致病机制有了许多深入的认识。然而，目前最常用的治疗方法仍然依赖于皮质类固醇以及嘌呤类似物、烷化剂和钙调神经磷酸酶抑制剂等免疫抑制药物¹。这些药物的使用显著改善了患者的预后，但并不能治愈潜在的免疫系统功能障碍。此外，患者因此更容易发生感染，并且患癌风险增加。

因此，治疗T细胞介导的自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应的最终目标是特异性地靶向致病性T细胞，同时保持免疫系统的其余部分不受影响，并维持其应对其他免疫相关疾病的能力。早在20世纪70年代，多个研究团队首次描述了利用抗原呈递细胞（APC）作为治疗手段来抑制外周T细胞反应。自那时起，已发展出多种基于细胞的治疗方法（详见Schütz综述） 等²使用表达FasL的杀伤性APC作为免疫调节细胞的策略已显示出良好的效果，提示其在治疗自身免疫病、同种移植物排斥反应及慢性感染方面具有治疗潜力。然而，利用FasL杀伤性APC的策略仍存在显著局限性，最终限制了其临床应用：（i）APC的生成或分离过程耗时、费力且成本高昂；（ii）因免疫抑制导致血细胞减少症的患者所能提供的细胞数量有限且质量较差；（iii）通过FasL等凋亡诱导信号对APC进行包被或转导会导致表型高度变异；（iv）杀伤性APC易受T细胞细胞毒性效应功能的影响，从而降低其治疗潜力。因此，难以保证获得可重复、定义明确的杀伤性APC表型，用于抗原特异性T细胞反应的调控 体内.

基于我们先前关于表达FasL的杀伤性APC的研究^3-5 以及人工抗原呈递细胞（aAPC）^6,7 我们开发了一种基于微珠的方法（KaAPC），用于抗原特异性地抑制或清除自身反应性T细胞 体外KaAPC 由共价固定在直径为 4.5 μm 的顺磁性乳胶微球表面的 HLA-A2-Ig 二聚体（信号 1）和抗 Fas 单克隆抗体（诱导凋亡信号）组成。它们可通过 Fas/FasL 介导的方式，以抗原特异性、且不依赖于活化诱导的细胞死亡（AICD）通路的机制，从多种特异性的 T 细胞培养物中清除抗原特异性 T 细胞。在靶向 T 细胞中，可在处理 30 分钟后迅速诱导剂量依赖性的细胞凋亡。⁸.

KaAPC 可以以受控方式轻松制备，确保获得定义明确的即用型表型，并克服大多数基于细胞的耗竭策略的不足之处。因此，KaAPC 在治疗T细胞介导的自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应方面具有巨大潜力，推动了T细胞特异性治疗策略领域的发展。

方案

1. 基于HLA-A2-Ig的KaAPC的制备

1. 制备无菌硼酸盐缓冲液。将硼酸溶解于水中，配制成 0.1 M 的溶液，并调节 pH 至 7.0。用 0.22 μm 滤器无菌过滤缓冲液，于 4 °C 保存。
2. 制备无菌珠洗缓冲液。使用不含镁和钙的磷酸盐缓冲液（PBS），加入人 AB 血清至终浓度为 3%，加入乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度为 2 mM，加入叠氮化钠（NaN₃）至终浓度为 0.01%。用 0.22 μm 滤器无菌过滤缓冲液，于 4 °C 保存。
3. 从储备液中转移 250 μl 环氧基微珠（约 100 × 10⁶ 颗微珠）至一个无菌的带螺口盖的玻璃小瓶中。
4. 加入 250 μl 硼酸盐缓冲液。
5. 将玻璃小瓶置于磁铁上，静置 2 分钟使微珠吸附；吸除缓冲液，然后将玻璃小瓶从磁铁上取下。
6. 用 1 ml 硼酸盐缓冲液洗涤微珠一次。
7. 将微珠重悬于 550 μl 含 0.018 μg/ml HLA-A2-Ig 和 3.64 μg/ml 抗人 CD95 单克隆抗体（克隆号 CH11）的溶液中，轻轻振荡混匀。（更多信息请参见讨论部分。）
8. 将玻璃小瓶置于旋转仪上，4 °C 颠倒旋转孵育 24 小时。
9. 在 300 × g 条件下离心 2 分钟，使微珠沉淀。
10. 将玻璃小瓶置于磁铁上 2 分钟，吸除“KaAPC 负载溶液”；将玻璃小瓶从磁铁上取下，加入 1 ml 珠洗缓冲液，轻轻振荡重悬微珠。
11. 重复步骤 1.10 两次。
12. 将玻璃小瓶置于旋转仪上，加入 1 ml 珠洗缓冲液，4 °C 孵育 24 小时。此时，珠洗缓冲液中的人 AB 血清将封闭所有残留的蛋白结合位点。
13. 在 300 × g 条件下离心 2 分钟，使微珠沉淀。
14. 将玻璃小瓶置于磁铁上 2 分钟，吸除珠洗缓冲液；将玻璃小瓶从磁铁上取下，更换为 1 ml PBS 溶液。

2. KaAPC 的质量控制、肽段加载、洗涤、储存与稳定性

1. 将 1.5 × 10⁵ 个 KaAPC 转移至流式管中，加入 1 ml FACS 洗涤缓冲液洗涤。
2. 用 100 μl FACS 洗涤缓冲液重悬磁珠，加入 1 μl 抗小鼠 IgG1 PE（用于检测 HLA-A2-Ig 的 Fc 段）和 1 μl 抗小鼠 IgM FITC（克隆 R6-60.2，用于检测抗人 CD95 单克隆抗体）。
3. 4 °C 孵育 15 分钟，用 1 ml FACS 洗涤缓冲液洗涤，再用 250 μl FACS 洗涤缓冲液重悬，通过流式细胞术检测染色结果。

图1. 按本方案部分所述制备的一批KaAPC的质控染色结果。 染色操作按方案第2部分所述进行。HLA-A2-Ig使用抗小鼠IgG1-PE单克隆抗体检测，而抗人CD95（抗Fas）则使用抗小鼠IgM-FITC单克隆抗体检测（见方案第2.2部分）（蓝色线条）。黑色实心图谱表示分别用抗小鼠IgG1-PE单克隆抗体或抗小鼠IgM-FITC单克隆抗体染色的空珠。右上角数字表示平均荧光强度（MFI）。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 进行多肽负载时，将 20 × 10⁶ 个 KaAPC 转移至新的无菌玻璃小瓶中，置于磁铁上 2 分钟，吸除 PBS，然后将珠子重悬于含 5 μg 多肽的 500 μl 新鲜 PBS 中（注意：只有 HLA-A2 限制性多肽才能结合到二聚体上！）。
5. 将负载多肽的 KaAPC 储存于 4 °C，至少保存 3 天，以确保多肽充分结合至 HLA-A2-Ig 二聚体。
6. 使用前立即按照步骤 1.14 所述方法洗涤负载多肽的 KaAPC；重复此步骤至少 6 次。
   注意：此步骤至关重要，必须彻底去除游离多肽，以避免出现假阳性杀伤结果；已有研究表明残留的游离多肽可诱导抗原特异性 T 细胞培养物发生凋亡⁹。为排除可溶性多肽的影响，应设置负载并洗涤后的 KaAPC 上清液对照样本（见 3.8）。
7. 使用血细胞计数板对珠子进行计数，并标注日期、多肽名称及浓度。
   注意：负载多肽的 KaAPC 在 4 °C 下至少一个月内保持功能活性。超过一个月后，重新用相同多肽负载可使 KaAPC 延续使用至一年。

3. KaAPC 体外 杀伤实验

1. 制备共培养基。制备完全RPMI培养基，添加3% T细胞生长因子（实验室自制⁶）和3% 供体自体血浆。若无供体自体血浆，可使用热灭活的人AB血清。
2. 制备AnnexinV结合缓冲液。将8.12 g氯化钠（NaCl）和0.12 g氯化钙（CaCl₂）溶解于990 ml ddH₂O中，再加入10 ml 1M HEPES缓冲液。
3. 生成人源抗原特异性T细胞。（详细方案请参见先前发表的文献⁷，该文献使用人工抗原呈递细胞（aAPC））。通过四聚体染色法确定，确保肽段特异性至少达到>75%。
4. 每份样品中，在96孔圆底板中以1:1比例将2 × 10⁵个抗原特异性T细胞与KaAPC共同培养，总体积为200 μl共培养基，在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育48小时。
5. 收集样品并转移至FACS管中，加入1 ml AnnexinV结合缓冲液洗涤，300 × g离心5分钟，弃上清，重悬于100 μl AnnexinV结合缓冲液中。
6. 在室温下用1 μl AnnexinV-FITC和5 μl 7-AAD染色10–15分钟，加入1 ml AnnexinV结合缓冲液洗涤，300 × g离心5分钟，弃上清，重悬于250 μl AnnexinV结合缓冲液中。
7. 立即上流式细胞仪检测样品。
8. 制备以下样品以评估KaAPC介导的抗原特异性杀伤作用：仅T细胞；T细胞 + 可溶性抗CD95抗体；T细胞 + 未负载肽段的KaAPC；T细胞 + 负载非同源肽段的KaAPC；T细胞 + 负载同源肽段的KaAPC；T细胞 + 负载同源肽段KaAPC的上清液。

图2. KaAPC杀伤实验。 将负载多肽的KaAPC或对照微珠（仅含HLA-A2-Ig的微珠）与CMVpp65特异性T细胞（约80%）以1:1的比例共培养48小时，收集细胞后用Annexin V和碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术检测细胞凋亡（见方案第3.3–3.7节）。^“同源”指负载CMVpp65的微珠，^{“非同源”}指负载Mart-1多肽的微珠。数值表示每个图左下象限中活T细胞的百分比。请点击此处查看该图的放大版本。

9. 为进行交叉实验，需制备两种不同特异性的抗原特异性T细胞。
10. 通过同时分析异质性T细胞群体中抗原特异性T细胞的清除情况，进一步评估KaAPC的抗原特异性耗竭能力。（详细方案请参见Schütz et al.¹⁰）。

结果

该方案的特点在于可明确地生成一种KaAPC表型，同时表达HLA-A2-Ig（信号1）和抗Fas单克隆抗体（凋亡信号），与基于细胞的方法相比，其不受包被或转导效率的影响，且在生产过程中易于调节（图1）。此外，KaAPC 对 T 细胞的细胞毒性效应功能不敏感，其功能在自体抗原呈递细胞处理前后均不依赖于后者的质量。 体外 操作。

KaAPC 能够耗竭抗原特异性的 T 细胞 体外 当负载同源肽时，而负载非同源肽的KaAPC则不会耗竭T细胞（图2）。因此，KaAPC 以抗原特异性的方式诱导T细胞凋亡。随后，我们利用KaAPC从具有不同T细胞特异性的混合物中选择性清除抗原特异性T细胞，证明仅有极少量的细胞毒性扩散至邻近的T细胞图3因此，KaAPC 是一种用于体外特异性清除人源活化抗原特异性T细胞的精巧工具，在治疗自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应方面具有潜在的临床应用价值。

讨论

该实验方案中最关键的步骤是确保信号1（肽-MHC）与信号2（抗Fas单克隆抗体）之间的适当比例。我们已进行了大量滴定实验以确定信号1和信号2的最佳比例；结果表明，HLA-A2 Ig二聚体或抗Fas单抗浓度的微小差异均可能干扰KaAPC的功能。因此，即使从商业来源获取，也应始终验证两种信号的浓度，并定期检测两种蛋白质的质量。此外，应始终使用相同的检测方法来确定浓度，因为不同的检测方法可能导致浓度测定结果不同。HLA-A2-Ig的功能也可能因复性不完全和/或肽段加载效率低下而受损。此外，二聚体分子可能在不同程度上发生聚集，这可能影响蛋白质的功能活性。因此，生成具有功能性和特异性的KaAPC所需的二聚体实际用量可能有所变化。另外，我们发现KaAPC上诱导死亡的信号——抗Fas单抗——其理想作用浓度范围极为严格。在我们的实验中，浓度超过3.64 μg/ml会导致对Fas阳性T细胞的非特异性杀伤，而低于3.64 μg/ml则会导致杀伤活性呈剂量依赖性降低。尽管这些条件较为严格，但关注这些细节将有助于成功生成具有功能性和特异性的KaAPC。

尽管目前的KaAPC表型能够有效清除活化的抗原特异性T细胞，但早期针对初始态或静息态抗原特异性T细胞的实验表明，这些细胞群体并未出现显著的抗原特异性凋亡，原因是这些细胞的Fas表达水平较低。因此，可以设想在KaAPC上添加共刺激信号，以诱导静息T细胞上调Fas表达，从而使其成为KaAPC的靶标。虽然这一策略在理论上可行，但必须谨慎滴定所有三种信号，以确保获得功能性的KaAPC表型。

将微珠平台调整为生物相容性或可生物降解的基质将增强KaAPC 体内 适用性。最近，Shen 等 已报道成功的 体内 使用与抗Fas（克隆Jo2）和抗His/H2-K偶联的5 μm乳胶微球进行KaAPC实验^b-TRP2¹¹我们已能够证明，人工抗原呈递细胞（aAPC）的通用概念可成功从微米级颗粒转移至纳米级颗粒。¹² 且该功能受颗粒几何形状的影响¹³因此，通过改变未来KaAPC设计的尺寸和/或形状，或许能够对其产生影响 体内 功能与生物分布，这对于器官特异性自身免疫性疾病的成功治疗可能至关重要。

KaAPC 克服了基于细胞的耗竭策略的主要缺陷，是一种易于使用、可即取即用、高效节省时间和成本的方法，且不受供体状态和预处理的影响。KaAPC 不会成为自身或旁分泌杀伤信号的靶点，也不易受到细胞毒性T淋巴细胞（CTL）裂解效应功能的影响。KaAPC 的应用需要确定相关疾病的抗原，并依赖于其特定的 HLA 类型。尽管目前已有大量适用于 1 型糖尿病、移植物抗宿主病（GvHD）和多发性硬化症的 HLA-A2 限制性抗原被鉴定出来²，但随着更多 HLA I 类二聚体分子的开发以及新的自身免疫相关抗原的持续发现，KaAPC 的适用范围将进一步扩大和增强。此外，还可考虑使用针对不同表位的 KaAPC 同时靶向多种抗原。

综上所述，KaAPC 代表了一种用于抗原特异性 T 细胞清除的灵活平台技术。其“乐高式”的特性使得可在不同基质上引入新的信号，例如额外的共刺激或抑制信号（如 PD1 或 TRAIL），从而拓宽并增强其后续的体外（in vitro）和体内（in vivo）应用潜力。本文中，我们提供了生成 KaAPC 的逐步操作方案，这是首个基于微球的技术方法，可用于从具有不同特异性的 T 细胞混合物中清除抗原特异性 T 细胞。

图3. KaAPC以抗原特异性方式清除CTL。 将来自同一供体的PKH26标记的活化Fas⁺效应记忆性CTL与PKH67标记的CMVpp65特异性CTL按1:1比例混合，并与^CMVpp65KaAPC共培养48小时。对照组培养物分别用^未负载KaAPC或1 µg/ml可溶性抗Fas单克隆抗体（克隆CH11）处理。在未经处理的混合CTL培养物（T_mix）中检测到存活细胞损失极小。图中展示了T_mix中每种CTL群体的原始FACS数据。细胞凋亡分析如先前文献所述，通过对两个T细胞群体分别设门进行¹⁰。左上象限所示数值代表总细胞的百分比。本图来自三次独立实验中的一次代表性实验。该研究最初发表于《Blood》。Schütz, C. et al. 杀伤性人工抗原呈递细胞：一种清除特异性T细胞的新策略。Blood. 2008; 111, 3546–52。美国血液学会版权所有。请点击此处查看本图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Corning	21-040-CV
人AB型血清	Atlanta biologicals	S40110
EDTA	Sigma/Aldrich	E5134
叠氮化钠	Sigma/Aldrich	71289
M-450环氧磁珠	Invitrogen/Dynal	14011
MPC-1磁力架	Invitrogen/Dynal	12001D
螺口玻璃小瓶	Fisher Scientific	03-338AA
MACSmix管式旋转混合仪	Miltenyi	130-090-753
抗CD95抗体（克隆CH11）	Milliore	05-201
HLA-A2-Ig二聚体	BD/Pharmingen	551263
2 ml冻存管	Corning	430488
抗小鼠IgG1-PE	BD/Pharmingen	559320
抗小鼠IgM-FITC	BD/Pharmingen	553408
氯化钠	Merck	S271-3
氯化钙	Sigma/Aldrich	C5080
HEPES	cellgro/Mediatech	25-060-CI
RPMI培养基	gibco/life technologies	11875-085
96孔圆底板	Falcon	353077
Annexin V-FITC	PromoKine	PK-CA577-1001-1000
7-AAD	BD/Pharmingen	51-68981E
FACS管	Falcon	352008