利用微尺度硅悬臂梁评估细胞收缩功能 体外

摘要

本方案描述了使用微尺度硅悬臂梁作为可变形培养表面，用于测量肌细胞收缩力的方法。 体外细胞收缩引起悬臂弯曲，该弯曲可被测量、记录并转换为力的读数，从而提供一种用于测量收缩功能的非侵入性且可扩展的系统 体外

摘要

更具预测性和生物学相关性的开发 体外 检测方法的建立依赖于多功能细胞培养系统的进步，这些系统有助于对种植细胞的功能进行评估。为此，微尺度悬臂梁技术提供了一个平台，可通过测量细胞收缩引起的基底弯曲，来评估包括骨骼肌、心肌和平滑肌细胞在内的多种细胞类型的收缩功能。多路复用悬臂梁阵列的应用为建立中高通量的实验方案提供了可能，可用于评估药物疗效与毒性、疾病表型及其进展，以及神经肌肉和其他细胞间相互作用。本文详细介绍了为此目的制备可靠悬臂梁阵列的工艺，以及在这些表面成功培养细胞所需的方法。此外，还进一步描述了利用一种新型激光与光电探测系统对维持在该阵列上的收缩型细胞进行功能分析所必需的操作步骤。所提供的代表性数据突显了该系统在收缩功能分析方面所具备的高精度与可重复性，以及该技术可广泛应用于多种研究领域。该系统的成功广泛应用有望为研究人员提供一种快速、低成本的功能研究手段。 体外 从而实现对组织功能、疾病发展以及对新型治疗手段反应的更准确预测。

引言

几十年来，已能够实现人类和啮齿类动物来源的肌肉细胞的体外培养^1,2。然而，尽管标准的盖玻片培养方法适用于生化分析，却无法有效评估细胞的主要功能输出（即收缩能力），因此在评估细胞成熟度和功能表现方面具有一定的局限性。为了最大限度地获取此类体外培养体系中的数据，有必要推进能够以特定构型培养这些细胞并实现实时功能评估的系统开发。多种三维肌肉模型的建立已在一定程度上满足了这一需求，此类系统已在多项研究中被用于评估培养肌肉细胞的体外收缩能力^3-5。尽管这些系统在组织建模与重建研究中具有重要价值，但在单细胞反应研究中的适用性仍受限。在必须开展单根肌纤维研究的情况下，目前仍只能依赖复杂且劳动密集型的离体方法^6-10。此外，当前药物开发与筛选方案正朝着构建复杂的多器官平台方向发展，这要求建立具有非侵入性、易于扩展，并能与支持性细胞及组织模型便捷整合的系统¹¹。

微尺度悬臂梁为评估单个细胞或少量细胞群体的功能性收缩能力提供了一种简便的方法^12,13。该技术基于改进的原子力显微镜（AFM）技术¹⁴，利用激光和光电探测系统测量微尺度悬臂梁在培养的肌管收缩活动作用下的偏转。随后采用改进的Stoney方程计算肌管产生的应力及其引起基底偏转所施加的力¹⁵。已开发出一种扫描程序，可实现对多重悬臂梁阵列的同步评估，为药物毒性/有效性研究提供中等到高通量的应用潜力^15,16。此类技术在开发功能性、临床前药物疗效预测体外检测方法方面可能具有重要价值。此外，硅基悬臂梁芯片的制备不会影响后续对细胞进行免疫染色、蛋白质印迹和PCR等常规生物分子检测的处理。

本文提供了微米级硅悬臂梁的制备与加工、硬件与软件系统的搭建，以及用于评估培养于这些芯片上收缩性细胞功能的操作指南的详细说明。该系统可采用标准细胞培养技术进行细胞的接种与日常维护，因此，只要具备可靠的培养参数，任何类型的收缩性细胞均可轻松整合至该装置中。本系统所采用的相对简单的二维培养参数，使得其他细胞模型的整合或可与肌肉相互作用的细胞类型（如支配性神经元）的引入变得直接可行，从而显著提升了该模型在构建更复杂功能性组织中的适用性 体外 哺乳动物系统的检测方法与多器官模型

方案

1. 悬臂梁芯片的制备

所描述的制备步骤的图示细节如下所示 图1.

1. 将绝缘体上硅（SOI）晶圆放入烘箱中，在 125 °C 下烘烤 20 分钟以去除水分。
2. 使用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备，在脱水后的 SOI 晶圆的支撑层上沉积一层 1.5 µm 厚的二氧化硅层。
3. 将晶圆放置在匀胶机卡盘上，器件层朝上。确保晶圆居中，在晶圆中心滴加 2 ml P20 底层试剂，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 3,000 rpm 下旋转 60 秒。P20 底层试剂可促进光刻胶在器件层上的附着。
4. 晶圆仍在匀胶机卡盘上时，在晶圆中心滴加 2 ml S1818 光刻胶，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 3,000 rpm 下旋转 60 秒，形成一层 1.5 µm 厚的光刻胶层。
5. 将晶圆置于热板上，在 115 °C 下进行 1 分钟的前烘。
6. 使用光刻接触式掩模对准仪进行硬接触紫外曝光，将悬臂梁掩模的图形转移到器件层的光刻胶上。根据 S1818 光刻胶的曝光能量值 125 mJ/cm² 计算曝光时间。
7. 将晶圆浸入 726 MIF 光刻胶显影液中 1 分钟，并轻轻前后摇动晶圆以完成显影。
8. 用去离子（DI）水冲洗晶圆并干燥，建议使用旋转冲洗干燥（SRD）设备。
9. 使用浸有丙酮的棉签去除晶圆边缘（距边缘 5 mm 范围内）的光刻胶。
10. 将晶圆装入深反应离子刻蚀（DRIE）设备中，光刻胶面朝上，运行刻蚀程序，通过器件层刻蚀已图形化的硅层。埋入的氧化层作为刻蚀停止层，因此应进行比预期所需多 50% 至 100% 的刻蚀循环，以确保完全刻蚀。
11. 将晶圆放入热的光刻胶去除液中浸泡 20 分钟以去除光刻胶。将晶圆转移至快速倾倒冲洗机（QDR）中用去离子水冲洗。光刻胶去除后，将晶圆装入 SRD 设备中进行冲洗和干燥。在显微镜下检查晶圆，确保悬臂梁图形符合预期。
12. 使用 PECVD 设备在晶圆的器件层上沉积一层 1 µm 厚的未掺杂二氧化硅层。该氧化层在后续工艺步骤中起到保护悬臂梁的作用。
13. 将晶圆放置在匀胶机卡盘上，支撑层朝上，开始处理晶圆背面。确保晶圆居中，在晶圆中心滴加 2 ml P20 底层试剂，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 3,000 rpm 下旋转 60 秒。
14. 晶圆仍在匀胶机卡盘上时，在晶圆中心滴加 2 ml SPR220-4.5 光刻胶，以 1,000 rpm/sec 的加速度在 2,000 rpm 下旋转 45 秒，形成一层 6.5 µm 厚的光刻胶层。
15. 将晶圆置于接近式热板上，在 115 °C 下进行 2 分钟的前烘。
16. 使用具备正反面对准功能的光刻接触式对准仪，将背面窗口掩模与正面悬臂梁图形对准，并进行硬接触紫外曝光，将背面窗口掩模的图形转移到支撑层的光刻胶上。根据 SPR220-4.5 光刻胶的曝光能量值 480 mJ/cm² 计算曝光时间。
17. 紫外曝光后，将晶圆在暗处静置 30 分钟，再进行下一步工艺。
18. 将晶圆浸入 726 MIF 光刻胶显影液中 2 分钟，并轻轻前后摇动晶圆以完成显影。
19. 用去离子（DI）水冲洗晶圆并干燥，建议使用旋转冲洗干燥（SRD）设备。
20. 将晶圆置于 90 °C 的烘箱中加热 12 小时。
21. 使用含氟气体和氧化物刻蚀工艺的反应离子刻蚀（RIE）系统，刻蚀晶圆背面的二氧化硅层。晶圆背面已图形化的氧化层在后续工艺中作为刻蚀掩模。在显微镜下检查晶圆，确保暴露窗口区域的二氧化硅已完全刻蚀。
22. 使用浸有丙酮的洁净室棉签去除晶圆边缘（距边缘 5 mm 范围内）的光刻胶。
23. 将晶圆装入 DRIE 设备中，运行刻蚀程序，将已图形化的支撑层刻蚀至 500 µm 深度，以埋入的氧化层作为刻蚀停止层。将该刻蚀步骤分为多次运行，以防止晶圆过度加热，从而避免硅刻蚀不均匀。此刻蚀步骤将完全去除悬臂梁下方的硅材料。
24. 使用 25% 稀释的氢氟酸（HF）刻蚀液进行湿法刻蚀，去除悬臂梁下方的埋入氧化层以及悬臂梁上方的保护性氧化层。
    注：此步骤释放硅悬臂梁的底面，并在下方打开窗口，以便激光探针可接触悬臂梁。
25. 使用一系列去离子水浴冲洗晶圆，并用氮气小心干燥。由于悬臂梁仅在其基部受到支撑，切勿对悬臂梁直接使用强力的去离子水或惰性气体喷射。
26. 沿支撑层刻蚀步骤中形成的切割线，将单个芯片从晶圆上切割分离。

2. 细胞培养

1. 根据已发表的方法制备13F盖玻片¹⁷.
   注意：如果无法获得13F盖玻片，可使用任何接触角大于95°的疏水表面。
2. 将悬臂梁芯片和13F盖玻片置于70%乙醇溶液中灭菌，并在超净工作台中自然晾干。
3. 将单个悬臂梁芯片放置于标准12孔板内13F盖玻片的上方。
4. 根据标准的细胞培养方案，使用针对所用细胞类型优化的生物聚合物或表面修饰对悬臂梁进行包被。
5. 用特定的生长培养基将细胞重悬至所需浓度。
   注意：本方案将导致大量细胞穿过悬臂梁窗口而未能附着于目标悬臂梁表面。因此，细胞悬液的制备浓度应比标准盖玻片实验高出3-4倍。例如，大鼠骨骼肌卫星细胞的接种密度通常为每平方毫米500至700个细胞。^15,16，并与悬臂基底结合使用，细胞密度为每平方毫米2,000个细胞。使用新的细胞来源时，应进行优化实验以确定合适的接种密度。
6. 将200 μl细胞悬液移液至悬臂梁芯片表面，确保培养基气泡完全覆盖悬臂梁窗口区域。若培养基通过窗口渗入且未能在悬臂梁上方形成稳定的气泡，则更换13F盖玻片并重新进行接种。
7. 将含有芯片的培养板转移至培养箱中，使细胞贴壁至少1小时（建议2-3小时）。
8. 孵育结束后，使用无菌镊子将芯片转移至不含13F盖玻片的洁净孔中，并加入1 ml培养基补足培养体系。
9. 将培养板放回培养箱。
10. 根据细胞的标准操作流程进行培养 体外 在盖玻片上进行培养。对于骨骼肌细胞，当细胞达到汇合状态后，需更换培养基成分以诱导肌管形成。

3. 悬臂梁偏转分析的硬件与软件设置

1. 将一个加热的培养皿放入直立式电生理显微镜的载物台上。
2. 向加热的显微镜载物台中加入 3 ml 细胞当前悬浮所用的培养基（含 10 mM HEPES）。
3. 将不锈钢电极安装在加热培养皿内侧，电极间距为 15 mm，并将其连接至脉冲发生器；该脉冲发生器应能够产生强度、频率和波形可调的电场刺激脉冲，以便在需要时对细胞施加电场刺激。
4. 将安装在 XY 平移平台上的氦-氖激光器固定在显微镜台下方，并调节其位置，使激光束以相对于悬臂平面 30° 的角度穿过加热培养皿的底部。
5. 将安装在 XY 平移平台上的四象限光电探测模块固定在显微镜载物台下方，并调节其位置，使反射的激光束落在四个象限的中心位置。图 2 展示了实施本方案所需的硬件配置概览。
6. 编写软件程序以控制扫描悬臂的线性执行器。编写该软件程序时应参考 图 3 所示的流程图。本系统所用的图形化界面如 图 4 所示。

4. 记录悬臂梁偏转数据

1. 打开悬臂梁分析硬件及配套软件。
2. 将加热台热敏电阻插入培养基中，并等待其读数达到 37 °C。
3. 将悬臂梁芯片插入载台，使悬臂梁朝向载台的右侧。
4. 打开显微镜光源。
5. 调节显微镜焦距，使悬臂梁边缘清晰可见；使用激光/光电探测器控制软件将激光束定位在悬臂梁 1 的尖端。注：假设悬臂梁朝向载台右侧，则悬臂梁 1 位于阵列的左上角，编号从左上至左下依次为 1 至 16；悬臂梁 17 位于右上角，编号从右上至右下依次为 17 至 32（图 5A）。
6. 在记录软件中点击“播放”。
7. 通过调节控制光电探测器的步进电机，调整光电探测器位置，使信号在 x 和 y 两个方向上的读数均为“0”。
8. 在激光/光电探测器控制软件中设定悬臂梁 1 的位置（图 4）。
9. 将激光移至悬臂梁 16 的尖端，重复步骤 4.7，并在激光/光电探测器控制软件中设定悬臂梁 16 的位置。
10. 将激光移至悬臂梁 32 的尖端，重复步骤 4.7，并在激光/光电探测器控制软件中设定悬臂梁 32 的位置。
11. 将激光移至悬臂梁 17 的尖端，重复步骤 4.7，并在激光/光电探测器控制软件中设定悬臂梁 17 的位置。
12. 关闭显微镜光源及实验室的顶灯。
13. 在记录软件中点击“记录”。
14. 将脉冲发生器硬件设置为 40 毫秒、5 V 脉冲，频率为 1 Hz，并开启设备。
    注：可选地，此时可采用针对特定细胞来源优化的刺激方案；上述参数是基于使用人源和啮齿类细胞来源所收集数据的参考设置^12,13,15,16。
15. 使用激光/光电探测器控制软件，设置硬件对 32 个悬臂梁组成的阵列进行扫描，每个悬臂梁停留 5 秒。
16. 当完成对 32 个悬臂梁的扫描后，关闭刺激器，停止记录软件，并调出数据文件。
17. 检查每个悬臂梁记录的轨迹，寻找收缩活动的证据。记录所有产生阳性反应的悬臂梁。若偏转幅度至少高于基线 0.1 V，则定义为一次收缩峰。
18. 在激光/光电探测器控制软件中，从扫描程序中移除所有无反应的悬臂梁。
19. 随后可对有活性的悬臂梁在无刺激条件下重新扫描，以获取细胞自发收缩活动的读数。
20. 在向培养基中添加治疗性化合物后，进行有或无全场电刺激的扫描，以观察其对培养细胞功能输出的影响。
21. 通过长时间电刺激细胞并扫描收缩力水平，进行疲劳评估，测量峰值力下降至特定阈值以下所需的时间。
22. 在运动神经元与肌肉共培养的实验中，通过向运动神经元-肌管悬臂梁共培养体系施加神经刺激剂（如谷氨酸）或突触抑制剂（e.g.，D-筒箭毒碱），并分别扫描自发活动的增强或减弱，以评估神经肌肉接头的形成情况¹⁶。
23. 根据计划实验的具体需求，执行相应的特定扫描程序。

5. 悬臂梁偏转数据的分析

1. 使用修正的Stoney方程¹⁵（如下所述）将原始悬臂梁偏转数据（单位：伏特）转换为细胞层或肌管产生的应力读数（单位：帕斯卡），以及细胞收缩力的直接测量值（单位：纳牛顿）：
   方程 1
   方程 2
2. 其中 δ = 悬臂梁尖端偏转量及肌管产生的应力，σ_c = 假设肌管为均匀厚膜且宽度与悬臂梁相等时所产生的应力，C_detector = 系统特异性系数，用于关联光电探测器上激光位置与电压，θ = 激光与探测器相对于悬臂梁平面的角度，E_Si = 硅的弹性模量，t_Si = 悬臂梁的厚度，t_f= 肌管厚度，v_Si = 硅的泊松比，L = 悬臂梁长度，P = 激光从悬臂梁尖端到探测器的光路长度，w_Si = 悬臂梁的宽度。这些方程中所用术语的示意图见图6。
3. 假设肌管为均匀薄膜，则肌管内的力等于薄膜中的力，通过将应力计算得到的力与应用Stoney方程时假设的细胞横截面积相等，可得方程3。
   方程 3
4. 在完成功能数据采集后，采用标准技术对悬臂梁芯片进行固定，用于免疫细胞化学分析，或收集细胞用于蛋白质或DNA分析。
5. 可选地，不进行分子分析准备，而是将细胞重新放回培养箱，以便在后续时间点重新评估其功能表现。

结果

在悬臂梁上成功培养具有收缩功能的细胞是一种相对简单的操作，可利用标准的细胞培养技术完成（图5）。支持细胞收缩的悬臂梁比例会因所研究的细胞类型及所采用的具体培养技术而异。使用源自大鼠后肢的原代胚胎细胞时，在检测的悬臂梁中有12%可观察到收缩活动（n = 4）。采用文中所述的激光与光电探测器系统对收缩功能进行分析，可获得与接种细胞功能成熟度相关的准确实时数据。结合标准的电生理学软件可对原始数据进行分析，从而便于计算相关功能参数，例如峰值力、达到峰值力的时间以及半舒张时间，如图7所示。对经治疗性化合物处理的培养细胞进行后续数据采集，可实现加药与不加药条件下功能参数的比较，从而评估化合物的活性，并进一步预测其in vivo反应。此外，通过延长刺激方案，还可评估培养细胞的疲劳速率，从而拓展本系统所能获取的生理学数据范围（图8）。

可对悬臂培养系统进行改良，以在含有骨骼肌肌管的培养体系中引入运动神经元¹⁶，以便评估神经肌肉突触的形成 体外

讨论

分析微尺度悬臂梁以检测细胞收缩的关键步骤，是将悬臂梁芯片准确放置于显微镜载物台上，并对准激光束与光电探测器与阵列中角落悬臂梁尖端的位置。如果该操作不够精确，软件将无法推算阵列中其余悬臂梁的位置，可能导致数据采集过程中出现大量假阴性结果。操作人员在校准激光位置前，应确保悬臂梁芯片与培养皿底部完全贴合。若芯片在培养皿中倾斜放置，将改变偏转激光束的路径，干扰数据采集。

必须使用功能正常的气浮台，以在数据采集期间消除背景振动。本研究中所用悬臂梁的厚度较小（约 4 µm），对收缩活动具有高灵敏度，但副作用是增强了对振动的敏感性。操作人员在记录数据期间应尽量减少在设备周围的移动，以降低背景信号干扰。最后，在将悬臂梁芯片放置于载物台时，需注意确保芯片不与培养孔中的刺激银电极接触。若电极接触芯片并施加全场刺激，将改变电流路径，从而对系统有效刺激培养细胞的能力产生负面影响。

为了更准确地测量骨骼肌成肌细胞的力输出，强烈建议在完成功能分析后对培养的细胞进行免疫染色。所列出的公式需要输入成肌细胞的横截面积（CSA）以计算力。虽然可以根据先前的数据使...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠原代肌肉生长培养基
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049
B27（50倍浓缩液）	Life Technologies	17504044	1倍
Glutamax（100倍浓缩液）	Life Technologies	35050061	1倍
G5 添加剂	Life Technologies	17503-012	1倍
胶质细胞源性神经营养因子	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ml
脑源性神经营养因子	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ml
睫状神经营养因子	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ml
神经营养素-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ml
神经营养素-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ml
酸性成纤维细胞生长因子	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
心肌营养素-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
硫酸肝素	Sigma	D9809	100 ng/ml
白血病抑制因子	Sigma	L5158	20 ng/ml
玻璃粘连蛋白	Sigma	V0132	100 ng/ml
大鼠原代肌肉分化培养基
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
设备
II 类红色二极管激光器	Newport
光电探测器	Noah Industries
Model 2100 脉冲刺激器	A-M systems
Multiclamp 700B 数字转换器	Axon Instruments
膜片钳显微镜及载物台	Olympus
Delta T4 培养皿温控系统	Bioptechs
Axoscope 软件	Molecular Devices
LabVIEW 软件	National Instruments
37 oC, 5% CO2 培养箱	NAPCO
II 类微生物操作台	Labconco
移液器及吸头	Eppendorf