利用胶体探针纳米显微技术对颗粒-颗粒相互作用进行定量与定性分析

摘要

胶体探针纳米显微技术可用于多个领域，以深入了解胶体体系的物理稳定性和凝集动力学，并借助生物系统辅助药物发现与制剂科学研究。本文所述方法为研究此类体系提供了定性与定量的手段。

摘要

胶体探针纳米显微技术（CPN）利用原子力显微镜（AFM），研究经特定制备的胶体探针与任意选定基底之间在纳米尺度上的相互作用力，可为胶体系统中存在的物理相互作用提供关键见解。胶体系统广泛存在于多种应用中，包括药物制剂、食品、涂料、纸张、土壤与矿物、洗涤剂、印刷等^1-3。此外，胶体可呈现多种状态，如乳液、泡沫和悬浮液。通过胶体探针纳米显微技术，可以获得有关胶体黏附特性、结合能的关键信息，甚至可深入了解其物理稳定性及凝聚动力学。此外，胶体探针纳米显微技术还可用于生物细胞研究，辅助药物发现与制剂开发。本文中，我们描述了一种开展胶体探针纳米显微技术的方法，讨论测量过程中需考虑的关键因素，并展示此类测量所能获得的定性与定量数据。

引言

原子力显微镜（AFM）是一种能够对材料表面进行定性和定量成像与探测的技术。^4-6 传统上，AFM用于评估多相材料的表面形貌、形态和结构。AFM具备定量评估纳米尺度相互作用的能力，例如在空气和液体环境中，特定探针与基底之间的电荷、吸引力、排斥力和粘附力。^7,8 最初由Binning、Quate和Gerber开发的AFM⁹，利用已知或确定灵敏度及弹簧常数的探针接近和/或扫描样品。由于探针与样品之间的物理相互作用，悬臂在接触或接近过程中会发生偏转，根据操作模式的不同，这种偏转可被转化为样品表面形貌信息，或用于测量探针与样品之间存在的作用力。对AFM技术的改进，例如胶体探针纳米显微术¹⁰，使科研人员能够直接评估感兴趣胶体体系中两种材料之间的纳米级力相互作用。

在胶体探针纳米显微技术中，将选定的球形颗粒连接到悬臂梁的尖端，以替代传统的圆锥形或金字塔形探针尖端。采用球形颗粒有利于与约翰逊-肯德尔-罗伯茨（Johnson, Kendal, Roberts，JKR）¹¹ 理论以及德查金-兰道-弗尔韦-奥弗贝克（Derjaguin, Landau, Vervwey, Overbeek，DLVO）^12-14 理论等理论模型进行比较，同时可最大限度地减少表面粗糙度对测量结果的影响¹⁵。这些理论用于描述胶体体系中预期的接触力学行为及颗粒间作用力。DLVO 理论结合了范德华吸引力和由双电层引起的静电排斥力，可定量解释水相胶体体系的聚集行为；而 JKR 理论则引入了接触压力和粘附效应，用于模拟两个组分之间的弹性接触。一旦制备出合适的探针，便可使其接近其他材料或颗粒，以评估两者之间的相互作用力。使用标准商业探针仅能测量该探针与特定材料之间的相互作用力，而定制胶体探针的优势在于能够测量研究体系中实际存在的材料之间的相互作用力。可测量的相互作用包括颗粒间存在的粘附力、吸引力、排斥力、电荷作用力以及静电作用力¹⁶。此外，胶体探针技术还可用于研究颗粒间的切向力及材料的弹性性质^17,18。

能够在多种介质中进行测量是胶体探针显微术的主要优势之一。可以在环境条件、液体介质或湿度可控的条件下进行测量，以模拟所研究体系的实际环境条件。在液体环境中进行测量的能力使得可以在胶体体系自然存在的环境中对其进行研究，从而能够定量获取可直接反映体系自然状态的数据。例如，可通过使用具有与定量吸入器（MDI）中所用推进剂相似性质的模型液体推进剂，来研究MDI中存在的颗粒相互作用。而在空气中测得的相同相互作用则无法代表吸入器内实际存在的体系。此外，还可以通过改变液体介质，评估湿气侵入、第二种表面活性剂或温度对MDI中颗粒相互作用的影响。温度控制能力可用于模拟胶体体系制造过程中的特定步骤，以评估制造或储存过程中温度变化对颗粒相互作用可能产生的影响。

使用胶体探针可获得的测量数据包括：形貌扫描、单个力-距离曲线、力-距离黏附力图谱以及驻留力-距离测量。本文所介绍的胶体探针纳米显微技术所测量的关键参数包括“ snap-in”（突入力）、最大载荷（max load）和分离能（separation energy）。“snap-in”用于表征吸引力的大小，最大载荷表示最大黏附力的数值，而分离能则反映将粒子从接触状态拉出所需消耗的能量。这些参数可通过瞬时或驻留力测量获得。两种不同类型的驻留测量包括偏转驻留（deflection dwell）和压入驻留（indentation dwell）。驻留测量的时长和类型可根据特定系统中感兴趣的相互作用进行精确选择。例如，采用偏转驻留——即在设定的悬臂偏转值下保持样品接触——可用于评估分散体系中聚集体内部形成的黏附键。所形成的黏附键可随时间变化进行测量，从而揭示在长期储存后重新分散聚集体所需的力学特性。该方法能够获取大量数据，充分体现了其方法上的高度灵活性。

方案

1. 准备胶体探针和原子力显微镜基底

1. 制备胶体探针时，采用作者先前开发的方法。¹⁹
   1. 简而言之，使用45°角固定装置将无针尖悬臂梁以精确的45°角固定（图1A）。
   2. 通过在载玻片上涂抹一层薄薄的环氧树脂制备环氧树脂载片。使用洁净的刮刀或缓慢的氮气流，确保涂覆在载玻片上的环氧树脂层高度尽可能低。
   3. 使用定制设计的固定装置将环氧树脂载片固定在40倍光学变焦显微镜镜头上（图1B）。然后用悬臂梁接近环氧树脂载片，使其尖端沾取少量环氧树脂。
   4. 重复上述步骤，将一个感兴趣的单个颗粒附着在悬臂梁的顶端（图1C）。
2. 通过使用热塑性粘合剂将胶体颗粒固定在原子力显微镜（AFM）盖玻片上，制备AFM基底。
   1. 将直径35 mm的圆形盖玻片加热至120 °C，并在盖玻片上施加少量粘合剂。高温对于熔化热塑性粘合剂以便施加是必要的。
   2. 然后将盖玻片冷却至40 °C，再将胶体颗粒撒在胶层表面。注意：在40 °C时，胶体已充分凝固，颗粒不会嵌入胶中，但胶仍具有足够的黏性以确保颗粒牢固附着于基底。
   3. 进一步将盖玻片冷却至室温（RT），并用温和的氮气流吹去未附着的多余颗粒。
   4. 用即将用于胶体探针测量的液体介质多次清洗基底，以确保所有未附着的颗粒均被去除。注意：此步骤至关重要，可减少测量过程中自由流动颗粒的影响，这些颗粒可能与悬臂梁相互作用并导致结果误差。

2. 安装胶体探针、校准激光及平衡系统

1. 将带有胶体颗粒的盖玻片安装到液体池的下半部分，确保O形圈正确就位，以防止任何泄漏。
2. 在显微镜载物台上放置一张疏水性透明保护膜，以防止实验过程中可能发生的液体泄漏，特别是在仅使用液体池下半部分进行测量时，随后将液体池放置在显微镜载物台上。注意：为简化操作，若系统能够充分平衡，可仅使用液体池的下半部分；提示——蒸发会改变测量条件并影响结果/读数。
3. 将胶体探针连接至原子力显微镜（AFM）扫描头，并将其组装到AFM上。开启AFM仪器软件后，使用扫描头上的调节旋钮将悬臂尖端调至焦点。注意：所有操作步骤和测量均使用MFP-3D-Bio AFM结合Asylum Research软件完成。
4. 为获得最大信号强度，使用扫描头上的相应调节旋钮将激光对准悬臂尖端。
5. 让系统平衡5–10分钟，或直至偏转值稳定。使用偏转调节旋钮将偏转值调至零或略低于零。
6. 系统在空气中平衡后，使用AFM软件（主面板窗口中的“热噪声校准”面板）热噪声法计算胶体探针的InvOLS（灵敏度）和弹簧常数。注意：该灵敏度将仅作为临时值使用，直到测量结束时测得真实灵敏度（见步骤4）。
   1. 选择“Cal Spring Constant”或“Cal InvOLS”，然后点击“Capture Thermal Data”以采集热噪声数据。
   2. 当出现明显的共振峰时，停止数据采集，并点击放大主峰区域。
   3. 点击“Initialize Fit”，然后点击“Fit Thermal Data”，以获得自动计算的弹簧常数或InvOLS值。
7. 使用注射器缓慢向液体池中加入2 ml液体介质，并确保悬臂周围无气泡。由于介质折射率已改变，需重新对准激光，并再次使系统平衡，待偏转值稳定后，将偏转重新调至零。注意：若环境与液体之间存在较大温差，则平衡所需时间将更长。

3. 成像与数据采集

1. 将初始扫描尺寸设为 20 µm，扫描速率为 1 Hz，扫描角度为 90°，设定点为 0.2 V，并对样品进行扫描。根据需要调节增益，以获得重叠的正向扫描和反向扫描曲线。
2. 一旦发现目标颗粒，立即对该颗粒进行放大，以限制探针在获取力体积测量数据前与基底的长时间相互作用。
3. 放大后，获取单个颗粒或单个颗粒局部区域的足够图像。然后在软件中切换到“力控制面板”。将红色位置条移至最高位置，设定力距离为 5 µm，扫描速率为 0.1 Hz，触发通道为“无”，并执行一次单点力测量。确保探针不接触基底。
4. 根据获得的单次测量曲线图，通过在图形窗口中右键单击并选择“Calculate Virtual Def Line”（计算虚拟偏转线）选项来计算虚拟偏转线。软件将自动计算虚拟偏转值，并根据需要更新该数值。
5. 将触发通道改为“偏转”，并将触发点设为 20 nm。将力距离设为 1 µm，并根据感兴趣的测量力大小调整扫描速度。
6. 在进行 2–3 次连续的初步单点力测量后，手动调整“力控制面板”中“评审”选项卡下的偏转逆光杠杆灵敏度（InvOLS）数值。
   1. 执行一次单点力测量，然后点击“力控制面板”上的“Review”（评审）按钮，打开主“力控制面板”（Master Force Panel）。
   2. 高亮显示最近完成的力测量数据。在“Axis”（坐标轴）标题下，确保仅勾选“DeflV”。使用下拉菜单将“X-Axis”（X 轴）输入字段更改为“Sep”，然后点击“make graph”（生成图形）。
   3. 点击主“力控制面板”中的“Parm”（参数）选项卡，并调整“InvOLS”数值，使图中接触区域完全呈垂直状态。然后将此数值填入主“主控面板”（Master Panel）窗口中“Force”（力）选项卡下“Cal sub-tab”中的“Defl InvOLS”字段。
   4. 重复此过程 2–3 次，以确保 InvOLS 数值不再发生显著变化。
7. 现在所有参数均已设置完毕，确认液体介质液位仍充足，且偏转信号保持稳定。注意：此时可获取单点力曲线或力图谱。若需进行停留力测量，可在“力控制面板”中启用停留（dwell）选项。

4. 分析灵敏度的后期调节

1. 完成测量采集后，测量胶体探针的真实灵敏度。为此，使用该胶体探针在相同液体介质中对云母等“无限”硬的表面进行一次相对较大偏转/力的力测量。注意：灵敏度在实验结束后获取，因为较大的偏转/力可能会损坏由多孔或脆弱胶体所制备的胶体探针。
2. 软件利用接触区域的斜率自动计算灵敏度（图2）。在对该特定胶体探针获得的所有曲线进行数据分析时，应使用此真实的灵敏度值。

结果

液态胶体系统被用于多种药物递送系统。在吸入给药中，一种常见的胶体系统是加压定量吸入器（pMDI）中的混悬液。pMDI 内部的颗粒间相互作用在制剂的物理稳定性、储存以及药物递送的均一性方面起着关键作用。本研究在室温下评估了模型抛射剂（2H,3H-全氟戊烷）中多孔脂质基颗粒（光学平均粒径约 2 µm）之间的颗粒间作用力，以阐明所采用方法的功能特性及其可能存在的误差。

图3展示了使用基于脂质的可吸入颗粒制备的两个典型的胶体探针，这些探针可用于胶体探针纳米显微技术。关键是要将单个胶体颗粒固定在悬臂的顶端，使其成为最突出的特征，并在测量过程中首先与样品接触。这可确保所测得的相互作用完全来源于该胶体颗粒。若附着多个颗粒或颗粒聚集体，则可能因两个颗粒同时感应基底上同一单颗粒而引起多个悬臂偏转，导致错误结果（图4）。使用正确制备的胶体探针，可在液体环境中获得如图5所示的颗粒基底的形貌图像。

使用胶体探针进行的形貌扫描，其分辨率将低于使用尖锐锥...

讨论

在液体胶体探针纳米显微技术中，存在多种可能导致系统不稳定的因素，这些因素通常可通过适当的平衡程序有效缓解。如前所述，这些不稳定性会导致错误的结果，并使力曲线更难以进行客观分析。如果所有已知的不稳定来源均已排除，但仍出现与图4所示相似的图形，则可能另有其他测量参数所致。在胶体探针纳米显微技术中，还需考虑其他重要的测量参数，包括悬臂与样品接触和 retract（回撤）的速度，以及力测量的触发点。此外，应注意胶体探针中心的位置可能与传统原子力显微镜（AFM）探针尖端不同。因此，建议将激光光斑准确定位于探针颗粒的中心正上方，以最大限度提高测量精度。

选择一个合适的速度至关重要，该速度应足以测量所关注的作用力，并且适用于液体介质中的实验。如果仅关注颗粒间的黏附力，则接近速度并非关键因素。然而，在测量颗粒间的吸引力和排斥力时，选择足够缓慢的接近和回撤速度非常重要。应选择一个合适的接近速度，以确保相互作用力主导悬臂梁的偏转，而非速度本身。过快的接近速度会掩盖作用力，导致吸引力无法充分形成；而在液体介质中过慢的接近速度则会产生不稳定的基线，如图6C...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双气泡环氧树脂	Hardman	4004
Veeco 无针探针	Veeco	NP-O10
多孔颗粒	Pearl Therapeutics
原子力显微镜 (MFP)	Asylum	MFP-3D
SPIP 扫描探针图像处理软件	NanoScience  Instruments
35 mm 盖玻片	Asylum	504.003
Tempfix	Ted Pella. Inc.	16030