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方法文章

小鼠内窥镜检查技术 在体 内 癌症发生的多模态成像及肠道伤口愈合与炎症评估

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DOI：

10.3791/51875

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2014年8月26日

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1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital Münster

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小型动物成像技术可实现活体内的连续诊断检查和治疗干预。in vivo。近年来，其应用范围显著扩大，目前已包括结肠肿瘤发育评估、伤口愈合以及炎症监测。本方案展示了小鼠内窥镜的这些多样化潜在应用。

摘要

小鼠模型被广泛用于研究人类疾病的发病机制，并在临床前阶段评估诊断方法以及治疗干预措施。然而，对病理改变的有效评估通常需要进行组织学分析，而当分析执行时 离体 需要牺牲动物，因此在传统实验条件下，个体内部的随访检查很少能够实现。因此，小鼠内窥镜技术的发展在 活体 小鼠使研究人员首次能够直接观察胃肠道黏膜，并可重复进行该操作以监测其变化。该技术具有多种应用前景。 体内 小鼠内窥镜技术已存在，可用于研究肠道炎症或伤口愈合过程、反复获取黏膜活检样本，以及利用微型注射导管局部给予诊断或治疗试剂。最近，分子成像技术进一步拓展了诊断性影像模式，可通过特异性光探针实现对特定靶分子的精准检测。总之，小鼠内窥镜已成为诊断性实验研究中一种新兴的前沿技术 体内 成像技术可能对各个领域的临床前研究产生重大影响。

引言

动物模型极大地丰富了我们对多种肠道病理机制的理解。实验室小鼠（Mus musculus小鼠因其丰富的遗传和基因组信息，以及易于获得的转基因和基因敲除品系，已成为生物医学研究中的首选动物模型。除了有助于深入理解疾病发病机制外，动物模型还广泛用于药物候选物以及临床前诊断或治疗干预措施的测试。然而，尽管存在多种模拟人类疾病的鼠类模型，许多在临床诊疗中常规使用的方法在小鼠中却无法应用。因此，用于监测小鼠疾病进展或评估治疗干预效果的监测策略通常仅限于间接观察或 死后 分析。尽管存在一些非侵入性方法可用于监测小鼠的生命体征，例如疾病活动指数、体重增减的量化、血液、尿液和粪便分析，但这些仅为间接指标，且易受个体间变异性的干扰。此外， 死后 分析方法阻碍了在重复时间点进行纵向观察。用于监测小鼠疾病活动的复杂成像技术最近才被引入 1,2尽管这些成像技术能够实现重复分析，但仅能提供对肠道的描述性且常不精确的观察结果，无法实现黏膜的直接可视化，也不能进行活检取样或药物候选物的局部及黏膜内应用等诊断或治疗性干预。

近年来，已开发出用于活体小鼠的高分辨率内窥镜系统3,4。这些内窥镜技术首次实现了对结肠腔内疾病病理的直接可视化观察，例如伤口愈合或肠道炎症，可提供客观、实时的状态评估，从而能够在同一只动物身上进行多次时间点的纵向研究。除了可在单只小鼠中重复进行活检外，内窥镜系统还可通过将物质直接施用于目标区域，对特定肿瘤或局部炎症进行治疗性干预。此外，由于治疗性物质和对照物质均可直接递送至目标区域，因此可在同一只小鼠体内完成对照实验，从而排除个体间差异的影响。目前，这些系统已被用于评估结肠炎症、伤口愈合、腹腔镜肝脏活检、原位诱导肝肿瘤8以及肿瘤发展过程，并采用多种评分系统进行量化分析，例如小鼠结肠炎内窥镜严重程度指数（MEICS）5-7。MEICS包含五个评估炎症的参数：结肠壁增厚、血管模式改变、纤维蛋白存在、黏膜表面颗粒状改变以及粪便性状。

在本方案中，我们描述了刚性内窥镜在小鼠肠道伤口愈合、炎症及结肠癌模型中的应用。首先，我们展示了内窥镜对伤口愈合和结肠炎症的评估，以及对结肠炎活动性的纵向监测和小鼠结肠癌发生过程的研究。除了内窥镜的描述性应用外，我们还提供了详细的内窥镜器械使用说明，用于获取活检样本，以及对特定目标成分进行局部和黏膜内给药例如， 药物候选物或肿瘤细胞）。最后，我们展示了在结直肠肿瘤研究中应用小鼠荧光内镜技术，该技术采用先进的分子成像方法。

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方案

所有动物实验均根据德国动物保护法，经自然、环境与消费者保护局（LANUV）批准。

1. 材料与实验设置

  1. 动物护理
    1. 使用任何品系、体重为20至25克的雌性或雄性小鼠，并根据当地动物护理法规进行饲养。
    2. 在进行荧光检测前至少三天，给小鼠饲喂专用的无苜蓿啮齿类动物饲料，以减少管腔内的自发荧光。
    3. 提供经高压灭菌的饮用水 随意.
  2. 急性DSS诱导性结肠炎的诱导
    1. 配制3%（w/v）葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量：36,000–50,000 Da）溶液，即将3 g DSS溶解于100 ml高压灭菌水中。将此溶液作为小鼠唯一的饮用水提供。 随意 按每只小鼠每天5 ml计算DSS溶液的用量。对照组小鼠饲喂不含DSS的高压灭菌水 随意摄取9.
  3. 结直肠癌的诱导
    1. 将致突变剂偶氮甲烷（AOM）（注意！可能致癌并造成遗传损伤！）溶解于无菌等渗盐水中，配制成终浓度为1 mg/ml的溶液。使用1 ml注射器（30 G）经腹腔注射给予每公斤体重10 mg的单次剂量AOM。10.
    2. 从第0天到第7天、第14天到第21天、第28天到第35天以及第42天到第49天，对小鼠（对照组小鼠除外）进行多轮重复的3%（w/v）DSS处理，以诱导炎症驱动的结直肠癌发生。在各次处理间隔期间，仅给予小鼠高压灭菌水（参见 图 4A 详细时间安排见实验方案。在整个实验过程中，给对照小鼠喂食高压灭菌水。
  4. 荧光内镜（FE）的制备
    1. 使用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（分子量 70,000 Da；FITC:葡萄糖 = 1:250）通过增强发育异常相关血管模式的可视化来检测结肠腺瘤。
    2. 在荧光内镜检查前5分钟，将60 mg FITC标记的葡聚糖溶于100 µl PBS中，通过静脉注射给药。
  5. 麻醉
    1. 持续提供异氟烷以维持麻醉（1.5 L 氧气）2/分钟；1.5–2 体积% 异氟烷 [2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷]）。使用配备面罩的专用兽用麻醉设备以精确控制麻醉过程。
  6. 灌肠剂的制备
    1. 若怀疑存在大量粪便堆积可能影响视野，可向结肠内注入2 ml液体灌肠剂（成分：1.5% (w/v) 磷酸氢二钠和11% (w/v) 磷酸二氢钠）。

2. 技术设备

  1. 使用专为小型动物内窥镜检查开发并获批的兽医内窥镜工作站。将工作站连接至摄像单元、氙气光源、空气泵以及常规PC显示器，用于白光内窥镜检查。随后将摄像单元与微型刚性内窥镜（外径1.9 mm，长度10 cm）连接。 图5).
  2. 使用带工作通道的内镜鞘图 5D用于活检钳或注射导管的应用。进行诊断性结肠镜检查时，使用无工作通道的鞘管。
  3. 配置荧光内窥镜光源的参数以激发所用示踪剂（例如， 490 nm（适用于FITC标记的葡聚糖）。此外，在望远镜与相机之间插入适当的带通滤光片（例如， 525 nm（用于FITC标记的葡聚糖）
  4. 通过内窥镜的工作通道插入柔性活检钳（3 Charr.，28 cm）以获取活检样本。
  5. 通过工作通道插入柔性注射管（0.96 mm），用于局部、黏膜内或腔内给予诊断或治疗用制剂。
  6. 使用可加热检查台，温度设置为 42 °C，以防止小鼠在检查过程中发生低体温。

3. 动物麻醉

  1. 将小鼠放入一个小型但密封的盒子中，通入异氟烷（100% (v/v)，5 vol%，3 L/min），直至小鼠失去意识。
  2. 将小鼠转移至内窥镜检查台，继续吸入异氟烷 通过 面罩给药，浓度为100% v/v，1.5 vol%，流速1.5 L/min。麻醉期间务必涂抹眼膏以防止眼睛干涩。
  3. 通过检查反射来评估麻醉效果。检查“翻正反射”：若小鼠已充分麻醉，将其仰卧放置时不应出现翻身动作。检查“足趾反射”：当麻醉达到适当深度时，轻捏动物足趾间皮肤不应引起肢体回缩（即达到手术耐受阶段）。

4. 结肠镜检查

  1. 将麻醉后的小鼠俯卧/仰卧于检查台上。
  2. 给予2 ml灌肠剂 通过 若怀疑存在明显粪便潴留而可能影响视野，可将带扣式套管插入结肠。给予灌肠后，等待小鼠排便。小心插入内窥镜，避免穿孔。
  3. 打开鞘管的两个阀门，其中一个连接至气泵。用食指封住另一个阀门以排出空气。缓慢而小心地向结肠充气，特别是在进行活检或注射时需格外谨慎。
  4. 仅将内窥镜推进至升结肠弯曲处，以避免穿孔（距肛门4–5 cm）。
  5. 诊断性结肠镜检查
    1. 撤出内镜时检查黏膜是否存在炎症性或恶性改变。缓慢撤镜以评估肠壁全周。根据需要，采用适当的既定评分系统评估腔内病变。
    2. 为确保在重复观察伤口区域时内窥镜位置一致，需记录小鼠肛门与黏膜病变之间的距离。此外，使用活检钳尖端作为间隔物，以在图像采集过程中保持内窥镜与伤口区域之间距离一致。伤口大小与内窥镜鞘的尺寸相关，其直径为3 mm。
      注意：通过与先前检查的影像记录进行光学比对，将内窥镜置于相同位置。每次随访的内窥镜检查中，均应在相同角度和距离下测量病灶。
  6. 活检操作步骤
    1. 在两名研究人员的协助下进行活检。将活检钳经由工作通道小心插入，直至活检钳尖端在第二名研究人员的监视器上可见。谨慎开合活检钳，避免穿孔。
    2. 将镊子移至病变部位。
  7. 注射操作步骤
    1. 在两名研究人员的配合下进行注射操作。将柔性注射导管（0.96 mm）预先完全充满待注射试剂。将导管经工作通道送入，直至第二名研究人员在监视器上可见套管针（30 G）。准备好精密注射器，轻柔注入所需剂量的诊断或治疗试剂。每次注射体积不得超过 50 µl。
    2. 以15–30度的角度将针头插入黏膜下层，针尖斜面朝向黏膜方向。成功注射后，黏膜会出现特征性的抬举征。
  8. 荧光内窥镜（FE）
    1. 在荧光内镜检查前，通过静脉注射将60 mg FITC标记的葡聚糖溶于100 µl PBS中。
    2. 根据示踪剂的药理学特性，确定荧光标记示踪剂注射后至成像操作之间的最佳时间点。根据所用示踪剂的激发和发射波长，设置带通滤光片系统的参数。对非特异性血容量示踪剂进行荧光内镜检查（例如， 静脉注射荧光染料后立即采集荧光素异硫氰酸酯（FITC）图像，以评估黏膜表面的血管模式。
    3. 若使用靶向示踪剂或“智能探针”，建议在示踪剂应用后数小时进行成像，以获得更优的靶区与背景信号比。
    4. 对结果进行拍照和录像记录。

5. 结肠镜检查后

  1. 将小鼠放入一个空的笼子中，并将其置于纸巾上，以防止小鼠吸入垫料。使用红光灯对小鼠进行保温，以防低体温。观察小鼠状态，在其恢复足够的意识以维持胸卧位之前不得无人看管。待小鼠完全清醒后，将其放回原笼中。
  2. 实验结束后，将小鼠放入一个体积较小但密封良好的盒子中，通入CO2（100% (v/v)，100 vol%，3 L/min）。等待小鼠完全失去意识并停止呼吸后，通过颈椎脱位法处死。进行腹部剖腹手术并取出结肠。沿纵轴切开结肠，冲洗干净，用于后续组织学或分子学评估。

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结果

在体 肠道伤口愈合的监测
在常规内镜检查过程中，使用直径为3法式（相当于1 mm）的微型活检钳通过机械方式诱导产生黏膜伤口； 图1A随后通过每日内镜检查监测伤口愈合情况，并利用图像编辑软件测量残留伤口面积以进行量化分析。 例如， ImageJ图1B）。单个伤口随时间的闭合情况以实际伤口面积与初始伤口面积的比值表示。例如，在造伤后第3天，伤口面积恢复了41% ± 4.1%，而在第7天时伤口通常已完全愈合（图1C此外，在实验结束时，可将伤口切除以进行组织学评估 离体. 图示为苏木精-伊红（H&E）染色的代表性图像&E）染色的创面床在第0天和第5天（图1D).

内镜引导下黏膜内注射治疗
为进行药物的黏膜内给药，将一根带有固定于末端的套管（30 G）的柔性导管（直径 0.96 m...

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讨论

上皮伤口愈合是一个持续进行的过程。胃肠道黏膜表层细胞不断发生生理性脱落，需要上皮细胞频繁再生。 16因此，伤口愈合受损对多种疾病具有重大影响，包括胃肠道溃疡和 17 吻合口漏 18分子背景评估以及潜在药物候选物对上皮愈合的促进作用，仅通过细胞培养系统进行研究可能并不充分 体外19,20因此，需要更复杂的实验装置，例如使用活检钳制造明确黏膜损伤的小鼠结肠镜检查，以实现可靠的 体内 评估胃肠道伤口愈合情况，并探究肠道炎症与伤口愈合过程之间可能存在的相互作用。

此外，可使用注射针头对诊断性染料或潜在药物候选物进行局部黏膜内给药。可通过工作通道插入一根末端固定有针头的软管（直径为0.96 mm）来实现该操作。由于可在同一动物的不同炎症或肿瘤病灶内分别给予试验药物及安慰剂对照，因此该方法相较于传统实验设置具有更高的可靠性优势。局部注射的另一应用是植入人源或小鼠肿瘤细胞，以在小鼠结肠内建立原位肿瘤模型21。

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披露

作者无任何利益冲突可披露。

致谢

感谢 Sonja Dufentester 和 Elke Weber 提供出色的技术支持。感谢 Faekah Gohar 对手稿的校对，以及 Stefan Brückner 在医学信息学方面的支持。本研究得到了 Else-Kröner-Fresenius-Stiftung 基金会跨学科资助项目（2012_A94）的支持。D. Bettenworth 获得了明斯特西法伦威廉大学医学院研究奖学金的支持。M. Brückner 得到了德国研究基金会（DFG SFB1009B8）“Gerok”轮转职位的支持。 感谢 Heike Blum 为小鼠卡通图提供的插图绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
无苜蓿饮食Harlan Laboritories, Madison, USA2014
偶氮甲烷（AOM）Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Bepanthen 眼膏Bayer, Leverkusen, Germany80469764
硫酸葡聚糖钠（DSS）TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
伊红Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 4382
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon 管 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Florene 100 V/VAbbott, Wiesbaden, GermanyB506
苏木精Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyHHS32-1L
异戊烷（2-甲基丁烷）Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
亚甲蓝Merck, Darmstadt, Germany1159430025
O.C.T. Tissue Tek 包埋剂                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Omnican F - 套管Braun, Melsungen, Germany9161502
磷酸盐缓冲液（PBS）Lonza, Verviers, Belgium4629
氯化钠 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
标准饮食Altromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek 冷冻模具Sakura, Leiden, Netherlands4566
Vitro – Clud                                                               R. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
设备
AIDA 控制系统Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20 096020
带通滤光片Semrock, Rochester, USAHC 716/40
带通滤光片Semrock, Rochester, USAHC 809/81
活检钳，3 Fr.，28 cmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany61071ZJ
Dell 显示器Dell, Frankfurt am Main, GermanyU2412Mb
检查鞘管，9 Fr.Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany61029D
检查鞘管，9 Fr.Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany61029C
光纤导光缆，3.5 mmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany69495NL
荧光素蓝滤光系统Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20100032
荧光素阻断滤光片Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20100033
脚踏开关Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20010430
HOPKINS 望远镜，1.9 mm，长度 10 cmKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany1830231
SCB D-light P Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20 133720
SCB tricam SL IIKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20 2230 20
VETPUMP II 仪器管路套装Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany69811
Tricam PDD PALKarl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany20221037
UniVet PortaGroppler Medizintechnik, Deggendorf, GermanyBKGM 0451
Vetpump 2Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany69321620

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