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方法文章

动物快速基因分型及脑神经元原代培养的建立

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DOI：

10.3791/51879

⸱

2015年1月29日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了对新生小鼠进行标记和基因分型以及从中建立原代神经元培养物的实验步骤。该基因分型方法快速、高效且可靠，可实现核酸的自动化提取。这对于新生期致死的小鼠及其培养物尤其重要，因为这些实验要求在培养前完成基因分型。

摘要

对哺乳动物神经元形态和功能的高分辨率分析通常需要对个体动物进行基因分型，随后分析其原代神经元培养物。本文介绍了一套完整的操作流程：对需进行基因分型的新生小鼠进行标记、快速基因分型，以及从小鼠中建立低密度脑神经元培养。通过纹身法对单个小鼠进行标记，可实现长期识别，直至成年。本方案所描述的基因分型方法快速高效，能够实现核酸的自动化提取，且可靠性良好。该方法适用于常规基因分型所需时间不足的情况，例如，患有新生儿致死性表型的小鼠。原代神经元培养以低密度方式进行，有利于开展高空间分辨率的成像实验。该培养方法需在神经元接种前预先制备胶质细胞饲养层。本方案整体应用于运动障碍疾病DYT1肌张力障碍的小鼠模型（ΔE-torsinA基因敲入小鼠），并从这些小鼠的海马、大脑皮层和纹状体中制备神经元培养物。本方案也可适用于携带其他遗传突变的小鼠，以及其他物种的动物。此外，该方案的各个独立步骤亦可用于单独的子项目。因此，本方案不仅在神经科学领域，而且在生物医学科学的其他领域均具有广泛的应用前景。

引言

遗传疾病啮齿类动物模型在阐明正常蛋白质和核酸的生理功能，以及这些分子缺陷所导致的病理生理后果方面已被证明十分有用。此类模型包括关键细胞功能相关蛋白缺陷型小鼠，以及阿尔茨海默病等疾病的动物模型。然而，某些基因操作可能导致新生个体在出生后不久或数天内死亡。在此类情况下，原代细胞培养成为一项重要工具，因其可在动物死亡前从胚胎或新生仔鼠中获取活细胞，并维持培养至少数周。 体外在此期间，可通过生物化学、功能性和形态学实验观察早期神经元的发育。对于原代神经元培养，以低密度接种神经元可能更具优势；这使得在高空间分辨率下清晰观察单个胞体、树突、轴突主干及神经末梢成为可能。然而，低密度下神经元的存活与分化通常需要将其接种于胶质细胞饲养层上，或与胶质细胞共培养但无直接物理接触，或使用经胶质细胞条件化处理的培养基进行培养。 1.

在胶质细胞饲养层上建立低密度神经元培养物通常需要事先进行快速可靠的基因分型——耗时仅数小时，而非数天。当需要将神经元的基因型与预先制备的胶质细胞饲养层的基因型相匹配时，速度尤为重要。一个更具实际意义的例子是，可能需要决定使用何种基因型的仔鼠进行培养，以优化实验效率。

本文展示了此前发表的研究中所采用的小鼠快速、简化且可靠的基因分型工作流程2-6。该方法使用小鼠尾部组织和一种 commercially available kit。本方案包含从组织中单步提取核酸，无需核酸纯化步骤，也无需使用终止缓冲液（“终止溶液”）。通过在起始样本量、动物年龄以及PCR扩增子长度等方面引入差异的一系列测试结果，展示了该基因分型方法的可靠性。该试剂盒具有自动化提取和高可靠性的优势。

为了全面起见，本文还展示了使用纹身法对基因分型小鼠进行长期标识的方法。纹身是通过将纹身墨水注入皮肤真皮层（表皮层之下）实现的7。本文描述了对新生或出生1天的小鼠脚垫进行纹身的操作流程，尽管纹身也可应用于其他身体部位（如尾巴和脚趾）以及各年龄段的动物。此外，还将展示基于不同类型胶质细胞饲养层优化制备的低密度小鼠神经元接种与培养的操作流程2,8。

我们使用一种遗传性小鼠模型来研究遗传性神经系统疾病DYT1型肌张力障碍——这是一种由TOR1A基因突变（c.904_906delGAG/c.907_909delGAG；p.Glu302del/p.Glu303del）引起的常染色体显性运动障碍9。该基因编码的蛋白torsinA属于“与多种细胞活动相关的ATP酶”（AAA+）蛋白家族，该家族成员通常发挥类似分子伴侣的功能，参与蛋白质解折叠、蛋白复合物解离、膜运输以及囊泡融合等过程10-13。该突变导致谷氨酸密码子的框内缺失，可能引发“早发性全身性孤立性肌张力障碍”的临床表现14,15。然而，介导该疾病发生的病理生理机制仍不明确。在基因敲入小鼠模型中，突变等位基因为Tor1atm2Wtd，下文简称为Tor1aΔE。杂合型ΔE-torsinA基因敲入小鼠可存活，且在遗传上模拟了人类DYT1型肌张力障碍患者；而纯合型基因敲入小鼠则在出生后死亡16,17，其出生后存活时间受遗传背景影响18。由于纯合型基因敲入小鼠的早期死亡，必须快速完成动物的基因分型以及神经元培养的建立。作为基因分型的另一个示例，将使用Tfap2a（转录因子AP-2α，激活增强子结合蛋白2α）。该基因编码的蛋白在调控多种细胞过程（如增殖、分化、存活和凋亡）中具有重要作用19。

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方案

注意：本研究中进行的所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 使用脚垫纹身法对小鼠进行长期识别

  1. 用拇指和食指固定小鼠足掌，使足垫（掌面）朝向操作者。注意不要夹伤足部。
    注意：稳定的固定至关重要，以确保纹身颜料注入足垫真皮层，从而使标记持久7。
  2. 用浸有70%乙醇的纱布或棉签擦拭足垫。
  3. 将皮肤油涂抹于棉签尖端，轻轻在足垫表面按压数次。仅使用少量皮肤油；过量会阻碍纹身颜料渗透至皮肤。
  4. 在纹身前，将纹身针尖浸入纹身墨水中。使用洁净、无菌且锋利的纹身针，以减轻疼痛和感染风险，并提高纹身效率。
  5. 在足垫表面涂有皮肤油的情况下，将纹身针尖垂直轻压于足垫中心部位的皮肤，多次注入墨水。有关电动纹身系统的详细信息，请参见材料/设备表。
  6. 用70%乙醇喷洒纱布，轻轻按压足部以去除皮肤表面多余的纹身颜料，检查纹身质量。确认足垫中央出现与正常皮肤色素不同的深色圆形斑点。若纹身颜色过浅或面积过小难以辨识，请重复前述纹身步骤。

2. 使用快速PCR基因分型试剂盒对新生小鼠进行基因分型

  1. 用70%乙醇消毒小鼠尾尖末端，剪取5 mm或更短的尾尖组织，转移至用于PCR的8联管中的一个管内。每只幼鼠使用新的剃刀刀片，以避免样本间的交叉污染。 alternatively，可使用剪刀，但在此情况下，需用70%乙醇仔细并彻底清除刀片上残留的组织。检查是否出血。若发生出血，用纱布对尾部切口处施加压力，直至出血停止。
  2. 添加 200 µl 向每个含有样本的PCR管中加入DNA提取溶液。有关该溶液的成分及试剂盒信息，请参见材料/设备表。
  3. 将管条放入PCR热循环仪中，并使用以下程序开始DNA提取：1个循环 55 °C 10 分钟，1 个循环 95 °C 10 分钟，然后保持在 4 °C.
    注意：此 PCR 热循环仪随后将用于 PCR。
  4. DNA 提取完成后，从热循环仪中取出管条并颠倒 5 次。
  5. 转移 4 µl 将每个样本的溶液（DNA提取物）加入到8联管中未使用的一个管内，并与以下成分混合： 10 µl 2X PCR Ready Mix II 2 µl 混合正向 & 反向引物（推荐使用 0.5 µM；参见 材料/设备表 用于序列）以及 4 µl 无核酸酶的 H2O，每个样本。短暂离心（例如， 使用台式离心机离心3秒。除操作时外，始终保持离心管置于冰上。
  6. 进行热循环。参见 热循环程序所需材料/设备清单
  7. 检测扩增的DNA产物。将PCR反应的全部反应液上样20 µl) 直接加入琼脂糖凝胶的一个加样孔中。将分子量标记物加入另一个独立的加样孔中。施加电场。
  8. 在紫外光下获取条带的荧光图像。

3. 小鼠脑神经元在胶质饲养层上的原代培养

注意：脑组织解剖和细胞解离步骤（3.1）适用于后续所有操作。小鼠胶质细胞培养（3.2）、大鼠胶质细胞培养（3.3）以及小鼠神经元培养（3.4）的步骤将在之后分别描述。

  1. 脑组织解剖与细胞分离
    1. 通过断头法处死一只小鼠或大鼠幼崽，迅速取出脑组织并置于Hanks'溶液中（参见 表1 含20%胎牛血清（FBS）的培养基（用于配制）置于35 mm培养皿中（置于冰上）。
    2. 沿中线将脑组织切成两个半球，取出目标区域例如， 大脑皮层、纹状体和海马）从脑的每个半球中分离出来。去除表面的脑膜和主要血管。使用手术刀将脑区切成4-10片薄片。
    3. 用15 ml离心管，先用Hanks'溶液+20% FBS冲洗脑片一次，再用Hanks'溶液冲洗三次即，无血清）（均在 4 °C用5-10 ml溶液清洗，待脑片沉降至管底后，从管顶部吸除溶液，再加入新鲜溶液。最后通过吸除溶液完成清洗步骤。
    4. 过滤2 ml含胰蛋白酶的消化液（参见 表 1 使用3 ml注射器和 0.2 µm 注射器滤器过滤，并将滤液直接加入含有脑片的离心管中。室温下继续消化13分钟。
    5. 首先通过吸出大部分胰蛋白酶溶液来中和，然后加入 7–10 ml 含 20% FBS 的 Hanks 溶液（4 °C).
    6. 用Hanks'溶液 + 20% FBS冲洗脑片两次，然后用Hanks'溶液冲洗三次即 无血清）（均在 4 °C用移液器吸去溶液，完成清洗步骤。
    7. 过滤2 ml解离液（参见 表1 使用3 ml注射器和 0.2 μm 注射器滤器过滤，并将滤液直接加入含有脑片的离心管中。
    8. 通过轻柔吹打10-20次，将细胞机械分离，直至肉眼不可见组织块。使用棉塞封口的火焰抛光巴斯德吸管，吹打过程中避免产生气泡。
    9. 等待3分钟，使小块组织沉淀。
    10. 将大部分溶液（约 1.5 ml，底部留少量）转移至含有 3 ml Hanks 溶液 + 20% FBS 溶液的 15 ml 离心管中4 °C），使用带有棉塞且经火焰抛光的巴斯德移液管。不要转移全部溶液，因为若混入底部的沉淀物，通常会导致培养物质量下降。
    11. 离心13分钟，约185 g（约1,100 rpm），在 4 °C.
    12. 轻轻吸去上清液，加入 1 ml 预先温育的铺板培养基（37 °C) 加入沉淀中，并使用带棉花塞的火焰抛光巴斯德移液管轻轻吹打数次以重悬沉淀。
      注意：根据不同的培养目的，使用三种不同类型的铺板培养基：小鼠胶质细胞使用铺板培养基-1，小鼠神经元使用铺板培养基-2，大鼠神经元和胶质细胞使用铺板培养基-3（参见 表1 用于成分分析。
    13. 取出 10 μl 细胞悬液，将其与 10 μl 加入0.4%台盼蓝溶液，使用血细胞计数板或自动细胞计数器测定活细胞密度。
  2. 小鼠胶质细胞培养
    1. 清洗盖玻片，以助于建立健康的小鼠细胞培养。
      1. 将玻璃盖玻片（圆形，直径12 mm）浸入玻璃培养皿中的70%硝酸溶液中。用铝箔避光，并置于旋转摇床中过夜（O/N）。
      2. 在培养皿中用蒸馏水至少冲洗玻璃盖玻片三次。将其浸入蒸馏水中，将培养皿置于摇床上过夜（O/N）。
      3. 在生物安全柜中，将盖玻片置于Whatman 150 mm滤纸上干燥。
      4. 对盖玻片进行高压灭菌。
      5. 将盖玻片放入24孔培养板中。
    2. 按照步骤1和2对新生小鼠进行标记和基因分型。
    3. 根据步骤 3.1 获取小鼠幼崽的脑细胞。
      注意：通常使用大脑皮层制备小鼠胶质细胞饲养层。然而，由于不同脑区的细胞数量和得率存在差异，其他脑区（如海马和纹状体）在适当调整细胞密度后也可使用。
    4. 加入约 4 ml 预温的铺板培养基-1 至终体积约 1 ml 的细胞悬液中。预温培养基时，将溶液置于培养箱（5% CO₂）中。2-95% O₂2, 37 °C) 过夜，以使温度和 pH 值稳定。
    5. 将细胞悬液用带有棉塞且经火焰抛光的巴斯德吸管转移至未包被的T25培养瓶中。将培养瓶放入培养箱内。
    6. 1天时 体外 （DIV），用铺板培养基-1 将 T25 培养瓶中的培养细胞冲洗两次4 °C将培养瓶放回培养箱中。用巴斯德吸管完全吸出瓶内的培养基，加入约5 ml新鲜培养基，轻轻倾斜培养瓶并以旋转方式晃动数次，进行冲洗。
    7. 在6-9天体外培养时（6-9 DIV），即， 在胰蛋白酶消化及铺板到盖玻片前一日（步骤 3.2.8–3.2.13 中） 100 µl 将包被材料（有关包被材料的说明，请参见材料/设备表）与细胞外基质蛋白在培养皿中的玻璃盖玻片上孵育，然后将培养皿放入培养箱中。
    8. 在7-10天体外培养时（DIV），当细胞汇合度达到20-40%（空间连续）时，用胰蛋白酶消化细胞。
      1. 用移液管吸尽瓶内的溶液，并加入约13 ml的Hanks溶液，冲洗一次4 °C），轻轻倾斜烧瓶并以旋转动作晃动数次，然后彻底吸除溶液。
      2. 添加 40 µl 加入DNase溶液（终浓度为750单位/毫升）至4毫升胰蛋白酶-EDTA溶液中，将混合液通过一个 0.2 µm 注射器滤器过滤，并将滤液直接加入培养瓶中的细胞内。
      3. 让胰蛋白酶消化反应在13分钟内进行 37 °C 在培养箱中。
      4. 通过加入 2 ml 100% FBS 中和胰蛋白酶溶液（4 °C) 加入烧瓶中。
      5. 使用5-10 ml移液器将经胰蛋白酶消化的细胞转移至15 ml离心管中，加入约4 ml Hank's溶液 + 20% FBS（4 °C），在约185 g下离心 4 °C 13 分钟后，吸除上清液。
    9. 将沉淀重悬于1 ml预热的铺板培养基-1中。
    10. 根据步骤 3.1.13 测定细胞密度。
    11. 完全吸除玻璃盖玻片上的包被液，并接种约50 μl 盖玻片上重悬的胶质细胞
      注：这些细胞将用于建立胶质细胞饲养层。
    12. 将含有盖玻片的培养皿放入培养箱中。
    13. 20-60 分钟后，向每孔加入 1 ml 预热的铺板培养基-1，将培养皿放回培养箱。注意：添加铺板培养基时，可使用另一支移液器轻压盖玻片边缘（无细胞的区域），以防止盖玻片在培养基中漂浮。
    14. 在胶质细胞饲养层培养的第1天（DIV）即， 在玻璃盖玻片上），通过抽吸去除孔中全部溶液，然后加入1 ml预温的铺板培养基-1，以更换培养基。
    15. 当胶质饲养层细胞在2-3天体外培养（DIV）时达到80-100%汇合度时，加入有丝分裂抑制剂（10 µl 5-氟-2'-脱氧尿苷和尿苷混合物；终浓度分别为81.2和 204.8 µM分别向每孔加入，以抑制DNA复制，从而抑制胶质细胞增殖。
    16. 在7-9天体外培养时，当细胞融合度达到90-100%（在将神经元接种至胶质细胞饲养层前1-2小时），更换为预热的接种培养基-2（37 °C).
      注意：神经元将在同一天使用步骤 3.4 进行铺板。
  3. 大鼠胶质细胞培养
    1. 用相同的包被材料包被一个T25培养瓶。
      注意：此步骤对于后续第 3.3.5 步中去除非贴壁细胞是必需的。
      1. 向烧瓶中加入 2.0 ml 涂层材料，并将烧瓶放入培养箱中。
      2. 孵育2-3小时后，彻底吸除包被液，使瓶底完全干燥。
    2. 根据步骤 3.1 从新生大鼠幼崽中获取细胞。
      注意：海马的CA3-CA1区域用于制备大鼠胶质细胞饲养层。然而，其他脑区（如大脑皮层和纹状体）在根据细胞密度差异进行调整后也可使用，因为不同区域的细胞数量和得率存在差异。
    3. 向终体积约为 1 ml 的细胞悬液中加入约 4 ml 预热的铺板培养基-3。
    4. 将细胞悬液用棉塞封口并经火焰抛光的巴斯德吸管转移至包被的T25培养瓶中。将培养瓶置于培养箱（5% CO₂，37 °C）中培养。2-95% O2, 37°C).
    5. 在2-3天体外培养时，当细胞汇合度达到20-40%时，通过紧密关闭瓶盖，剧烈振荡培养瓶约10次，吸除未贴壁或贴壁不牢的细胞，弃去溶液，并加入4-5 ml铺板培养基-3（于 4 °C）。重复此步骤一次。在整个培养瓶底部范围内检查培养的细胞例如， 使用相差显微镜确认呈现神经元形态的细胞（即，完全去除那些细胞体外缘呈现相位明亮的细胞。根据需要重复该操作以彻底清除此类细胞，随后将培养瓶放回培养箱中。
      注意：不同实验人员所需的振荡强度和总振荡次数可能有所不同。关键不在于将振荡次数固定为某一特定数值，而在于确认神经元样细胞已被完全去除。
    6. 在6-8天体外培养时（DIV），当细胞融合度达到90-100%时，用胰蛋白酶消化法传代胶质细胞，操作同步骤3.2.8。
    7. 离心后，将沉淀物重悬于 1 ml 铺板培养基-3 中4 °C），加入10 ml铺板培养基-3（4 °C），将经胰酶处理的细胞转移至未经包被的 T75 培养瓶中，并在培养箱中进行培养。
      注意：大鼠胶质细胞将传代两次；而小鼠胶质细胞仅传代一次，因为多次传代后其状态会变差。大鼠胶质细胞将在未包被任何包被材料的T75培养瓶中进行传代。包被会导致大鼠胶质细胞生长过快，并产生大量带纤毛的细胞（疑似室管膜细胞），进而恶化后续神经元培养的条件。
    8. 在锥形瓶中培养胶质细胞至17-19天时即， 传代后11天，在按照步骤3.3.9–3.3.14进行胰酶消化并接种到盖玻片前一天，放置 100 µl 将包被材料涂布于未清洗的玻璃盖玻片（圆形，直径12 mm）上，置于培养皿中，并将培养皿放入培养箱内。
      注意：对于大鼠胶质细胞培养，洗涤盖玻片与否在培养结果上未观察到差异。
    9. 在锥形瓶中胶质细胞培养至18-20天时（DIV）即， 传代后12天，按照步骤3.2.8，用胰蛋白酶消化培养的细胞，制备胶质细胞饲养层。
    10. 离心过程中，彻底吸除玻璃盖玻片上的包被材料。
    11. 离心后，将沉淀重悬于1 ml铺板培养基-3中4 °C），并根据步骤 3.1.13 测定细胞密度。
    12. 将胶质细胞密度调整至104 活细胞/毫升，并接种 100 µl 将胶质细胞悬液接种到包被的玻璃盖玻片上。
      注：这些细胞将用于建立胶质细胞饲养层。
    13. 将含有盖玻片的培养皿放入培养箱中孵育 20–60 分钟。
    14. 加入1 ml铺板培养基-3（4 °C) 加入每个孔中，然后将培养皿放回培养箱。
    15. 在胶质细胞饲养层培养第3-4天，当盖玻片上的细胞汇合度达到40-80%时，加入1 ml预温的生长培养基（参见 表1 含有胞嘧啶（用于组分） β-D-阿糖呋喃糖苷（AraC，终浓度为 4 µM)以抑制胶质细胞增殖。当胶质饲养层细胞在7-9天体外培养（DIV）时达到60-80%融合度时，按照步骤3.4接种神经元。
  4. 小鼠神经元培养
    1. 按照步骤1和2对新生小鼠进行标记和基因分型。
    2. 将小鼠幼崽用于步骤 3.1。
    3. 将活细胞悬液的密度调整至约 2.0 x 105 细胞/ml，使用预热的铺板培养基-2在小鼠胶质细胞上铺板，或使用铺板培养基-3在大鼠胶质细胞上铺板。
    4. 将细胞悬液轻轻加入各孔的培养基中，接种到胶质细胞饲养层上。注意：所添加细胞悬液的体积需根据培养孔中目标细胞数量确定。例如，接种约60 µl 细胞悬液以达到每孔12,000个细胞。
    5. 注意，神经元接种后无需更换溶液。培养过程中需保持培养箱内湿度，避免孔内溶液蒸发。

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结果

作为本方案应用的示例，展示了通过纹身标记小鼠、在不同实验条件下进行可靠基因分型，以及在胶质细胞饲养层上建立原代神经元培养的代表性结果。

纹身标记

使用纹身标记系统在新生幼鼠的脚垫上进行标记（图1中的“Newborn”）。这些标记在3周龄（“3-week-old”）和32周龄（“32-week-old”）时仍清晰可见。通过四只脚掌上的纹身组合（编号1-16），结合动物笼号信息，或更复杂的编号方案（未展示），可对每只小鼠进行唯一识别。

基因分型

一个基因分型的代表性示例如下（图2）。从新生小鼠尾尖组织中提取的基因组DNA扩增出野生型（Tor1a+/+）、杂合子型（Tor1a+/ΔE）和...

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讨论

本文所述方案包括对小鼠进行纹身标记/识别、从小鼠尾尖提取样本进行基因分型，以及低密度培养小鼠脑神经元的操作步骤。在一次使用6-8只新生小鼠的实验中，这些步骤通常分别需要约0.5小时、4小时和2小时，总计6-7小时。这使得单个实验人员能够在小于一个工作日的时间内完成从幼鼠出生到神经元接种培养所需的全部操作（前提是胶质细胞饲养层已预先制备完毕）。

纹身标记

动物的长期标识对于育种以及组织学、细胞功能和动物行为分析等科学研究具有必要性。对新生动物进行纹身标记具有优势，因其操作迅速且可维持动物的大部分生命周期7,22-25。在足垫上进行纹身标记相较于剪趾标记23，在保留可检测行为方面更具优势，例如悬吊或抓握行为22,26，尽管部分研究未观察到此类缺陷（e.g., 25）。纹身后未出现母鼠排斥或吞食幼崽的情况。有关动物长期标识的其他方法，可参见近期综述7,23,24。

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披露

作者（Zhengmin Huang）是 EZ BioResearch LLC 的总裁，该公司生产本文所述的试剂。

致谢

作者感谢爱荷华大学的研究人员 Luis Tecedor 博士、Ines Martins 博士和 Beverly Davidson 博士在纹状体神经元培养方面的指导与有益建议，以及 Kara Gordon 博士、Nicole Bode 博士和 Pedro Gonzalez-Alegre 博士在基因分型方面的协助与讨论。同时感谢 Eric Weyand 博士（动物识别与标记系统公司）对纹身标记技术的宝贵意见，以及福冈大学的 Shutaro Katsurabayashi 博士对小鼠培养的有益建议。本研究得到了美国心脏协会、美国国防部（同行评审医学研究计划项目 W81XWH-14-1-0301）、肌张力障碍医学研究基金会、小爱德华·马林克罗特基金会、美国国家科学基金会以及怀特霍尔基金会（N.C.H.）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂 - 纹身标记
仪器清洗剂动物识别与标记系统公司NMCR3用于纹身后清洁针头和持针器。
机器干燥剂动物识别与标记系统公司NDAR4用于清洁后干燥针头和针 holder。
新生小鼠纹身用黑色颜料动物识别与标记系统公司NBP01
皮肤准备涂抹器动物识别与标记系统公司NSPA1棉签
皮肤准备液动物识别与标记系统公司NSP01该试剂可提供一层薄油膜，通过以下方式提高纹身效率并防止纹身褪色（来自供应商的信息）：1）防止非纹身部位皮肤发生暂时性染色，从而在将幼鼠放回饲养笼前能够轻松评估脚垫纹身的质量 – 染色的皮肤表面可能与纹身标记的皮肤混淆，2）减少纹身过程中的皮肤损伤 – 软化皮肤并润滑针头有助于针头穿透皮肤时避免造成皮肤损伤，同时可防止分子氧进入皮肤，从而减少由活性氧物质引发的炎症反应。
试剂——基因分型
EZ Fast Tissue/Tail PCR 基因分型试剂盒（条状管格式）EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-1002X PCR Ready Mix 溶液中包含一种用于电泳的红色上样染料。
组织裂解液 AEZ BioResearch LLCG2001-100通过混合制备DNA提取液 20 µl 组织裂解液A的 180 µl 每份样本加入 B 组织裂解液
组织裂解液 BEZ BioResearch LLCG2001-100通过混合配制DNA提取液 20 µl 组织裂解液A的 180 µl 每个样本加入组织裂解液B。
冰醋酸VWRBDH 3092
琼脂糖，优化级，分子生物学级rpiA20090-500 我们使用含 SYBR Safe DNA 染料（稀释 10,000 倍）或溴化乙锭的 2% 琼脂糖凝胶（溶于 TAE 缓冲液）0.5 µg/ml 凝胶体积
溴化乙锭Sigma-AldrichE7637-1G
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）FisherBP120-500
过滤移液器吸头，无气溶胶，0.1-10 µlDot Scientific 公司UG104-96RS 使用无菌且无 DNA、RNase 和 DNase 的移液器吸头。涉及 DNA 的所有步骤均应使用带滤芯的移液器吸头，以避免交叉污染。
过滤吸头，优质贴合滤芯吸头，0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RS使用无菌且不含 DNA、RNase 和 DNase 的移液器吸头。涉及 DNA 的所有步骤均应使用滤芯移液器吸头，以避免交叉污染。
过滤吸头，优质贴合滤芯吸头，1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RS使用无菌且不含 DNA、RNase 和 DNase 的移液器吸头。涉及 DNA 的所有步骤均应使用带滤芯的移液器吸头，以避免交叉污染。
分子量标记物，EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001我们使用以下三种分子量标记物中的任意一种。
分子量标记物，EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
分子量标记物，TrackIt，100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR管，8联管条，带独立圆顶盖，无色，0.2 ml USA Scientific1402-2900使用无菌且不含 DNA、RNase 和 DNase 的离心管。8 连排管比单个离心管更易于操作和分组处理样本。
PCR管，Ultraflux独立装 rpi145660使用无菌且不含DNA、RNase和DNase的离心管。
Seal-Rite 0.5 ml 微量离心管，无色USA Scientific1605-0000使用无菌且不含DNA、RNase和DNase的离心管。
SYBR Safe DNA凝胶染料 * DMSO中10,000倍浓度GIBCO-InvitrogenS33102
Tris 碱rpiT60040-1000
扩增 Tor1a 基因的引物 ΔΔE-torsinA 基因敲入小鼠5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3'（正向）和 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3'（反向）（参考文献18）。引物终浓度为 1.0 ng/µl (~0.16 µM）（参考文献2）。
用于扩增野生型小鼠 Tfap2a 基因的引物5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3'（正向），5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3'（反向），用于扩增498 bp的产物；5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'（正向），5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3'（反向），用于扩增983 bp的产物；以及5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'（正向），5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3'（反向），用于扩增1990 bp的产物。这些引物在 0.5 µM.
试剂 - 细胞培养
5-氟-2′-脱氧尿苷Sigma-AldrichF0503-100MG有关更多信息，请参见尿苷的评论部分。
B-27添加剂GIBCO-Invitrogen17504-044
细胞培养皿 35 × 10 mm，组织培养处理BD falcon353001
细胞培养瓶，T25，组织培养处理，斜颈，插塞密封盖，25 cm²2 生长区域，70 mlBD falcon353082
细胞培养瓶，T75，组织培养处理，斜颈，带通气盖，75 cm²2 生长区，250 mlBD falcon353136
锥形管，聚丙烯，15 mlBD falcon352095
Countess（细胞计数器）计数板GIBCO-InvitrogenC10312
胞嘧啶 β盐酸阿糖胞苷（Ara-C hydrochloride）Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-葡萄糖（右旋糖）无水物，SigmaUltra，99.5%（GC）Sigma-AldrichG7528-250G
培养皿，玻璃制，100 × 15 mmPyrex3160-101
蒸馏水GIBCO-Invitrogen15230-147
DNase II型Sigma-AldrichD4527-200KU储存液配制为 1,500 单位/20 μl 75,000 单位/毫升，溶于蒸馏水中。
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，GlutaMAX，丙酮酸GIBCO-Invitrogen10569-010，500 ml
快速 PES 滤器单元，250 ml，50 mm 直径滤膜 0.2 µm 孔径Nalgene568-0020
快速PES滤器单元，500 ml，90 mm直径膜 0.2 µm 孔径Nalgene569-0020
胎牛血清（FBS）GIBCO-Invitrogen26140-079
玻璃盖玻片，12 mm 圆形，厚度 0.09–0.12 mm，编号 0卡罗来纳633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks平衡盐溶液Sigma-AldrichH2387-10X
HEPES ≥99.5%（滴定）Sigma-AldrichH3375-250G
盐酸，37%，A.C.S 试剂Sigma-Aldrich258148-100 ML
胰岛素Sigma-AldrichI5500-250 mg
七水合硫酸镁，MgSO4•（7H2O)，BioUltra ≥99.5%（Fluka）Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel 基底膜基质溶液，无酚红BD Biosciences356237这是用于盖玻片和培养瓶的包被材料。1) 准备时，将Matrigel基底膜基质溶液置于冰上解冻，通常需要约1天。使用预冷的移液器，在冰上将解冻后的溶液分装至预冷的T25培养瓶中，并将培养瓶保存于-20 °C. 准备工作用Matrigel溶液时，将分装的Matrigel置于冰上的烧瓶中融化，用预冷的MEM溶液稀释50倍，并将稀释后的溶液置于 4 °C1）除在包被盖玻片期间及之后外，所有与Matrigel接触的培养器具和培养基均需预先冷却，以防止Matrigel过早形成凝胶。2）使用Matrigel包被玻璃盖玻片或培养瓶时，将Matrigel溶液均匀涂布于表面。在接种细胞前，必须确保表面完全干燥。为此，可在细胞离心过程中立即用抽吸法去除Matrigel，并留出充足时间使其彻底干燥。
最低必需培养基（MEM）GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ 血清添加剂，5 mlBD Biosciences355006
多孔板，组织培养处理的24孔板BD falcon353047
多孔板，组织培养处理的6孔板BD falcon353046
Neurobasal-A 培养基（1X），液体GIBCO-Invitrogen10888-022
硝酸VWRbdh 3044
NS（神经元补充剂）21 在实验室中制备来源：参考文献69
巴斯德吸管，5 支 ¾” Fisher13-678-6A使用这种带棉塞的 5 ¾” 用于细胞吹打的巴斯德移液管。使用前需将管尖灼烧抛光，以使切割表面平滑，并将内径减小至原始直径的50-80%。管尖过小会损伤细胞并降低细胞存活率，而管尖过大则会降低吹打效率。
巴斯德吸管，9” Fisher13-678-6B
氯化钾（KCl），SigmaUltra， ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
2 ml 血清移液管BD falcon357507
5 ml 血清移液管 BD falcon357543
10 ml 血清移液管BD falcon357551
25 ml 血清移液管BD falcon357525
50 ml 血清移液管 BD falcon357550
碳酸氢钠（NaHCO₃，Sodium hydrogen carbonate），SigmaUltra， ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
氯化钠（NaCl），SigmaUltra， ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
氢氧化钠（NaOH），颗粒，99.998% 痕量金属级Sigma-Aldrich480878-250G
磷酸氢二钠七水合物（Na2HPO4•（7H2（无有效文本可翻译） ≥99.99%，AldrichSigma-Aldrich431478-250G
蔗糖，SigmaUltra， ≥99.5%（GC）Sigma-AldrichS7903-250G
注射器滤器，无菌 0.2 µm康宁431219
注射器，3 mlBD falcon309585
转铁蛋白，全型，牛血浆Calbiochem616420
0.4% 台盼蓝染色液GIBCO-InvitrogenT10282用于计数活细胞/死细胞。若台盼蓝溶液重复使用多次，应更换新的溶液。例如 每周数次，持续数周），因为其会形成沉淀，导致细胞密度读数出现错误。
胰蛋白酶，XI型Sigma-AldrichT1005-5G
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 GIBCO-Invitrogen25200-056
尿苷Sigma-AldrichU3003-5G储备液的配制：将50 mg 5-氟-2'-脱氧尿苷和125 mg 尿苷溶于25 ml DMEM中（终浓度分别为8.12 mM和20.48 mM）。
试剂——免疫细胞化学
抗体，兔多克隆抗MAP2默克密理博AB5622
抗体，小鼠单克隆抗GFAP混合物默克密理博NE1015
设备——纹身标记
目标动物识别与标记系统公司NEO–9该新生啮齿类纹身系统是一种电动装置，通过使单针或三针纹身针快速垂直刺入皮肤而工作。操作时，将纹身针尖保持与皮肤表面垂直，启动纹身仪约0.5秒。我们倾向于使用三针纹身以最大化纹身面积，但单针纹身适用于较狭窄的区域。 例如 脚趾，或需要精细机械控制时 例如 当进行数字纹身时。以最慢速度（设置）进行两轮纹身 "1" 3 个步骤通常足以在足垫上产生可见且持久的纹身标记。
设备——基因分型
电泳系统，水平式，Wide Mini–亚细胞基因分型BIO–RAD170–4405典型的电泳参数为：电场强度 6 V/cm，10 cm 凝胶电泳时间 25 分钟。
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR，MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDU我们对 Tor1a 基因的 PCR 反应 ΔΔE-torsinA 基因敲入小鼠的程序如下：1 个循环的变性步骤在 94 °C 3分钟，35个循环的变性步骤 94 °C 30 秒，退火温度为 58 °C 30秒，延伸在 72 °C 2 分钟。随后进行最终延伸扩增 72 °C 10分钟，然后保持在 4 °C.
电源，PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
设备 - 细胞培养
自动细胞计数仪，CountessGIBCO-InvitrogenC10310该自动细胞计数器可分别测量活细胞和死细胞的密度（分别为未被台盼蓝染色和被台盼蓝染色的细胞）。了解密度测量的最佳范围至关重要：我们所使用的计数器在 1 × 10⁵ 至 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的范围内具有最高的准确性。5 至 4 × 106 细胞/毫升。若测得的细胞密度值超出推荐范围，应适当调整重悬体积。
生物安全柜，II 级，A2 型NUAIRENU-425-400该超净台用于除脑组织解剖外的所有细胞培养操作。
CO2 恒温培养箱，AutoFlow，湿度控制水套NUAIRENU-4850
水平洁净工作台NUAIRENU-201-330此超净台用于脑组织解剖（步骤 3.1.1 和 3.1.2） "脑组织解剖与细胞分离".
Orbit LS 低速摇床LabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus 超速离心机Fisher46910（离心机）/46922（转子）

参考文献

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