动物快速基因分型及脑神经元原代培养的建立

摘要

我们描述了对新生小鼠进行标记和基因分型以及从中建立原代神经元培养物的实验步骤。该基因分型方法快速、高效且可靠，可实现核酸的自动化提取。这对于新生期致死的小鼠及其培养物尤其重要，因为这些实验要求在培养前完成基因分型。

摘要

对哺乳动物神经元形态和功能的高分辨率分析通常需要对个体动物进行基因分型，随后分析其原代神经元培养物。本文介绍了一套完整的操作流程：对需进行基因分型的新生小鼠进行标记、快速基因分型，以及从小鼠中建立低密度脑神经元培养。通过纹身法对单个小鼠进行标记，可实现长期识别，直至成年。本方案所描述的基因分型方法快速高效，能够实现核酸的自动化提取，且可靠性良好。该方法适用于常规基因分型所需时间不足的情况，例如，患有新生儿致死性表型的小鼠。原代神经元培养以低密度方式进行，有利于开展高空间分辨率的成像实验。该培养方法需在神经元接种前预先制备胶质细胞饲养层。本方案整体应用于运动障碍疾病DYT1肌张力障碍的小鼠模型（ΔE-torsinA基因敲入小鼠），并从这些小鼠的海马、大脑皮层和纹状体中制备神经元培养物。本方案也可适用于携带其他遗传突变的小鼠，以及其他物种的动物。此外，该方案的各个独立步骤亦可用于单独的子项目。因此，本方案不仅在神经科学领域，而且在生物医学科学的其他领域均具有广泛的应用前景。

引言

遗传疾病啮齿类动物模型在阐明正常蛋白质和核酸的生理功能，以及这些分子缺陷所导致的病理生理后果方面已被证明十分有用。此类模型包括关键细胞功能相关蛋白缺陷型小鼠，以及阿尔茨海默病等疾病的动物模型。然而，某些基因操作可能导致新生个体在出生后不久或数天内死亡。在此类情况下，原代细胞培养成为一项重要工具，因其可在动物死亡前从胚胎或新生仔鼠中获取活细胞，并维持培养至少数周。 体外在此期间，可通过生物化学、功能性和形态学实验观察早期神经元的发育。对于原代神经元培养，以低密度接种神经元可能更具优势；这使得在高空间分辨率下清晰观察单个胞体、树突、轴突主干及神经末梢成为可能。然而，低密度下神经元的存活与分化通常需要将其接种于胶质细胞饲养层上，或与胶质细胞共培养但无直接物理接触，或使用经胶质细胞条件化处理的培养基进行培养。 ¹.

在胶质细胞饲养层上建立低密度神经元培养物通常需要事先进行快速可靠的基因分型——耗时仅数小时，而非数天。当需要将神经元的基因型与预先制备的胶质细胞饲养层的基因型相匹配时，速度尤为重要。一个更具实际意义的例子是，可能需要决定使用何种基因型的仔鼠进行培养，以优化实验效率。

本文展示了此前发表的研究中所采用的小鼠快速、简化且可靠的基因分型工作流程^2-6。该方法使用小鼠尾部组织和一种 commercially available kit。本方案包含从组织中单步提取核....

方案

注意：本研究中进行的所有动物实验均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 使用脚垫纹身法对小鼠进行长期识别

1. 用拇指和食指固定小鼠足掌，使足垫（掌面）朝向操作者。注意不要夹伤足部。
   注意：稳定的固定至关重要，以确保纹身颜料注入足垫真皮层，从而使标记持久⁷。
2. 用浸有70%乙醇的纱布或棉签擦拭足垫。
3. 将皮肤油涂抹于棉签尖端，轻轻在足垫表面按压数次。仅使用少量皮肤油；过量会阻碍纹身颜料渗透至皮肤。
4. 在纹身前，将纹身针尖浸入纹身墨水中。使用洁净、无菌且锋利的纹身针，以减轻疼痛和感染风险，并提高纹身效率。
5. 在足垫表面涂有皮肤油的情况下，将纹身针尖垂直轻压于足垫中心部位的皮肤，多次注入墨水。有关电动纹身系统的详细信息，请参见材料/设备表。
6. 用70%乙醇喷洒纱布，轻轻按压足部以去除皮肤表面多余的纹身颜料，检查纹身质量。确认足垫中央出现与正常皮肤色素不同的深色圆形斑点。若纹身颜色过浅或面积过小难以辨识，请重复前述纹身步骤。

2. 使用快速PCR基因分型试剂盒对新生小鼠进行基因分型

1. 用70%乙醇消毒小鼠尾尖末端，剪取5 mm或更短的尾尖组织，转移至用于PCR的8联管中的一个管内。每只幼鼠使用新的剃刀刀片，以避免样本间的交叉污染。 alt....

结果

作为本方案应用的示例，展示了通过纹身标记小鼠、在不同实验条件下进行可靠基因分型，以及在胶质细胞饲养层上建立原代神经元培养的代表性结果。

纹身标记

使用纹身标记系统在新生幼鼠的脚垫上进行标记（图1中的“Newborn”）。这些标记在3周龄（“3-week-old”）和32周龄（“32-week-old”）时仍清晰可见。通过四只脚掌上的纹身组合（编号1-16），结合动物笼号信息，或更复杂的编号方案（未展示），可对每只小鼠进行唯一识别。

基因分型

一个基因分型的代表性示例如下（图2）。从新生小鼠尾尖组织中提取的基因组DNA扩增出野生型（Tor1a^+/+）、杂合子型（Tor1a^+/ΔE）和.......

讨论

本文所述方案包括对小鼠进行纹身标记/识别、从小鼠尾尖提取样本进行基因分型，以及低密度培养小鼠脑神经元的操作步骤。在一次使用6-8只新生小鼠的实验中，这些步骤通常分别需要约0.5小时、4小时和2小时，总计6-7小时。这使得单个实验人员能够在小于一个工作日的时间内完成从幼鼠出生到神经元接种培养所需的全部操作（前提是胶质细胞饲养层已预先制备完毕）。

纹身标记

动物的长期标识对于育种以及组织学、细胞功能和动物行为分析等科学研究具有必要性。对新生动物进行纹身标记具有优势，因其操作迅速且可维持动物的大部分生命周期^7,22-25。在足垫上进行纹身标记相较于剪趾标记²³，在保留可检测行为方面更具优势，例如悬吊或抓握行为^22,26，尽管部分研究未观察到此类缺陷（e.g., ²⁵）。纹身后未出现母鼠排斥或吞食幼崽的情况。有关动物长期标识的其他方法，可参见近期综述^7,23,24。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂 - 纹身标记
仪器清洗剂	动物识别与标记系统公司	NMCR3	用于纹身后清洁针头和持针器。
机器干燥剂	动物识别与标记系统公司	NDAR4	用于清洁后干燥针头和针 holder。
新生小鼠纹身用黑色颜料	动物识别与标记系统公司	NBP01
皮肤准备涂抹器	动物识别与标记系统公司	NSPA1	棉签
皮肤准备液	动物识别与标记系统公司	NSP01	该试剂可提供一层薄油膜，通过以下方式提高纹身效率并防止纹身褪色（来自供应商的信息）：1）防止非纹身部位皮肤发生暂时性染色，从而在将幼鼠放回饲养笼前能够轻松评估脚垫纹身的质量 – 染色的皮肤表面可能与纹身标记的皮肤混淆，2）减少纹身过程中的皮肤损伤 – 软化皮肤并润滑针头有助于针头穿透皮肤时避免造成皮肤损伤，同时可防止分子氧进入皮肤，从而减少由活性氧物质引发的炎症反应。
试剂——基因分型
EZ Fast Tissue/Tail PCR 基因分型试剂盒（条状管格式）	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	2X PCR Ready Mix 溶液中包含一种用于电泳的红色上样染料。
组织裂解液 A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	通过混合制备DNA提取液 20 µl 组织裂解液A的 180 µl 每份样本加入 B 组织裂解液
组织裂解液 B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	通过混合配制DNA提取液 20 µl 组织裂解液A的 180 µl 每个样本加入组织裂解液B。
冰醋酸	VWR	BDH 3092
琼脂糖，优化级，分子生物学级	rpi	A20090-500	我们使用含 SYBR Safe DNA 染料（稀释 10,000 倍）或溴化乙锭的 2% 琼脂糖凝胶（溶于 TAE 缓冲液）0.5 µg/ml 凝胶体积
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E7637-1G
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Fisher	BP120-500
过滤移液器吸头，无气溶胶，0.1-10 µl	Dot Scientific 公司	UG104-96RS	使用无菌且无 DNA、RNase 和 DNase 的移液器吸头。涉及 DNA 的所有步骤均应使用带滤芯的移液器吸头，以避免交叉污染。
过滤吸头，优质贴合滤芯吸头，0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	使用无菌且不含 DNA、RNase 和 DNase 的移液器吸头。涉及 DNA 的所有步骤均应使用滤芯移液器吸头，以避免交叉污染。
过滤吸头，优质贴合滤芯吸头，1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	使用无菌且不含 DNA、RNase 和 DNase 的移液器吸头。涉及 DNA 的所有步骤均应使用带滤芯的移液器吸头，以避免交叉污染。
分子量标记物，EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	我们使用以下三种分子量标记物中的任意一种。
分子量标记物，EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
分子量标记物，TrackIt，100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR管，8联管条，带独立圆顶盖，无色，0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	使用无菌且不含 DNA、RNase 和 DNase 的离心管。8 连排管比单个离心管更易于操作和分组处理样本。
PCR管，Ultraflux独立装	rpi	145660	使用无菌且不含DNA、RNase和DNase的离心管。
Seal-Rite 0.5 ml 微量离心管，无色	USA Scientific	1605-0000	使用无菌且不含DNA、RNase和DNase的离心管。
SYBR Safe DNA凝胶染料 * DMSO中10,000倍浓度	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris 碱	rpi	T60040-1000
扩增 Tor1a 基因的引物 ΔΔE-torsinA 基因敲入小鼠			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3'（正向）和 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3'（反向）（参考文献18）。引物终浓度为 1.0 ng/µl (~0.16 µM）（参考文献2）。
用于扩增野生型小鼠 Tfap2a 基因的引物			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3'（正向），5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3'（反向），用于扩增498 bp的产物；5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'（正向），5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3'（反向），用于扩增983 bp的产物；以及5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'（正向），5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3'（反向），用于扩增1990 bp的产物。这些引物在 0.5 µM.
试剂 - 细胞培养
5-氟-2′-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	有关更多信息，请参见尿苷的评论部分。
B-27添加剂	GIBCO-Invitrogen	17504-044
细胞培养皿 35 × 10 mm，组织培养处理	BD falcon	353001
细胞培养瓶，T25，组织培养处理，斜颈，插塞密封盖，25 cm²2 生长区域，70 ml	BD falcon	353082
细胞培养瓶，T75，组织培养处理，斜颈，带通气盖，75 cm²2 生长区，250 ml	BD falcon	353136
锥形管，聚丙烯，15 ml	BD falcon	352095
Countess（细胞计数器）计数板	GIBCO-Invitrogen	C10312
胞嘧啶 β盐酸阿糖胞苷（Ara-C hydrochloride）	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-葡萄糖（右旋糖）无水物，SigmaUltra，99.5%（GC）	Sigma-Aldrich	G7528-250G
培养皿，玻璃制，100 × 15 mm	Pyrex	3160-101
蒸馏水	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase II型	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	储存液配制为 1,500 单位/20 μl 75,000 单位/毫升，溶于蒸馏水中。
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，GlutaMAX，丙酮酸	GIBCO-Invitrogen	10569-010，500 ml
快速 PES 滤器单元，250 ml，50 mm 直径滤膜 0.2 µm 孔径	Nalgene	568-0020
快速PES滤器单元，500 ml，90 mm直径膜 0.2 µm 孔径	Nalgene	569-0020
胎牛血清（FBS）	GIBCO-Invitrogen	26140-079
玻璃盖玻片，12 mm 圆形，厚度 0.09–0.12 mm，编号 0	卡罗来纳	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES ≥99.5%（滴定）	Sigma-Aldrich	H3375-250G
盐酸，37%，A.C.S 试剂	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
胰岛素	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
七水合硫酸镁，MgSO4•（7H2O)，BioUltra ≥99.5%（Fluka）	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel 基底膜基质溶液，无酚红	BD Biosciences	356237	这是用于盖玻片和培养瓶的包被材料。1) 准备时，将Matrigel基底膜基质溶液置于冰上解冻，通常需要约1天。使用预冷的移液器，在冰上将解冻后的溶液分装至预冷的T25培养瓶中，并将培养瓶保存于-20 °C. 准备工作用Matrigel溶液时，将分装的Matrigel置于冰上的烧瓶中融化，用预冷的MEM溶液稀释50倍，并将稀释后的溶液置于 4 °C1）除在包被盖玻片期间及之后外，所有与Matrigel接触的培养器具和培养基均需预先冷却，以防止Matrigel过早形成凝胶。2）使用Matrigel包被玻璃盖玻片或培养瓶时，将Matrigel溶液均匀涂布于表面。在接种细胞前，必须确保表面完全干燥。为此，可在细胞离心过程中立即用抽吸法去除Matrigel，并留出充足时间使其彻底干燥。
最低必需培养基（MEM）	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ 血清添加剂，5 ml	BD Biosciences	355006
多孔板，组织培养处理的24孔板	BD falcon	353047
多孔板，组织培养处理的6孔板	BD falcon	353046
Neurobasal-A 培养基（1X），液体	GIBCO-Invitrogen	10888-022
硝酸	VWR	bdh 3044
NS（神经元补充剂）21	在实验室中制备		来源：参考文献69
巴斯德吸管，5 支 ¾”	Fisher	13-678-6A	使用这种带棉塞的 5 ¾” 用于细胞吹打的巴斯德移液管。使用前需将管尖灼烧抛光，以使切割表面平滑，并将内径减小至原始直径的50-80%。管尖过小会损伤细胞并降低细胞存活率，而管尖过大则会降低吹打效率。
巴斯德吸管，9”	Fisher	13-678-6B
氯化钾（KCl），SigmaUltra， ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
2 ml 血清移液管	BD falcon	357507
5 ml 血清移液管	BD falcon	357543
10 ml 血清移液管	BD falcon	357551
25 ml 血清移液管	BD falcon	357525
50 ml 血清移液管	BD falcon	357550
碳酸氢钠（NaHCO₃，Sodium hydrogen carbonate），SigmaUltra， ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
氯化钠（NaCl），SigmaUltra， ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
氢氧化钠（NaOH），颗粒，99.998% 痕量金属级	Sigma-Aldrich	480878-250G
磷酸氢二钠七水合物（Na2HPO4•（7H2（无有效文本可翻译） ≥99.99%，Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
蔗糖，SigmaUltra， ≥99.5%（GC）	Sigma-Aldrich	S7903-250G
注射器滤器，无菌 0.2 µm	康宁	431219
注射器，3 ml	BD falcon	309585
转铁蛋白，全型，牛血浆	Calbiochem	616420
0.4% 台盼蓝染色液	GIBCO-Invitrogen	T10282	用于计数活细胞/死细胞。若台盼蓝溶液重复使用多次，应更换新的溶液。例如 每周数次，持续数周），因为其会形成沉淀，导致细胞密度读数出现错误。
胰蛋白酶，XI型	Sigma-Aldrich	T1005-5G
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	GIBCO-Invitrogen	25200-056
尿苷	Sigma-Aldrich	U3003-5G	储备液的配制：将50 mg 5-氟-2'-脱氧尿苷和125 mg 尿苷溶于25 ml DMEM中（终浓度分别为8.12 mM和20.48 mM）。
试剂——免疫细胞化学
抗体，兔多克隆抗MAP2	默克密理博	AB5622
抗体，小鼠单克隆抗GFAP混合物	默克密理博	NE1015
设备——纹身标记
目标	动物识别与标记系统公司	NEO–9	该新生啮齿类纹身系统是一种电动装置，通过使单针或三针纹身针快速垂直刺入皮肤而工作。操作时，将纹身针尖保持与皮肤表面垂直，启动纹身仪约0.5秒。我们倾向于使用三针纹身以最大化纹身面积，但单针纹身适用于较狭窄的区域。 例如 脚趾，或需要精细机械控制时 例如 当进行数字纹身时。以最慢速度（设置）进行两轮纹身 "1" 3 个步骤通常足以在足垫上产生可见且持久的纹身标记。
设备——基因分型
电泳系统，水平式，Wide Mini–亚细胞基因分型	BIO–RAD	170–4405	典型的电泳参数为：电场强度 6 V/cm，10 cm 凝胶电泳时间 25 分钟。
FluorChem 8800	ProteinSimple	FluorChem 8800
PCR，MJ Mini Thermal Cycler	BIO-RAD	PTC-1148EDU	我们对 Tor1a 基因的 PCR 反应 ΔΔE-torsinA 基因敲入小鼠的程序如下：1 个循环的变性步骤在 94 °C 3分钟，35个循环的变性步骤 94 °C 30 秒，退火温度为 58 °C 30秒，延伸在 72 °C 2 分钟。随后进行最终延伸扩增 72 °C 10分钟，然后保持在 4 °C.
电源，PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050
设备 - 细胞培养
自动细胞计数仪，Countess	GIBCO-Invitrogen	C10310	该自动细胞计数器可分别测量活细胞和死细胞的密度（分别为未被台盼蓝染色和被台盼蓝染色的细胞）。了解密度测量的最佳范围至关重要：我们所使用的计数器在 1 × 10⁵ 至 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的范围内具有最高的准确性。5 至 4 × 106 细胞/毫升。若测得的细胞密度值超出推荐范围，应适当调整重悬体积。
生物安全柜，II 级，A2 型	NUAIRE	NU-425-400	该超净台用于除脑组织解剖外的所有细胞培养操作。
CO2 恒温培养箱，AutoFlow，湿度控制水套	NUAIRE	NU-4850
水平洁净工作台	NUAIRE	NU-201-330	此超净台用于脑组织解剖（步骤 3.1.1 和 3.1.2） "脑组织解剖与细胞分离".
Orbit LS 低速摇床	Labnet	S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus 超速离心机	Fisher	46910（离心机）/46922（转子）