我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。
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摘要
摘要
生物细胞通常在平坦（二维）表面上进行观察。这种条件并不符合生理状态，且表型和形态具有高度变异性。因此，基于此类环境中的细胞进行的筛选存在严重局限性：细胞器表现出极端表型，细胞形态和大小具有异质性，和/或特定细胞器无法被清晰可视化。此外，体内（in vivo）的细胞位于三维环境中；在此情况下，细胞表现出不同的表型，主要归因于其与周围组织细胞外基质的相互作用。为了在与生理相关的三维环境中标准化并建立单细胞的有序排列，以用于基于细胞的检测，本文报道了一种用于体外（in vitro）三维细胞培养的装置的微加工及其应用。该装置由微腔的二维阵列（通常为105 个微腔/cm2）构成，每个微腔中填充单个细胞或胚胎。细胞的位置、形状、极性及内部组织结构由此得以标准化，呈现出三维结构。我们采用复制模塑技术，在附着于盖玻片的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）上构建出微腔阵列（“蛋杯”状结构）。微腔表面涂覆纤连蛋白以促进细胞黏附。细胞通过离心方式插入。每种系统的填充率均经过优化，最高可达80%。细胞和胚胎的存活率已得到验证。我们将该方法应用于细胞器（如细胞核和高尔基体）的可视化，并用于研究细胞有丝分裂过程中胞质分裂环闭合等活跃过程。该装置有助于识别新特征，例如在胞质分裂环闭合期间肌球蛋白和肌动蛋白的周期性聚集与不均匀分布，以及高尔基体与细胞核排列的紧凑表型。我们针对哺乳动物细胞、裂殖酵母、芽殖酵母和秀丽隐杆线虫（C. elegans）对该方法进行了表征，并在每种情况下进行了特定优化。最后，该装置的特性使其在药物筛选检测和个体化医学中具有特别重要的应用前景。
引言
当前 体外 基于细胞的检测通常采用二维（2D）培养方式。这种培养条件对于哺乳动物细胞而言并非自然状态，因此不具有生理相关性。 1细胞表现出多样化的形态、大小以及异质性的表型。当应用于筛选实验时，这些方法存在额外的严重局限性，例如细胞在平面内分布无序，以及细胞器表型异常（尤其是应力纤维）。这一问题在用于药物测试的临床试验中尤为突出，每年需投入巨额资金。然而，大多数药物在早期药物筛选阶段采用人工的二维培养条件，导致其在后续动物模型实验中失败。此外，使用此类方法无法清晰观察特定的细胞器结构，例如细胞有丝分裂过程中的收缩环（actomyosin ring），以及通常位于观察平面垂直方向上动态变化的其他结构。为克服上述缺陷，已提出一些新型二维检测方法，并由此获得了关于细胞骨架组织的重要发现。 2,3然而，这些检测仍存在一个严重局限性：细胞表现出明显的铺展表型，与实际观察到的情况截然不同 在体内，其中细胞呈现三维结构。这些与培养方法相关的假象可能引发非生理性的特征，例如应力纤维增强 1,4,5.
与二维环境相比，三维细胞培养实验具有多种优势6,7。其生理相关性更高，因此实验结果更具意义。例如，包埋在水凝胶中的细胞可形成类似三维的结构，但其形态在不同细胞之间存在差异8,9。然而，由于细胞形态各不相同，这给筛选应用带来了困难。另一种策略是将单个细胞嵌入微加工制备的微腔中10,11。此时，细胞的位置、形状、极性以及细胞内结构可实现标准化。微腔不仅能为细胞提供类似三维的结构，还适用于高内涵筛选研究10,12-14；可将单个细胞有序排列成微阵列，从而并行观察细胞器及其动态变化。这种规律性使得仅用较少数量的细胞即可获得良好的统计学结果，并提高时间和空间分辨率。有效化合物 更易于被可靠地识别。
本研究展示了用于高内涵筛选应用的一种新型类三维单细胞培养系统的构建与应用10,12,13。该装置由弹性体微腔阵列（105 个腔体/cm2）组成，被称为“卵杯”（EC）。本研究中 EC 的尺寸和总体积已优化至接近细胞分裂期间单个 NIH3T3 和 HeLa 细胞的典型体积。微腔的形态（圆柱形）经过选择，以适当地调控细胞形状，便于对动态过程进行观察。采用复制模塑技术将 EC 阵列加工到粘附于玻璃盖玻片上的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）上15,16。细胞通过离心方式引入 EC 中。本文报道了在三维环境（EC）中细胞器（如肌动蛋白应力纤维、高尔基体和细胞核）的观察结果及其形态标准化，并与相同细胞在二维（平面）表面上的表现进行了比较。我们还报道了对细胞有丝分裂过程中收缩环（由肌动蛋白-肌球蛋白构成）闭合等动态活性过程的观察结果17。最后，我们展示了该方法在其他具有刚性细胞壁的体系中的应用结果，包括芽殖酵母、裂殖酵母和C. elegans胚胎，证实了本方法适用于多种模式生物系统。
接下来，我们将提供一个详细而全面的实验方案，用于制备和应用“卵杯”进行三维微加工。我们的方法简便，无需洁净室环境。我们预计，这一新方法将在药物筛选实验和个性化医疗中具有重要意义，可作为替代 培养皿的新选择。最后，我们的装置将有助于研究细胞对外界刺激响应的分布情况，例如在癌症18 或基础研究19中的应用。
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方案
1. “卵杯”微加工
- 母版制作：微腔阵列
- 加热 3’’ 硅晶圆，最高可达 200 °C，以蒸发掉任何残留的湿气。
- 旋涂一层薄薄的SU-8光刻胶。根据所需的厚度和光刻胶类型，调节树脂用量和旋转速度。该厚度将决定“蛋杯”（EC）的深度。对于30 µm 厚的层，并用 SU-8 2025 以 2,800 rpm 旋涂。
- 在65℃下预烘烤晶圆 °C，1 分钟（2 步中的第 1 步），用于 30 µ微米厚的 SU-8 2025 层。根据所用光刻胶类型和所需厚度调整时间。具体细节请参考制造商提供的数据表。
- 在95℃下预烘烤晶圆 °C，3 分钟（第 2 步，共 2 步），用于 30 µ微米厚的SU-8 2025层。根据所用光刻胶类型和所需厚度调整时间。具体参数请参考制造商的数据表。
- 将晶圆装载到掩模对准仪上进行紫外光曝光。将光刻掩模放置其上。该掩模显示直径为20的圆形特征（圆盘）图案 µ直径为 m。确保彼此之间完全接触。
注意：不同制造商提供光刻掩模。空间分辨率将决定最终成本。醋酸纤维素掩模可提供可接受的分辨率（≈10 µm）成本较低。铬掩膜分辨率更高，但成本也更昂贵。根据细胞体积调整光刻掩膜中圆盘的直径。掩膜上圆盘的尺寸将决定装置中微腔的直径。直径过小会导致填充率低；直径过大则无法有效限制细胞。对于 HeLa 和 NIH3T3 细胞，建议采用 20 µ米到25 µ建议使用 m。 - 照射前检查紫外灯的功率，并据此优化曝光时间。在250 mJ/cm²的强度下照射（波长 = 365 nm）41.5秒（或优化后的曝光时间）。2.
注意：SU-8 2025 是一种负性光刻胶，意味着暴露于紫外光的区域将发生固化。在此情况下，圆形特征部分为黑色，其余部分为透明。正性光刻胶的作用方式相反：未曝光区域被固化。应根据设计图案和光掩膜选择合适的光刻胶。
注意：使用合适的安全眼镜保护眼睛免受紫外线伤害。 - 轻轻地将掩膜从光刻胶层上移除。
- 在 65 ℃ 下对晶圆进行后烘 °C，1 分钟（2 步中的第 1 步），用于 30 µ微米厚的 SU-8 2025 层。将晶圆在 95 °C 下后烘烤 °C，3 分钟（第 2 步，共 2 步），用于 30 µ微米厚的 SU-8 2025 层。根据所用光刻胶类型和所需厚度调整时间。具体参数请参考制造商提供的数据表。之后 后烘后，将晶圆在实验台上冷却至室温，约1分钟。
- 将晶圆置于匀胶机中，滴加数毫米SU-8显影液以覆盖整个晶圆表面。显影2分钟，然后以1,000 rpm转速匀胶30秒。重复该步骤三次。
- 用2-丙醇冲洗，以确保完全去除未曝光的SU-8。若出现白色区域，表明显影不完全。若如此，需额外重复一次显影步骤。
- 在200℃下硬烤晶圆 °C 以确保所制备微结构的稳定性。此步骤为可选。
- 3储存’’ 内含微结构的晶圆置于94 mm × 15 mm聚苯乙烯培养皿中。
注意：后续步骤无需进行表面处理，特别是硅烷化处理。
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制件的制备：柱状阵列
- 将交联剂与预聚物按1:10（w/w）的比例在50 ml离心管中充分混合，总质量为30 g。
注：使用1:10（v/v）的比例同样有效。 - 以 1,800 × g 离心 5 分钟，以去除气泡。
- 将PDMS轻轻滴加到微结构上方。
注意：如果此步骤中出现气泡，需使用真空泵对样品脱气15–20分钟。 - 将样品置于65 °C的烘箱中 °4小时，4°C
注意：固化时间因使用者而异，且与交联剂与预聚物的比例有关。该时间将决定聚二甲基硅氧烷（PDMS）的刚性。建议固化时间超过2小时，并保持固定的固化时间。 - 使用手术刀轻轻切割约1 cm的感兴趣区域（印章）2 约包含105 微腔或“蛋杯”结构
注意：先切割聚二甲基硅氧烷（PDMS），然后轻轻剥离。使用光学显微镜检查PDMS复制品的质量。
- 将交联剂与预聚物按1:10（w/w）的比例在50 ml离心管中充分混合，总质量为30 g。
- 通过复制 molding 制备“蛋杯”结构。以下将介绍两种制备“蛋杯”的替代策略。两种方案相似，且可获得相同结果：
- 策略 1
- 使用氧气等离子体处理制备好的PDMS印章30秒以激活表面。将激活后的印章暂时存放在密闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。
注意：若使用其他气体进行等离子处理，需调整曝光时间。 - 将活化后的PDMS印模（带结构的一面）正面朝上放置于培养皿中，并紧邻一个15 ml离心管管盖。向管盖中加入200 μL细胞悬液 µl 的三甲基氯硅烷（TMCS）。关闭培养皿，使印章硅烷化 7 分钟。
注意：印章上可能出现一些暂时性形变和/或颜色变化（白色）。印章将在短时间内恢复其原始形状，且结构不会受到影响。
注意：TMCS 具有急性吸入和皮肤毒性，且高度易燃（可在较远距离内发生点火回火）。因此，应在远离火源的通风橱中使用。 - 将PDMS印章放置在旋涂仪上，使结构面朝上。滴加少量几微升（约20 µl) 在结构上方加入液态PDMS（交联剂与预聚物质量比为1:10），以1,500 rpm转速旋涂30秒，在结构表面形成一层薄PDMS。
注意：如果印章无法适配匀胶机卡盘，请将印章置于培养皿盖上方，培养皿盖中心需开有小孔。 - 将印模置于65℃的烘箱中 °在沉积的旋涂 PDMS 层上于 65 °C 下固化 4 小时。
- 将PDMS印章倒置放置，并与直径为25 mm的#0号玻璃盖玻片一同放入氧气等离子体清洗仪中，对薄PDMS层进行活化处理，处理时间为30秒。随后立即进行下一步操作。
注意：也可使用其他厚度、形状和尺寸的盖玻片。然而，根据所选盖玻片的厚度以及物镜的放大倍数、数值孔径（NA）和/或工作距离，某些细胞结构可能难以观察。请查阅物镜的技术参数表。 - 将印模（带有薄旋涂层的一面）与玻璃盖玻片接触。用镊子轻轻按压印模表面四周，以实现“粘合”。最后，在印模顶部保持恒定压力约10秒。
- 30分钟后，轻轻将印模从盖玻片上剥离，以“释放”出“蛋杯”结构（参见 图1）。用乙醇充分冲洗并干燥。如果聚二甲基硅氧烷（PDMS）“蛋杯”在玻璃盖玻片上粘附不良（即 若在“剥离”步骤中发生脱落，请考虑调整等离子清洗仪的设置，并返回步骤 1.3.1.5 重新开始。
注意：此步骤较为精细，需小心操作，避免盖玻片破裂和/或薄PDMS层脱落。 - 在盖玻片边缘用一滴液态PDMS粘附一块体积为1 mm × 1 mm × 3 mm的固化PDMS小片（手柄），并如前所述进行固化。这将有助于后续对样品的操作（参见 图1此步骤为可选步骤。
- 使用氧气等离子体处理制备好的PDMS印章30秒以激活表面。将激活后的印章暂时存放在密闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。
- 策略 2
- 通过氧气等离子体处理30秒，使制备的PDMS印章亲水化。将活化的印章暂时存放在密闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。
注意：若使用其他气体进行等离子处理，需调整曝光时间。 - 使用15 W的氧气等离子体处理25 mm直径的#0玻璃盖玻片30秒以使其亲水化。随后立即进行下一步操作。
注意：也可使用其他厚度、形状和尺寸的盖玻片。然而，根据所选盖玻片的厚度和物镜特性，细胞结构的观察可能会变得困难（见上述说明）。 - 在玻璃盖玻片上滴加少量几微升的PDMS（交联剂：预聚物质量比为1:10）。以1,500 rpm转速旋涂30秒，最终厚度约为50 µ微米
- 在盖玻片边缘用一滴液态PDMS粘附一块体积为1 mm × 1 mm × 3 mm的固化PDMS小块（手柄），然后像之前一样固化PDMS。这将有助于后续对样品的操作（参见 图1此步骤为可选步骤。
- 将涂有PDMS的盖玻片暂时存放在培养皿内的洁净擦拭纸上，以防止灰尘沉积。
- 滴加一滴硅烷化试剂 将试剂滴加到每个印章顶部，静置使其挥发1-2分钟，然后在氮气流下干燥2.
注意：在此步骤中，蒸发过程中可观察到印章发生暂时性形变。使用氮气干燥后，印章将恢复其原始形状。2 微结构无任何永久性形变。 - 将硅烷化印模非常轻柔地放置在培养皿中存放的、涂有旋涂PDMS的玻璃盖玻片上。确保接触过程中两者完全平行。印模放置到PDMS涂层的盖玻片后，避免按压或移动印模。
- 将含有样品的培养皿置于真空环境中1-2小时，以去除气泡。
注意：确保样品完全水平，以避免印模移位。同时避免真空泵可能引起的振动。 - 将样品置于65 ℃的烘箱中 °4小时，温度为C
- 轻轻剥离印章，露出“蛋杯”结构。用乙醇彻底冲洗并晾干。
注意：此时需要进行练习。注意避免盖玻片破裂和/或薄PDMS层脱落。
- 通过氧气等离子体处理30秒，使制备的PDMS印章亲水化。将活化的印章暂时存放在密闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。
- 策略 1
2. 将细胞引入“蛋杯”结构
为了将哺乳动物细胞引入“蛋杯”结构中，需要使用细胞外基质的黏附蛋白对PDMS表面进行功能化处理。本示例使用纤维连接蛋白，但也可使用其他感兴趣的蛋白，如胶原蛋白。
- 在氧等离子体清洗仪中将“蛋杯”亲水化处理30秒。
注意：如有需要，可优化参数。 - 在1× PBS中配制20的溶液 µg ml-1 来自牛源的纤连蛋白
- 用紫外光对“eggcup”灭菌5分钟。滴加少量液体（约20-50 μL） µ加入适量纤连蛋白溶液以完全覆盖“蛋杯”区域，在室温下孵育1小时。注意防止样品干燥。
- 用 1× PBS 轻柔冲洗“蛋杯”结构，重复 3 次。
注意：样品可立即使用或于4℃保存 °在黑暗中于 C 温度下孵育数周。 - 将一个圆柱形定制塑料件（高63 mm，外半径26 mm，内半径7 mm）插入50 ml离心管中（参见 图2) 20
警告：请使用经紫外线灭菌的物品，或在使用前进行灭菌处理。
注意：该装置可轻松在实验室中或通过任何可用的机械加工车间制备。 - 将13 ml细胞培养基加入试管中（参见 表1培养基应至少高出圆柱形部件2 cm，以确保样品完全浸没。
注意：有关特定细胞类型及其他模型系统（如酵母或 秀丽隐杆线虫 胚胎以及所用的相应培养基，请参见第5节 表1. 本方案已针对HeLa、NIH3T3细胞及其他细胞系进行优化（见 表 1). - 非常轻柔地将“蛋杯”装置沿塑料件上侧平行放入管中。使用尖头镊子夹住PDMS手柄以固定样品。轻轻按压盖玻片，使其完全贴合于塑料件的上表面，直至完全浸入（见 图2).
注意：建议使用尖头直镊。使用弯镊时，样品操作困难，可能导致破损。 - 在 P60 培养皿中培养细胞至 80–100% 汇合度，通过胰蛋白酶消化法收集细胞。
注：细胞可以是野生型、转染的，或用任何感兴趣的药物处理的。
注意：避免形成细胞聚集体，否则会阻碍单个细胞进入微腔 ‘‘卵杯’。为优化此步骤，胰蛋白酶消化后应充分吹打混匀。 - 将细胞重悬于5 ml培养基中。用移液器加入200 µ‘eggcups’顶部的细胞层
注意：将细胞尽可能居中滴加在“蛋杯”上方，但避免物理接触。这可以防止样品破损或损伤。 - 以 1,800 × g 离心 2 分钟。
注意：首次离心后，需在显微镜下检查“蛋杯”结构的填充百分比。 - 再次用移液器吸取 200 µ将细胞悬液加入“蛋杯”顶部，以1,800 × g离心2分钟。重复此步骤共三次，以优化填充率。
注意：最后一次离心后，需在显微镜下检查“蛋杯”的填充百分比。如有必要，重复加样和离心步骤，直至达到理想的填充百分比。 - 用尖头镊子夹住PDMS手柄，将样品从管中取出。注意操作时需小心，避免扰动位于“蛋杯”结构中的细胞（参见 图2).
- 将样品放入含有培养基的培养皿中。用移液器在微结构阵列的每一侧（共4侧）轻轻吹打3次，以洗去未进入“蛋杯”结构的多余细胞。
注意：移液操作过猛可能会使部分细胞从“蛋杯”结构中脱离。 - 更换新鲜培养基以去除未贴壁的细胞。
注意：在此步骤中可添加目标药物。 - 固定细胞或准备进行延时成像。参见步骤 4.1。
3. “蛋杯”中活性细胞动态的观察：胞质分裂环的闭合
注意：本示例使用转染了 MYH10-GFP 和 Lifeact-mcherry 的 HeLa 细胞，分别用于标记肌球蛋白和肌动蛋白，这两种是细胞有丝分裂过程中胞质分裂环闭合的关键活性分子。该装置的微腔直径为 25 µm。观察时使用配备 60X 油镜（1.40 NA，DIC，Plan Apo）以及 GFP（肌球蛋白）和 TxRed（肌动蛋白）滤光片的倒置落射荧光显微镜。也可选用直立共聚焦显微镜，配备 25X 或 63X HCX IR APO L 水镜（0.95 NA）。对于本示例，强烈建议通过双胸苷阻断、有丝分裂阻断或有丝分裂震荡法对细胞进行同步化处理21-24。
注意：用于制作“蛋杯”结构的 PDMS 厚度允许在倒置和直立显微镜上使用多种物镜。
- 将“蛋杯”放入显微镜载物台，并加入 1 ml 含 10% FCS 的 L-15 观察培养基。为防止蒸发，可在载物台上加盖玻璃盖片，或在培养基表面覆盖一层薄薄的矿物油。选择 60X 油镜物镜。
注意：L-15 培养基适用于无 CO2 环境。另请注意，DMEM 中某些成分具有自发荧光。若使用该培养基，建议用高强度光源照射 1–2 小时，以光漂白荧光成分。
注意：在进行微分干涉差（DIC）成像时，避免使用塑料盖片。 - 将装有“蛋杯”和观察培养基的载物台置于显微镜下，使用明场照明仔细调焦，直至“蛋杯”与细胞处于同一观察平面。
- 打开软件并调整参数。为肌动蛋白和肌球蛋白分别选择 TxRed 和 GFP 滤光片；调整各通道的曝光时间。通常两个通道的采集间隔为 5 秒。
注意：曝光时间需根据所用设备、染料或其他目标细胞器的具体情况适当调整。 - 选择感兴趣区域，并通过 GFP 或 TxRed 通道寻找分裂环结构，准确调焦。
注意：肌球蛋白信号中的分裂环轮廓更清晰，更易于识别。 - 在两个通道中启动自动采集，直至分裂环完全闭合。
注意：可能会观察到一定程度的光漂白现象。请调整显微镜参数以尽量减少该现象。
4. 在“蛋杯”中观察固定细胞器
此步骤可在步骤 #3 之前或之后进行。细胞可在离心后直接固定，用于目标细胞器的染色，或在显微镜下观察后再进行固定和染色。本示例展示了在“蛋杯”结构中对 NIH3T3 成纤维细胞的高尔基体、细胞核和肌动蛋白纤维进行染色的结果。
- ‘蛋杯’中细胞的固定
- 配制3%多聚甲醛（PFA），37 °C预热。将‘蛋杯’样品从50 ml离心管（或显微镜载物台）中取出，放入P35培养皿中。用1× PBS冲洗一次。
注意：3%多聚甲醛的配制方案可参考其他广泛使用的文献。
注意：配制PFA时需佩戴腈类手套并佩戴护目镜。 - 完全吸除PBS，加入1 ml 3% PFA，孵育17分钟。吸除PFA后，用1 ml 1× PBS冲洗两次。使用1 ml 0.5% Triton通透细胞3分钟，再用1× PBS洗涤两次，每次5分钟。
- 配制3%多聚甲醛（PFA），37 °C预热。将‘蛋杯’样品从50 ml离心管（或显微镜载物台）中取出，放入P35培养皿中。用1× PBS冲洗一次。
- ‘蛋杯’中细胞的染色
- 用1:500稀释的兔多克隆抗Giantin一抗在PBS中孵育细胞，用于高尔基体染色。将100 µl抗体溶液滴加在塑料薄膜上，将‘蛋杯’倒置覆盖于液滴上，孵育45分钟。
注意：需加盖保护样品，防止干燥。 - 小心取下‘蛋杯’，将其放入P35培养皿中。用1× PBS冲洗3次，每次5分钟。
- 在PBS中配制含二抗Cy3标记的山羊抗兔抗体（1:1,000）和Phalloidin Alexa Fluor 488（1:200）的混合液，用于染色肌动蛋白应力纤维。
- 将100 µl抗体混合液滴加在塑料薄膜上，将‘蛋杯’倒置覆盖于液滴上，孵育45分钟。
- 小心取下‘蛋杯’，将其放入P35培养皿中。用1× PBS冲洗3次，每次5分钟。
- 进行细胞核染色：将100 µl含1 µg ml-1 DAPI的PBS溶液滴加在塑料薄膜上，将‘蛋杯’倒置覆盖于液滴上，孵育45分钟。此步骤可与步骤4.2.3同时进行。
- 小心取下‘蛋杯’，将其放入P35培养皿中。用1× PBS冲洗3次，每次5分钟。
- 在标准显微镜载玻片上滴加15 µl甘油:PBS（1:1 v/v）封片液，将细胞封片，并用指甲油密封以防止干燥。
注意：根据‘蛋杯’的厚度，封片操作可能较困难。建议将样品保存在含PBS的P35培养皿中，并防止干燥。
- 用1:500稀释的兔多克隆抗Giantin一抗在PBS中孵育细胞，用于高尔基体染色。将100 µl抗体溶液滴加在塑料薄膜上，将‘蛋杯’倒置覆盖于液滴上，孵育45分钟。
- 显微镜观察
注意：本示例使用配备PMT和混合探测器的正置共聚焦显微镜。选用25X或63X HCX IR APO L水镜（0.95 NA），以获得较宽的视野，并展示该装置在高内涵筛选应用中的适用性。- 选择25X或63X水镜。
注意：可根据具体应用和信号选择不同物镜，但建议使用高数值孔径物镜。 - 将固定的‘蛋杯’样品置于载物台上，使用明场光（相差或微分干涉DIC）仔细调焦，直至‘蛋杯’和细胞处于观察平面。
- 打开软件并调整参数。分别选择GFP、Cy3和DAPI滤光片用于观察肌动蛋白、高尔基体和细胞核；调整各通道的曝光时间。
注意：曝光时间需根据具体设备设置进行调整。 - 选择并聚焦目标区域，开始图像采集（见图3）。
- 选择25X或63X水镜。
5. 酵母细胞观察的适配方法及 秀丽隐杆线虫 胚胎
- 裂殖酵母和芽殖酵母细胞
注意：本示例使用带有 RLC1-mcherry 和 CHD-GFP 标记的裂殖酵母细胞，分别用于标记肌球蛋白和肌动蛋白。本实验中芽殖酵母细胞未进行荧光标记。观察裂殖酵母时采用倒置旋转盘共聚焦显微镜。所有图像采集均使用 100X HCX PL APO CS 油镜（1.4 NA）。此外，也可使用配备 20X 相差空气物镜 LCPlanFl（0.4 NA）的倒置相差显微镜进行观察。本示例中，两种细胞类型的实验方案完全相同。- 按上述方法制备“蛋杯”表面。对于裂殖酵母和芽殖酵母细胞，制备直径为 5 µm 的微腔（见表 1）。此情况下，表面无需用黏附蛋白进行功能化处理。
注意：可通过使用锥形“蛋杯”优化填充率。该形状有助于捕获并保留细胞，避免在离心后的洗涤步骤中细胞脱落。填充率最高可达 约 80%。此类锥形“蛋杯”可通过深反应离子刻蚀技术制备13。 - 在适当的培养基中培养酵母细胞（见表 1），直至光密度（OD）达到 0.2 至 0.8 范围。对酵母培养物进行超声处理以去除聚集体。
- 通过离心将酵母细胞装入“蛋杯”中。离心时，将 4 ml 处于合适 OD 值的培养细胞加入含有“蛋杯”的离心管中。第一次离心后，轻轻振荡离心管，使未进入“蛋杯”的细胞重新悬浮，而位于“蛋杯”内的细胞不受干扰。无需打开离心管，再次离心，并重复此步骤两次。该操作可确保培养物中的细胞沉积至空的微腔中，从而提高填充率。
注意：进行酵母实验时，建议在实验过程中将离心机预热至工作温度
注意：本实验方案可在此处暂停，并在最多 12 小时内继续进行。此时应将样品保存在工作温度下，并覆盖以防止蒸发。 - 将“蛋杯”放入显微镜样品 holder 中，并用滤膜除菌的培养基填充 holder 以进行成像。随后用相同培养基冲洗样品，直至有效去除游离的酵母细胞。冲洗过程中注意不要扰动“蛋杯”中的细胞。
- 选择 100X 油镜并仔细调焦。打开软件并调整参数。对于裂殖酵母，选择 GFP 和 TxRed 滤光片分别用于肌动蛋白和肌球蛋白，并调整两个通道的曝光时间。典型的图像采集间隔为 3 秒。
注意：根据荧光染料种类、标记方式及设备配置的不同，其他系统的曝光时间可能有所差异。
- 按上述方法制备“蛋杯”表面。对于裂殖酵母和芽殖酵母细胞，制备直径为 5 µm 的微腔（见表 1）。此情况下，表面无需用黏附蛋白进行功能化处理。
- C. elegans 胚胎
注意：本示例使用宽度为 25–30 µm、长度为 50–55 µm 的C. elegans胚胎。胚胎培养方法如文献25所述。有关操作C. elegans的简单可视化方案可参见文献26。观察使用配备 40X 空气物镜（0.55 NA）的倒置相差显微镜进行。- 按上述方法制备“蛋杯”表面，直径为 25 µm（见表 1）。此情况下，表面无需用黏附蛋白进行功能化处理。
- 在适当的培养基中培养C. elegans胚胎（见表 1）。
- 如上所述（见第 2.6 至 2.12 节），通过离心将胚胎装入“蛋杯”中，使用超纯水作为培养介质。
注意：在实验持续时间内，胚胎在超纯水中表现正常。对于长期实验，可选用生理 M9 缓冲液作为替代。 - 按上述方法冲洗样品（见第 2.14 节）。将“蛋杯”放入显微镜样品 holder 中。选择 40X 空气物镜并仔细调焦。打开软件并调整参数。设置图像采集间隔为 3 秒。
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结果
“蛋杯”（EC）是一种新型的高内涵筛选方法，可在三维环境中实现对定向细胞和胚胎的可视化观察。此外，一些在标准二维（平面）培养中难以观察到的细胞过程，也可通过这一新方法进行观察。图1a展示了EC微加工流程的概要（另见上述方案中的第1部分）。该方法操作简便、快速、高效，且无需特殊设备。图1b和图1c分别为“蛋杯”的宏观图像和放大后的扫描电子显微镜图像。如图所示，其形状和尺寸非常规整。该方法具有高度灵活性，可轻松制备不同形状和尺寸的结构，并适用于不同的模型系统。“蛋杯”的尺寸选择依据如下：在二维表面上测量进行分裂的细胞的尺寸，这些细胞呈球形，其直径被作为确定EC直径的良好参考指标。例如，细胞在“蛋杯”中会沿其长轴伸长并定向排列。该尺寸取决于具体的细胞和胚胎系统，因此需针对每种情况分别评估。
图2展示了所需的材料（图2a）以及使用“蛋杯”（‘eggcups’）的逐步操作流程（图2b）（另见...
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讨论
采用复制模塑技术制备“蛋杯”结构。该 fabrication 过程无需洁净室环境，操作简便，但可能需要一定的实践经验。其中，脱模步骤是获得大面积高质量“蛋杯”的最关键环节，因此需特别谨慎操作。若反复出现脱模失败，建议优化等离子清洗仪在硅烷化及等离子键合前的参数。硅烷化不充分会导致印章与 PDMS 薄膜之间粘连过强。若观察到此现象，应延长硅烷化试剂孵育时间。 可增加试剂用量。需注意，还可采用其他技术与材料制备“蛋杯”结构，并可利用多种配体（纤连蛋白、明胶、胶原蛋白）对其进行功能化修饰。 等等。）。特别是，可使用定制的热压印技术在聚苯乙烯材料上轻松制备微腔结构，从而确保生物相容性，并能与标准培养皿中获得的结果进行直接比较。同样，为优化填充率，需要特别注意操作细节并积累实践经验。其中，清洗步骤尤为关键，需确保微腔适当填充，同时避免细胞过量，以免增加信号的噪声和背景干扰。若细胞容易从微腔中脱落，可考虑调整微腔的尺寸或深度。
“蛋杯”结构通过简单的操作流程为细胞提供类似三维的培养环境，并适用于高内涵筛选分析。通过将单个细胞置入独立的微腔（“蛋杯”）中，可轻松观察在...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢 L. Brino（法国伊尔基希IGBMC高通量筛选平台）提供抗Giantin抗体，M. Labouesse 实验室（IGBMC）提供 C. elegans，B. Séraphin 实验室（IGBMC）提供芽殖酵母，E. Paluch 和 A. Hyman（德国德累斯顿MPI-CBG）提供荧光标记的HeLa细胞，J. Moseley（达特茅斯医学院）和 J.Q. Wu（俄亥俄州立大学）提供裂殖酵母细胞；感谢 A. Hoël 和 F. Evenou 提供实验协助，C. Rick（法国斯特拉斯堡IBMC）提供技术帮助，以及 J.C. Jeannot（法国Femto-st）在微加工方面的协助。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、斯特拉斯堡大学、Conectus、法国医学研究基金会以及斯特拉斯堡ci-FRC的资金支持。
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材料
参考文献
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