我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。
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摘要
摘要
生物细胞通常在平坦（二维）表面上进行观察。这种条件并不符合生理状态，且表型和形态具有高度变异性。因此，基于此类环境中的细胞进行的筛选存在严重局限性：细胞器表现出极端表型，细胞形态和大小具有异质性，和/或特定细胞器无法被清晰可视化。此外，体内（in vivo）的细胞位于三维环境中；在此情况下，细胞表现出不同的表型，主要归因于其与周围组织细胞外基质的相互作用。为了在与生理相关的三维环境中标准化并建立单细胞的有序排列，以用于基于细胞的检测，本文报道了一种用于体外（in vitro）三维细胞培养的装置的微加工及其应用。该装置由微腔的二维阵列（通常为105 个微腔/cm2）构成，每个微腔中填充单个细胞或胚胎。细胞的位置、形状、极性及内部组织结构由此得以标准化，呈现出三维结构。我们采用复制模塑技术，在附着于盖玻片的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）上构建出微腔阵列（“蛋杯”状结构）。微腔表面涂覆纤连蛋白以促进细胞黏附。细胞通过离心方式插入。每种系统的填充率均经过优化，最高可达80%。细胞和胚胎的存活率已得到验证。我们将该方法应用于细胞器（如细胞核和高尔基体）的可视化，并用于研究细胞有丝分裂过程中胞质分裂环闭合等活跃过程。该装置有助于识别新特征，例如在胞质分裂环闭合期间肌球蛋白和肌动蛋白的周期性聚集与不均匀分布，以及高尔基体与细胞核排列的紧凑表型。我们针对哺乳动物细胞、裂殖酵母、芽殖酵母和秀丽隐杆线虫（C. elegans）对该方法进行了表征，并在每种情况下进行了特定优化。最后，该装置的特性使其在药物筛选检测和个体化医学中具有特别重要的应用前景。
引言
当前 体外 基于细胞的检测通常采用二维（2D）培养方式。这种培养条件对于哺乳动物细胞而言并非自然状态，因此不具有生理相关性。 1细胞表现出多样化的形态、大小以及异质性的表型。当应用于筛选实验时，这些方法存在额外的严重局限性，例如细胞在平面内分布无序，以及细胞器表型异常（尤其是应力纤维）。这一问题在用于药物测试的临床试验中尤为突出，每年需投入巨额资金。然而，大多数药物在早期药物筛选阶段采用人工的二维培养条件，导致其在后续动物模型实验中失败。此外，使用此类方法无法清晰观察特定的细胞器结构，例如细胞有丝分裂过程中的收缩环（actomyosin ring），以及通常位于观察平面垂直方向上动态变化的其他结构。为克服上述缺陷，已提出一些新型二维检测方法，并由此获得了关于细胞骨架组织的重要发现。 2,3然而，这些检测仍存在一个严重局限性：细胞表现出明显的铺展表型，与实际观察到的情况截然不同 在体内，其中细胞呈现三维结构。这些与培养方法相关的假象可能引发非生理性的特征，例如应力纤维增强 1,4,5.
与二维环境相比，三维细胞培养实验具有多种优势6,7。其生理相关性更高，因此实验结果更具意义。例如，包埋在水凝胶中的细胞可形成类似三维的结构，但其形态在不同细胞之间存在差异8,9。然而，由于细胞形态各不相同，这给筛选应用带来了困难。另一种策略是将单个细胞....
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方案
1. “卵杯”微加工
- 母版制作：微腔阵列
- 加热 3’’ 硅晶圆，最高可达 200 °C，以蒸发掉任何残留的湿气。
- 旋涂一层薄薄的SU-8光刻胶。根据所需的厚度和光刻胶类型，调节树脂用量和旋转速度。该厚度将决定“蛋杯”（EC）的深度。对于30 µm 厚的层，并用 SU-8 2025 以 2,800 rpm 旋涂。
- 在65℃下预烘烤晶圆 °C，1 分钟（2 步中的第 1 步），用于 30 µ微米厚的 SU-8 2025 层。根据所用光刻胶类型和所需厚度调整时间。具体细节请参考制造商提供的数据表。
- 在95℃下预烘烤晶圆 °C，3 分钟（第 2 步，共 2 步），用于 30 µ微米厚的SU-8 2025层。根据所用光刻胶类型和所需厚度调整时间。具体参数请参考制造商的数据表。
- 将晶圆装载到掩模对准仪上进行紫外光曝光。将光刻掩模放置其上。该掩模显示直径为20的圆形特征（圆盘）图案 µ直径为 m。确保彼此之间完全接触。
注意：不同制造商提供光刻掩模。空间分辨率将决定最终成本。醋酸纤维素掩模可提供可接受的分辨率（≈10 µm）成本较低。铬掩膜分辨率更高，但成本也更昂贵。根据细胞体积调整光刻掩膜中圆盘的直径。掩膜上圆盘的尺寸将决定装置中微腔的直径。直径过小会导致填充率低；直径过大则无法....
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结果
“蛋杯”（EC）是一种新型的高内涵筛选方法，可在三维环境中实现对定向细胞和胚胎的可视化观察。此外，一些在标准二维（平面）培养中难以观察到的细胞过程，也可通过这一新方法进行观察。图1a展示了EC微加工流程的概要（参见上述方案中的第1部分）。该方法简单、快速、高效，且无需特殊设备。图1b和图1c分别为“蛋杯”的大尺度图像及其放大的扫描电子显微镜图像。如图所示，其形状和尺寸非常规整。该方法具有高度灵活性，可轻松制备不同形状和尺寸的结构，并适用于不同的模式系统。“蛋杯”的尺寸选择依据如下：在二维表面上测量进行分裂的细胞的尺寸，这些细胞呈球形，其直径被作为确定EC直径的良好参考指标。例如，细胞在“蛋杯”中会沿其长轴伸长并定向排列进行细胞分裂。该尺寸取决于具体的系统——即细胞和胚胎类型，因此需针对每种情况分别评估。
图2展示了所需的材料（图2a）以及使用“蛋杯”（‘eggcups’）的逐步操作流程（图2b
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讨论
采用复制模塑技术制备“蛋杯”结构。该 fabrication 过程无需洁净室环境，操作简便，但可能需要一定的实践经验。其中，脱模步骤是获得大面积高质量“蛋杯”的最关键环节，因此需特别谨慎操作。若反复出现脱模失败，建议优化等离子清洗仪在硅烷化及等离子键合前的参数。硅烷化不充分会导致印章与 PDMS 薄膜之间粘连过强。若观察到此现象，应延长硅烷化试剂孵育时间。 可增加试剂用量。需注意，还可采用其他技术与材料制备“蛋杯”结构，并可利用多种配体（纤连蛋白、明胶、胶原蛋白）对其进行功能化修饰。 等等。）。特别是，可使用定制的热压印技术在聚苯乙烯材料上轻松制备微腔结构，从而确保生物相容性，并能与标准培养皿中获得的结果进行直接比较。同样，为优化填充率，需要特别注意操作细节并积累实践经验。其中，清洗步骤尤为关键，需确保微腔适当填充，同时避免细胞过量，以免增加信号的噪声和背景干扰。若细胞容易从微腔中脱落，可考虑调整微腔的尺寸或深度。
“蛋杯”结构通过简单的操作流程为细胞提供类似三维的培养环境，并适用于高内涵筛选分析。通过将单个细胞置入独立的微腔（“蛋杯”）中，可轻松观察在.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢 L. Brino（法国伊尔基希IGBMC高通量筛选平台）提供抗Giantin抗体，M. Labouesse 实验室（IGBMC）提供 C. elegans，B. Séraphin 实验室（IGBMC）提供芽殖酵母，E. Paluch 和 A. Hyman（德国德累斯顿MPI-CBG）提供荧光标记的HeLa细胞，J. Moseley（达特茅斯医学院）和 J.Q. Wu（俄亥俄州立大学）提供裂殖酵母细胞；感谢 A. Hoël 和 F. Evenou 提供实验协助，C. Rick（法国斯特拉斯堡IBMC）提供技术帮助，以及 J.C. Jeannot（法国Femto-st）在微加工方面的协助。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、斯特拉斯堡大学、Conectus、法国医学研究基金会以及斯特拉斯堡ci-FRC的资金支持。
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材料
参考文献
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009)....
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重印与许可
