方法文章

订货单细胞和单胚胎的三维约束：高内涵筛选新设备

DOI：

10.3791/51880

⸱

2016年9月18日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们报告的设备和新的方法来研究细胞和胚胎。单细胞精确下令微阵列。他们的3D坐月子是朝着在生理条件下遇到的3D环境的一个步骤，并允许细胞器的方向。通过控制细胞的形状，此设置最大限度地减少可变性中的标准试验的报道。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物细胞通常在平面（2D）表面观察。这种条件是不生理和表型和形状是高度可变的。根据在这种环境中的细胞筛选具有因而严重的局限性：细胞器显示极端的表型，细胞形态和尺寸是异质和/或特定的细胞器无法正确显示。此外， 在体内细胞位于3D环境;在这种情况下，细胞表现出不同的表型的，主要是因为它们与组织的周围的细胞外基质相互作用的。为了标准化和产生单个细胞中对基于细胞的测定生理相关的3D环境的次序，我们在这里报告的装置的用于体外三维细胞培养物的微加工和应用。此装置由微腔的2D阵列（通常是10 5的空腔/厘米2）中 ，填充有单细胞或胚胎。细胞POSI化，形状，极性和内部细胞组织变得那么标准化呈现出3D架构。我们使用复制品成型图案的微腔的阵列，'eggcups'，到薄聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘附在盖玻片层。腔体上布满了纤维连接蛋白更容易粘附。细胞通过离心插入。填充百分比为每个系统允许高达80％的最优化。细胞和胚胎存活率证实。我们应用此方法对细胞器，如细胞核和高尔基体的可视化，并研究活动进程，如cytokinetic环的细胞有丝分裂期间的关闭。该器件允许cytokinetic闭环和压实表型的高尔基体细胞核对准期间的新功能，如周期性积累和肌球蛋白和肌动蛋白的不均匀性的鉴定。我们的特点的方法哺乳动物细胞，裂殖酵母，芽殖酵母，C.线虫 W¯¯在每种情况下i个具体的适应。最后，该装置的特性使得它特别有趣的药物筛选测定法和个性化的药物。

引言

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当前在体外基于细胞的测定是二维（2D）。这种构造是不自然的哺乳动物细胞，因此不是生理有关1;细胞显示的形状，大小和异构表型的多样性。当应用于筛选应用，如平面和细胞器的极端的表型（应力纤维，特别是）内的无序分布它们呈现额外严重的局限性。这是在药物测试，在高预算每年花在临床试验尤为重要。当因为在药物筛选的初期阶段人工2D培养条件适用于动物模型大多数这些药物​​虽然失败。另外，通过使用这种方法，具体细胞器无法正常显现，如细胞有丝分裂期间cytokinetic肌动球蛋白环，一般认为是在平面垂直演进到观察平面结构。一些新的二维测定人为了克服上述缺点和重要的见解上细胞骨架组织已经观察到2,3被提出。但是，这些检测仍然存在一个严重的局限性：细胞表现出非常价差表型相反的是， 在体内 ，其中细胞呈现出3D架构观察。与培养法相关的这些文物可能引发非生理功能，如增强的应力纤维1,4,5。

时相比2D环境6,7-三维细胞培养测定提供多个优点。它们是生理上更相关的，并且结果是因此有意义。作为一个例子，嵌在水凝胶细胞显示3D状结构，但它们的形态从一个小区的不同而不同8,9。然而，它们的形态从一个小区到另一个，其中筛选应用复杂不同。另一种策略是嵌入单细胞微制造的腔10,11。然后细胞位置，形状，极性和内部细胞组织可以成为标准化。除了 ​​提....

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方案

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1.“Eggcups”的微细

  1. 法师的制作：微腔阵列
    1. 热3''的硅晶片到200℃以蒸发湿度的任何存在。
    2. 旋涂层的SU-8光致抗蚀剂的薄层。调整树脂及纺丝速度取决于所需的厚度和光致抗蚀剂类型的体积。该厚度将决定'eggcups'（EC）的深度。对于2,800转30微米厚的层和SU-8 2025年，旋涂。
    3. 预烘烤在65℃下1分钟（第2步骤1）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。
    4. 预烘烤在95℃下进行3分钟（第2步骤2）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。
    5. 加载晶片上的掩模对准器为UV曝光。放置光刻掩模就可以了。掩模示出20微米直径的圆形特征（磁盘）的图案。确保相互之间的完美接触。
      注：不同制造商提供的光刻面具。的空间分辨率将确定的最终成本。醋酸口罩低成本提供可接受的分辨率（≈10微米）。铬面罩提供更好的分辨率，但更昂贵。适应磁盘的直径（从光刻掩模），以细胞的体积。在掩模磁盘尺寸将确定在设备的空腔的直径。小直径会导致较低的填充;过大直径将不限制细胞。用于HeLa和NIH3T3细胞，直径为20微米至25微米的建议。
    6. 检查紫外灯之前博览会的力量，相应地优化曝光时间。照射（波长= 365纳米），用于在41.5秒（或优化曝光时间）2....

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结果

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该'eggcups'（EC）是一种新型的高含量筛选方法，它允许导向细胞和胚胎的可视化在3D环境。此外，某些细胞过程，这是很难在标准2D（平面）培养物来观察，可以通过这种新的方法观察到的。 图1a显示了EC微细加工步骤的概要（参见章节1中的上述协议）。该方法简便，快捷，高效，无需特殊设备的任何要求。 图1b和1c显示了一个大型的图片和“eggcups”分别放大的扫描电子显微镜图像。如可以观察到的，它们的形状和大小是非常规则。这种方法是非常灵活的;不同形状和尺寸可以容易地制造，并且适合于不同的模型系统。以下面的方式被选择的'eggcups'尺寸：尺寸其中发生分裂的细胞，测定二维表面：它们具有球形形状并且它们的直径取作的良好指示对于EC直径。例如细胞分裂过程中'eggcups'长和定向沿其长轴细胞。这个尺寸取决于系统 - 细胞和胚胎 - 所以此尺寸应在每种情况下进行评估。

图2示出所需要的材料（ 图2a）和步骤一步协议.......

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讨论

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副本成形，为了制造“eggcups”使用。的制造过程中不需要清洁室;它是容易和简单，但也有一些实践可能是需要的。具体地，释放PDMS压模是为了生产高品质'eggcups'的一个大的面积中最关键的步骤。由于这个原因，特别小心在这一步骤才能作出。如果这一步失败反复，考虑到优化之前的硅烷化和等离子结合等离子清洗机的参数。硅烷化不足，会导致邮票的PDMS膜粘着强。如果发生此种情况，培养时间与硅烷化试剂可以增加。需要注意的是其它技术和材料可应用于制造的“eggcups'，它可以用一个大范围的配位体（纤连蛋白，明胶，胶原等 ）的官能化。特别是，在聚苯乙烯微腔可以很容易地通过硫化铜制成汤姆制热压印技术。这确保生物相容性和在标准培养皿得到的结果直接比较。同样地，特别护理和实践都需要以优化的填充比率。特别地，漂洗步骤是为了确保没有过量细胞的适当填充，在信号有助于噪声和背景的关键。如果细胞是从空腔容易地除去，可以考虑改变腔的大小或深度。

'Eggcups'提供3D状结构用一个简单的协议细胞和高含量筛选测定法。细胞器和未知活动进程使用标准培养测.......

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披露

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我们什么都没有透露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们承认L. Brino（IGBMC高内涵筛选设备，伊尔基希，法国）为我们提供了抗Giantin抗体，M. Labouesse实验室。为C.线虫 （IGBMC）和B塞拉芬实验室。对芽殖酵母（IGBMC），E帕卢赫和A.海曼荧光灯HeLa细胞（MPI-CBG，德累斯顿），J·莫斯利（达特茅斯医学院）和JQ吴（俄亥俄州立大学）的裂殖酵母细胞; A.饭店Hoel和F Evenou实验的帮助下，里克C.（IBMC，斯特拉斯堡，法国）的技术的帮助下，和JC JEANNOT（飞秒日，法国）在微细的帮助。这项工作是由来自法国国家科学研究中心，斯特拉斯堡大学，Conectus资金的支持，拉基金会倒拉RECHERCHE MEDICALE和斯特拉斯堡的CI-FRC。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ddH20 （超纯）Millipore-始终使用淡水。
封口膜（塑料薄膜）BemisPM-999使用一些水滴将封口膜粘附在实验室工作台上，并确保完美的表面平整度。
光掩模Selba-http://www.selba.ch
硅片Siltronix-http://www.siltronix.com/
SU-8 光刻胶MicroChem2000 系列http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
需要在通风橱中工作>
SU-8 显影MicroChem-http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
需要在通风橱中工作
2-丙醇Sigma-Aldrich19030http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA
可从多家公司获得。
Sigmacote（硅化试剂）Sigma-AldrichSL2-25MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&地区=FR 
>有害，需要在通风橱中工作;有关更多信息，请查看制造商提供的数据表。 
氯三甲基硅烷 （TMCS）Sigma-Aldrich386529-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR  
TMCS 产生急性吸入和皮肤毒性，并且高度易燃（点火回火能够在相当长的距离内发生），因此它应该在远离火源
腈手套Kleenguard57372http://www.kcprofessional 的通风柜中使用。com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
可从多家公司获得。
玻璃盖玻片 #0Knittel 玻璃KN00010022593http://www.knittelglass.com/index_e.htm
非常易碎。轻轻作。
锋利的直镊子SPI0WSSS-XDhttp://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml 管BD Falcon352070http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
可从多家公司获得。
PDMS道康宁Sylgard 184 kithttp://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx？R=131EN 
该包装包含 PDMS 基料和固化剂。多家公司都有类似的弹性体。
显微镜载玻片Dutscher100001http://www.dutscher.com/frontoffice/search
可从多家公司获得。
DMEM 高葡萄糖培养基Fisher Scientific41965-039http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search？LBCID=12301479&关键字=41965-039&store=科学&导航=0&偏移=0&商店 Id=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
牛犊血清Sigma-AldrichC8056-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&地区=CA
0.25% 胰蛋白酶-EDTAFisher Scientific25200-072http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=科学&导航=0&偏移=0&商店 Id=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1xFisher Scientific14200-067http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=科学&导航=0&偏移=0&商店 Id=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 为 10 倍，应使用 ddH2O
L-15 培养基Scientific21083-027http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=科学&导航=0&偏移=0&商店 Id=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium 用于无 CO2 控制的
连蛋白 Sigma-AldrichF1141-5MGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&术语=F1141-5MG&lang=en&地区=CA&焦点=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
青霉素 &链霉素Fisher Scientific15140-122http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=科学&导航=0&偏移=0&商店 Id=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
培养皿 P35格雷纳627102http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
培养皿 P60格雷纳628163http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
培养皿 P94Greiner633179http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
>多聚甲醛 3 %Sigma-AldrichP6148-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&地区=FR 
尤其对眼睛有害，需要在通风橱中工作;有关更多信息，请查看制造商的数据表。
Triton 0.5 %Sigma-Aldrich93443-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&术语=93443-100ML&lang=en&地区=CA&焦点=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
鬼笔素绿荧光 Alexa Fluor 488InVitrogenA12379http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379？CID=搜索-a12379 
将粉末溶于 1.5 ml 甲醇
Alexa Fluor 647InVitrogenA21245以 1：200 稀释在 PBS 中 1x
兔多克隆抗巨人蛋白Abcamab24586 ab24586在 PBS 中以 1：500 稀释 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
兔抗茴香素M. Glotzer 提供，发表于 Piekny， A. J. &Glotzer， M. Anillin 是一种支架蛋白，在胞质分裂过程中连接 RhoA、肌动蛋白和肌球蛋白。当代生物学 18， 30–6 （2008 年）。在 PBS 中以 1：500 稀释 1x
抗磷酸酪氨酸转导实验室610000http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 山羊抗兔 杰克逊免疫研究111-166-047http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1：1,000 在 PBS 1x
DAPISigma-AldrichD8417 中稀释 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&地区=FR 
1 mg/ml 持续 1 分钟
甘油Sigma-AldrichG2025http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&术语=G2025&lang=en&地区=CA&焦点=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
>矿物油Sigma-AldrichM8410-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&术语=M8410-500ML&lang=en&地区=CA&焦点=product&N=0+220003048+219853082+219853286&模式=匹配%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&术语=M8410-500ML&lang=en&地区=CA&焦点=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa 细胞--许多公司都可以买到哺乳动物细胞。另见 表 1
NIH3T3 细胞ATCC-哺乳动物细胞可从许多公司获得。另见表 1
裂变酵母 --有关菌株的详细信息，请联系通讯作者。另见表 1
秀丽隐杆线虫蠕虫--有关详细信息，请联系通讯作者。另见 表 1
YES（琼脂）+ 包括 5 种补充剂MP Biomedicals4101-732http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=搜索 
准备：按照盒子
是（媒体） + 包含5个补充剂MP Biomedicals4101-522http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=搜索 
准备工作：按照包装盒
EMM （Media）MP Biomedicals4110-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=搜索 
准备：按照包装盒
过滤灭菌的EMM（培养基） - 仅用于成像MP Biomedicals4110-012准备：按照包装盒上给出的说明进行作。使用 0.22 µm 过滤器而不是高压灭菌。这使介质透明并减少自发荧光。
补充剂（用于 EMM）MP Biomedicals4104-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=搜索
 （在高压灭菌或过滤之前，向 EMM 培养基中加入 225 mg/L）
Stericup 和 Steritop Vaccum 驱动的无菌过滤器Millipore-http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1：tab1=2
剂 有关更多信息，请查看制造商提供的数据表<丁<稀释至 1 倍Fisher 气氛纤中由 <上给出的说明上的说明进行作上给出的说明进行作

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009)....

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标签

PDMS

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