我们介绍一种 体外 小鼠胎肝成红细胞培养系统，可解析终末红细胞生成的早期与晚期阶段。该系统有助于对不同发育阶段中特定基因的功能进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
红细胞生成是一个动态过程，起始于成红细胞爆式集落形成单位（BFU-Es），随后是快速分裂的成红细胞集落形成单位（CFU-Es）。在CFU-Es之后，细胞在形态上可被识别，通常称为终末成红细胞。终末红细胞生成研究的一个挑战在于缺乏能够按时间顺序解析基因功能的实验方法。在本方案中，我们描述了一种独特策略，用于确定基因在终末红细胞生成早期和晚期阶段的功能。在此系统中，从小鼠胎肝中分离出TER119阴性（成熟红系细胞标志物）的成红细胞，并通过转导外源性cDNA或针对目的基因的小发夹RNA（shRNAs）进行基因操作。随后将细胞培养于含有除促红细胞生成素（Epo）以外的生长因子的培养基中，维持其前体细胞状态12小时，同时允许外源性cDNA或shRNA表达。12小时后，将培养基更换为含Epo的培养基，以诱导细胞分化与增殖，此时外源遗传物质已经表达。该方案有助于分析基因在终末红细胞生成早期阶段的功能。为了研究终末红细胞生成的晚期阶段，在转导后立即将细胞接种于含Epo的培养基中进行培养。通过这种方式，当转导的遗传物质开始表达时，细胞已经分化至终末红细胞生成的晚期阶段。我们建议广泛采用这一策略，以帮助深入理解不同阶段终末红细胞生成中基因的详细功能。
引言
红细胞生成是多能造血干细胞分化为成熟红细胞的过程。这一逐步过程包括形成定向红系爆式集落形成单位（BFU-Es）、快速分裂的红系集落形成单位（CFU-Es），以及形态上可识别的成红细胞1,2。从CFU-E祖细胞开始的终末红细胞生成包含依次发生的促红细胞生成素依赖性和非依赖性阶段2,3。在终末红细胞生成的早期阶段，促红细胞生成素（Epo）与其细胞表面受体结合，激活一系列下游信号通路，从而抑制细胞凋亡，并促进细胞快速分裂和基因表达1,4。在终末红细胞生成的晚期阶段，成红细胞退出终末细胞周期，发生染色质和细胞核浓缩，并最终排出高度浓缩的细胞核5。
近几十年来，人们对终末期红细胞生成过程的理解取得了显著进展，这主要得益于几种方法的成功应用 体外 和 体内 小鼠模型6-9在这些模型中， 体外 小鼠胎肝成红细胞的培养具有多种优势，包括细胞纯化简便、增殖与分化速度快，以及更接近人类红细胞生成过程的模拟10,11在此系统中，可通过单步纯化 TER119 阴性有核红细胞（TER119 为成熟红系细胞的标志分子）从鼠胎肝中轻松分离大量红系祖细胞。在有核红细胞培养的两天过程中，可通过流式细胞术检测转铁蛋白受体（CD71）和 TER119 抗原的表面表达水平，以监测这些细胞的分化进程。12此外，可....
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方案
本方案中描述的实验均依照西北大学机构动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。
1. 培养基的制备
- 制备纤连蛋白溶液。向一支人纤连蛋白（1 mg）冻干粉小瓶中加入1 ml水，在组织培养罩内静置30分钟，不搅拌。将全部液体转移至50 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为20 µg/ml，并轻轻混匀。在包被培养板前新鲜配制纤连蛋白溶液（见下文）。
- 制备50 ml不含促红细胞生成素（Epo）的培养基（SCF培养基）。按照表1所列成分进行配制。新鲜配制的培养基可在4 °C保存1个月。
- 制备50 ml含促红细胞生成素（Epo）的培养基。按照表2所列成分进行配制。新鲜配制的培养基可在4 °C保存1个月。
2. 纤连蛋白包被板
- 向6孔板的每孔中加入1 ml纤连蛋白溶液（或向12孔板的每孔中加入0.5 ml）。将板置于组织培养罩内静置1小时。
- 用无菌水清洗各孔两次，并将板自然晾干。
- 包好板，于4 °C冰箱中保存。
3. 胎肝红细胞的纯化
注意：使用 E13 至 E15 天的定时妊娠小鼠（C57BL/6）的胎肝....
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结果
图1概述了实验策略。该方案包含两个独立条件，用于靶向调控终末红细胞生成早期和晚期阶段中信号分子的功能。从E13.5小鼠胚胎中分离获得TER119阴性的胎肝成红细胞。胎肝红系细胞在纯化前后进行流式细胞术分析，结果显示纯化效率较高（图2A和2B）。对于终末红细胞生成的早期阶段（图1，虚线），在病毒转导后，细胞在无促红细胞生成素（Epo）的培养基（SCF培养基）中培养12小时。在此期间，细胞分化程度极低（图2C），且在转导细胞（GFP阳性）中未观察到明显的凋亡现象（图3）。当转移至含Epo的培养基后，细胞开始分化（图4），其表现与转导后立即在含Epo培养基中培养的细胞相似（图1，实线和图5）。在两种方法中，于含Epo培养基中培养2天期间，大多数红系祖细胞（CD71low TER119low）在第2天.......
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讨论
本文介绍了一种独特的系统，可用于对小鼠胎儿肝脏终末红细胞生成过程进行时间序列分析。通过应用不同的培养条件，我们成功地将终末红细胞生成过程划分为早期和晚期两个阶段。这一方法对于解析具有多重功能基因的作用机制尤为重要。例如，Rac GTPases 在终末红细胞生成的不同阶段均发挥重要作用。在终末红细胞生成的早期阶段抑制 Rac GTPases 会影响细胞的分化与增殖；而在晚期阶段抑制 Rac GTPases 的活性，则可在不影响细胞分化、增殖或存活的情况下阻断去核过程13。
本方案中有几个重要步骤需要注意。首先，建议使用 E13.5 小鼠胚胎肝脏来纯化 TER119 阴性细胞。虽然也可使用较晚期的胚胎，但祖细胞占全部胎肝细胞的比例会较低。其次，在促红细胞生成素（Epo）培养基中应使用低内毒素的 BSA，这对去核过程至关重要，尽管其具体机制尚不明确。第三，尽管已有文献报道纤连蛋白对红细胞生成具有重要作用15，但我们发现使用纤连蛋白包被的培养板并非必需；在我们的体系中，它对细胞增殖、分化或去核均无显著影响。然而，纤连蛋白有助于细胞贴附于培养板，这.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R00HL102154项目以及美国血液学会授予P Ji的学者奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 伊氏改良达尔伯克氏培养基（IMDM） | Gibco | 12440-053 | |
| 胎牛血清（FBS） | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Hyclone | SV30010 | 100倍浓缩液 |
| L-谷氨酰胺 | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| 小鼠FIT3配体（Flt-3L） | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| 小鼠重组白细胞介素-6（IL-6） | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| 纤维连接蛋白 | BD Biosciences | 354008 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | STEMCELL TECH | 9300 | IMDM中10%储备液 |
| 促红细胞生成素（Epo） | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml 储备液 |
| 链霉亲和素磁珠Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep磁力架 | STEMCELL TECH | 18000 | |
| 聚丙烯圆底管，5 ml | FALCON | 352063 |
参考文献
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L.
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