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方法文章

小鼠胎肝培养系统用于解析终末红细胞生成早期和晚期靶基因功能

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DOI：

10.3791/51894

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2014年9月9日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Northwestern University

本文内容

摘要

我们介绍一种 体外 小鼠胎肝成红细胞培养系统，可解析终末红细胞生成的早期与晚期阶段。该系统有助于对不同发育阶段中特定基因的功能进行分析。

摘要

红细胞生成是一个动态过程，起始于成红细胞爆式集落形成单位（BFU-Es），随后是快速分裂的成红细胞集落形成单位（CFU-Es）。在CFU-Es之后，细胞在形态上可被识别，通常称为终末成红细胞。终末红细胞生成研究的一个挑战在于缺乏能够按时间顺序解析基因功能的实验方法。在本方案中，我们描述了一种独特策略，用于确定基因在终末红细胞生成早期和晚期阶段的功能。在此系统中，从小鼠胎肝中分离出TER119阴性（成熟红系细胞标志物）的成红细胞，并通过转导外源性cDNA或针对目的基因的小发夹RNA（shRNAs）进行基因操作。随后将细胞培养于含有除促红细胞生成素（Epo）以外的生长因子的培养基中，维持其前体细胞状态12小时，同时允许外源性cDNA或shRNA表达。12小时后，将培养基更换为含Epo的培养基，以诱导细胞分化与增殖，此时外源遗传物质已经表达。该方案有助于分析基因在终末红细胞生成早期阶段的功能。为了研究终末红细胞生成的晚期阶段，在转导后立即将细胞接种于含Epo的培养基中进行培养。通过这种方式，当转导的遗传物质开始表达时，细胞已经分化至终末红细胞生成的晚期阶段。我们建议广泛采用这一策略，以帮助深入理解不同阶段终末红细胞生成中基因的详细功能。

引言

红细胞生成是多能造血干细胞分化为成熟红细胞的过程。这一逐步过程包括形成定向红系爆式集落形成单位（BFU-Es）、快速分裂的红系集落形成单位（CFU-Es），以及形态上可识别的成红细胞1,2。从CFU-E祖细胞开始的终末红细胞生成包含依次发生的促红细胞生成素依赖性和非依赖性阶段2,3。在终末红细胞生成的早期阶段，促红细胞生成素（Epo）与其细胞表面受体结合，激活一系列下游信号通路，从而抑制细胞凋亡，并促进细胞快速分裂和基因表达1,4。在终末红细胞生成的晚期阶段，成红细胞退出终末细胞周期，发生染色质和细胞核浓缩，并最终排出高度浓缩的细胞核5。

近几十年来，人们对终末期红细胞生成过程的理解取得了显著进展，这主要得益于几种方法的成功应用 体外 和 体内 小鼠模型6-9在这些模型中， 体外 小鼠胎肝成红细胞的培养具有多种优势，包括细胞纯化简便、增殖与分化速度快，以及更接近人类红细胞生成过程的模拟10,11在此系统中，可通过单步纯化 TER119 阴性有核红细胞（TER119 为成熟红系细胞的标志分子）从鼠胎肝中轻松分离大量红系祖细胞。在有核红细胞培养的两天过程中，可通过流式细胞术检测转铁蛋白受体（CD71）和 TER119 抗原的表面表达水平，以监测这些细胞的分化进程。12此外，可通过DNA染料（Hoechst 33342）检测终末分化成红细胞的脱核现象。13此外，可通过外源性表达目的基因的cDNA或小发夹RNA（shRNAs）对纯化的前体细胞进行遗传修饰，从而促进红细胞生成过程中基因表达功能的机制研究。11,13,14.

另一方面，快速的细胞生长速度可能是一把双刃剑，因为在终末红细胞生成的不同阶段中难以准确鉴定基因功能。大多数情况下，很难确定某个特定基因是否在终末红细胞生成的早期阶段发挥作用，因为当cDNA或shRNA表达时，细胞通常已经越过了早期阶段。为了解决这一问题，我们建立了一种独特的系统，用于解析终末红细胞生成的早期和晚期阶段。对于终末红细胞生成的早期阶段，将基因修饰后的TER119阴性成红细胞在不含促红细胞生成素（Epo）但含有干细胞因子（SCF）、IL-6和FLT3配体的培养基中培养，以维持其前体细胞状态，并允许转导的cDNA或shRNA表达13。12小时后，将细胞转移至含Epo的培养基中，以诱导细胞增殖和分化。通过这种方式，当细胞开始分化时，转导的cDNA或shRNA已经完成表达。对于终末红细胞生成的晚期阶段，则在转导后立即将TER119阴性成红细胞置于含Epo的培养基中培养。因此，可借此分析目的基因在终末红细胞生成晚期阶段的功能。总之，该系统的广泛应用将有助于解析基因在终末红细胞生成不同阶段中的作用。

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方案

本方案中描述的实验均依照西北大学机构动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。

1. 培养基的制备

  1. 制备纤连蛋白溶液。向一支人纤连蛋白（1 mg）冻干粉小瓶中加入1 ml水，在组织培养罩内静置30分钟，不搅拌。将全部液体转移至50 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为20 µg/ml，并轻轻混匀。在包被培养板前新鲜配制纤连蛋白溶液（见下文）。
  2. 制备50 ml不含促红细胞生成素（Epo）的培养基（SCF培养基）。按照表1所列成分进行配制。新鲜配制的培养基可在4 °C保存1个月。
  3. 制备50 ml含促红细胞生成素（Epo）的培养基。按照表2所列成分进行配制。新鲜配制的培养基可在4 °C保存1个月。

2. 纤连蛋白包被板

  1. 向6孔板的每孔中加入1 ml纤连蛋白溶液（或向12孔板的每孔中加入0.5 ml）。将板置于组织培养罩内静置1小时。
  2. 用无菌水清洗各孔两次，并将板自然晾干。
  3. 包好板，于4 °C冰箱中保存。

3. 胎肝红细胞的纯化

注意：使用 E13 至 E15 天的定时妊娠小鼠（C57BL/6）的胎肝 。优先选用 E13.5 天的胎肝，以最大化获得集落形成单位-红系（CFU-E）祖细胞的产量。为获得定时妊娠小鼠，将 6 至 8 周龄的雄性和雌性小鼠放入同一笼中（通常一只雄性与一至两只雌性配对）。次日早晨检查雌性小鼠阴道栓，以确定交配是否成功。妊娠的第一天为发现阴道栓的次日。

  1. 总胎肝细胞的制备
    1. 通过吸入 CO2 并行颈椎脱位处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒腹部进行消毒。用解剖剪剪开腹腔，取出子宫，并将子宫在 1×PBS 中洗涤。
    2. 在无菌条件下使用组织培养罩和经高压灭菌的器械解剖胎鼠，并在 1×PBS 中洗涤。
    3. 从胎鼠中分离胎肝。用一把镊子夹住胎鼠躯体，用另一把镊子轻轻将胎肝（呈粉红色）从躯体上剥离。用镊子清理胎肝，去除附着的纤维组织。将所有胎肝置于含 10% 胎牛血清的新鲜 1×PBS 中。
    4. 通过移液吹打机械性分散胎肝组织。
    5. 将细胞悬液经 40 µm 细胞滤器过滤至 50 ml 圆锥形离心管中，在 800 × g 下离心 5 分钟以收集细胞。
    6. 吸除上清液，将细胞重悬于 1 ml 含 10% FBS 的 PBS 中（约每毫升含 8 个 E13.5 胎鼠的肝脏）。
  2. TER119 阴性成红细胞的纯化
    1. 在冰上用大鼠 IgG（0.2 mg/ml）封闭细胞 15 分钟。
    2. 不进行洗涤或离心，直接向细胞悬液中加入生物素标记的抗-TER119 抗体（1 µg/ml），冰上孵育 15 分钟。
    3. 用含 10% FBS 的 1×PBS（1:10 稀释）洗涤，800 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 1 ml 含 10% FBS 的 PBS 中。
    4. 加入 75 µl 与磁性颗粒偶联的链霉亲和素，冰上孵育 10 分钟。
    5. 用含 10% FBS 的 PBS 将体积补至 2.5 ml。将细胞悬液转移至 5 ml 聚丙烯圆底管中。
    6. 将试管插入磁性细胞分选装置中，孵育 10 分钟。TER119 阳性细胞将吸附于管壁，未吸附的 TER119 阴性成红细胞保留在悬液中。
    7. 将细胞悬液倒入新的 5 ml 聚丙烯圆底管中。
    8. 重复步骤 3.2.6 和 3.2.7 以去除残留的 TER119 阳性细胞。
    9. 在 800 × g 下离心 5 分钟收集细胞，吸除上清液。将细胞重悬于 1 ml 含 10% FBS 的 PBS 中，并用台盼蓝计数活细胞。

4. 使用编码 cDNA 或 shRNA 的病毒进行转导

  1. 将纯化的TER119阴性胎肝细胞以每孔3-5 × 105个细胞的密度接种于纤维连接蛋白包被的12孔板中（若使用其他规格的培养板，请相应调整细胞数量）。
  2. 加入聚凝胺，使其终浓度为10 µg/ml，以促进病毒转导。在37 °C、800 × g条件下，使用编码cDNA或shRNA的慢病毒或逆转录病毒对细胞进行离心感染，离心时间为1-1.5小时 。

5. 转导的TER119阴性小鼠胎肝成红细胞的培养

  1. 检测基因在终末红细胞生成早期阶段的功能（图1 虚线所示）。
    1. 将转导后的细胞在无促红细胞生成素（Epo）的培养基（SCF 培养基）中培养 12 小时，以促进转导基因的表达并维持前体细胞状态。
    2. 以 800 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于 1 ml 含 Epo 的培养基中，每孔接种于 12 孔板中。
    3. 培养 24 或 48 小时后，收集细胞进行后续检测。
  2. 检测基因在终末红细胞生成晚期阶段的功能（图1 实线所示）。
    1. 将转导后的细胞立即接种于含 Epo 的培养基中进行培养。
    2. 培养 24 或 48 小时后，收集细胞进行后续检测。

6. 培养的胎肝细胞用于流式细胞术分析的染色

  1. 用1×PBS洗涤并重悬细胞。收集2×105个培养细胞用于流式细胞术分析。
  2. 将细胞与荧光素偶联抗体在室温避光孵育20分钟。检测分化时，使用APC偶联的抗CD71抗体和PE偶联的抗TER119抗体；检测脱核时，除上述抗体外，还需加入Hoechst 33342染料进行染色。
  3. 用1×PBS洗涤细胞，然后重悬于0.5 ml含1% FBS和碘化丙啶（PI）（1 µg/ml）的PBS中，以标记死细胞并在分析时排除。
  4. 进行流式细胞术分析。首先分析单色染色和未染色的对照细胞，以调整和校正流式细胞仪的补偿参数。

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结果

图1概述了实验策略。该方案包含两个独立条件，用于靶向调控终末红细胞生成早期和晚期阶段中信号分子的功能。从E13.5小鼠胚胎中分离获得TER119阴性的胎肝成红细胞。胎肝红系细胞在纯化前后进行流式细胞术分析，结果显示纯化效率较高（图2A和2B）。对于终末红细胞生成的早期阶段（图1，虚线），在病毒转导后，细胞在无促红细胞生成素（Epo）的培养基（SCF培养基）中培养12小时。在此期间，细胞分化程度极低（图2C），且在转导细胞（GFP阳性）中未观察到明显的凋亡现象（图3）。当转移至含Epo的培养基后，细胞开始分化（图4），其表现与转导后立即在含Epo培养基中培养的细胞相似（图1，实线和图5）。在两种方法中，于含Epo培养基中培养2天期间，大多数红系祖细胞（CD71low TER119low）在第2天...

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讨论

本文介绍了一种独特的系统，可用于对小鼠胎儿肝脏终末红细胞生成过程进行时间序列分析。通过应用不同的培养条件，我们成功地将终末红细胞生成过程划分为早期和晚期两个阶段。这一方法对于解析具有多重功能基因的作用机制尤为重要。例如，Rac GTPases 在终末红细胞生成的不同阶段均发挥重要作用。在终末红细胞生成的早期阶段抑制 Rac GTPases 会影响细胞的分化与增殖；而在晚期阶段抑制 Rac GTPases 的活性，则可在不影响细胞分化、增殖或存活的情况下阻断去核过程13。

本方案中有几个重要步骤需要注意。首先，建议使用 E13.5 小鼠胚胎肝脏来纯化 TER119 阴性细胞。虽然也可使用较晚期的胚胎，但祖细胞占全部胎肝细胞的比例会较低。其次，在促红细胞生成素（Epo）培养基中应使用低内毒素的 BSA，这对去核过程至关重要，尽管其具体机制尚不明确。第三，尽管已有文献报道纤连蛋白对红细胞生成具有重要作用15，但我们发现使用纤连蛋白包被的培养板并非必需；在我们的体系中，它对细胞增殖、分化或去核均无显著影响。然而，纤连蛋白有助于细胞贴附于培养板，这...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R00HL102154项目以及美国血液学会授予P Ji的学者奖资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
伊氏改良达尔伯克氏培养基（IMDM）Gibco12440-053
胎牛血清（FBS）GEMINI Bio-product700-102P
青霉素-链霉素溶液HycloneSV30010100倍浓缩液
L-谷氨酰胺HycloneSH30034.01200 mM
小鼠FIT3配体（Flt-3L）BD Biosciences 14-8001-80
小鼠重组白细胞介素-6（IL-6） GEMINI Bio-product300-327P
纤维连接蛋白BD Biosciences 354008
牛血清白蛋白（BSA）STEMCELL TECH9300IMDM中10%储备液
促红细胞生成素（Epo）PROCRITNOC 59676-303-003,000 U/ml 储备液
链霉亲和素磁珠PlusBD Pharmingen557812
EasySep磁力架STEMCELL TECH18000
聚丙烯圆底管，5 mlFALCON352063

参考文献

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