原代神经元中量子点标记的BDNF轴突运输的实时成像

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）的轴突运输对多种神经元群体的存活和功能至关重要。某些变性类疾病的特点是轴突结构和功能的破坏。我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中检测QD-BDNF活体运输的技术。

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元存活、分化和功能的多个方面发挥着重要作用。轴突在结构和功能上的缺陷 increasingly 被认为是神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD））的早期特征。然而，诱导轴突损伤的机制尚不明确。我们报道了一种新型技术的开发，用于制备具有生物活性的单生物素化BDNF（mBtBDNF），可用于追踪BDNF的轴突运输。通过将量子点655与mBtBDNF偶联，制备了量子点标记的BDNF（QD-BDNF）。采用微流控装置将轴突与神经元胞体分离。将QD-BDNF加入轴突区后，可实现对BDNF在轴突中运输的活体成像。我们证实，QD-BDNF几乎完全进行逆向运输，移动过程中极少暂停，速度约为1.06 μm/sec。该系统可用于研究AD或HD以及其他退行性疾病中轴突功能障碍的机制。

引言

神经元是高度极化的细胞，其细长且通常高度分支的突起对于建立和维持神经环路的结构与功能至关重要。轴突在向突触运输物质以及从突触反向运输中发挥关键作用。在胞体中合成的蛋白质和细胞器需要通过轴突运输至突触前终末，以维持神经元功能。相应地，远端轴突接收到的信号也必须被转导并传递回胞体。这些过程对神经元的存活、分化和维持至关重要。由于某些神经元的轴突运输距离可超过胞体直径的1000倍以上，因此即使存在轻微的功能缺陷，也可能显著影响神经元及神经环路的功能。

脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族中的一种生长因子，广泛存在于多种脑区，包括海马、大脑皮层和基底前脑。BDNF 通过支持参与认知环路的神经元的存活、分化及功能，在认知和记忆形成中发挥关键作用。BDNF 在轴突末梢与其受体酪氨酸激酶 TrkB 结合，激活 TrkB 介导的信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）以及磷脂酶 C-γ（PLCγ）。参与这些信号通路的蛋白质被包装到内吞囊泡结构上，形成 BDNF/TrkB 信号内体^1-6，随后通过逆行运输至神经元胞体。

微流控培养室是研究正常条件下以及损伤和疾病状态下轴突生物学的非常有用的平台^7,8。通过将轴突与胞体分离，该装置使得研究人员能够特异性地研究轴突内的物质运输过程^8-10。本研究中使用的基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控平台，其微沟槽屏障宽度为450 μm，为商业购买产品（见材料 表）。为了研究脑源性神经营养因子（BDNF）的运输，我们开发了一种新型技术以制备单生物素化BDNF（mBtBDNF）。我们利用了生物素受体肽AP（也称为AviTag），这是一种包含一个赖氨酸残基的15个氨基酸序列，可通过大肠杆菌（Escherichia coli）中的生物素连接酶BirA特异性地与生物素连接。我们通过PCR将AviTag融合至小鼠pre-proBDNF cDNA的C末端（图1A）。随后将该构建体克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1 myc-his中。同时，我们将细菌BirA的DNA也克隆至pcDNA3.1 myc-his载体中。将这两个质粒瞬时共转染入HEK293FT细胞，以同时表达两种蛋白。BirA催化生物素特异性地连接至BDNF C末端AviTag中的赖氨酸残基，以1:1的比例生成单生物素化的BDNF单体。从培养基中回收并使用Ni树脂纯化得到分子量约为18 kDa的生物素化成熟BDNF（图1C）。通过免疫印迹检测未发现未修饰的BDNF，表明BDNF的生物素化反应完全（图1D）。使用链霉亲和素偶联的量子点QD 655对mBtBDNF进行标记，从而制备QD-BDNF。AviTag的存在并不影响BDNF的活性，因为mBtBDNF能够像重组人BDNF（rhBDNF）一样有效激活磷酸化的TrkB（图1E），并促进神经突向外生长（图1F）。免疫荧光染色显示QD-BDNF在海马轴突中与TrkB共定位，表明QD-BDNF具有生物活性（图1G）。为研究BDNF的运输过程，将QD-BDNF加入含有大鼠E18海马神经元的微流控培养装置的远端轴突区（图2A）。通过实时活细胞成像观察红色荧光标记，记录了QD-BDNF在轴突内的逆行运输过程（支持视频 S1、S2）。通过对生成的时空图（kymograph）进行分析，观察到QD-BDNF以约1.06 μm/sec的速度进行逆行运输（图3A）。此前已有研究使用GFP或mCherry标记的BDNF来追踪BDNF在轴突中的运动。其主要局限在于荧光强度不足以支持单分子水平的研究。此外，由于BDNF同时存在顺行和逆行运动，难以判断逆行运输的BDNF是否处于神经营养因子/受体复合物状态。

在本视频中，我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中观察QD-BDNF活体运输的技术。量子点具有极高的亮度和优异的光稳定性，使得对BDNF运输进行长期示踪成为可能。这些技术可用于加强阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）及其他神经退行性疾病中轴突功能的研究。

方案

外科手术和动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行。所有涉及动物使用的实验均经加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机构动物护理和使用委员会批准。

1. 单生物素化BDNF（mBtBDNF）质粒克隆、表达与纯化

注意：将 pre-proBDNFavi 和 BirA cDNA 构建到 pcDNA3.1 载体中，并在 HEK293FT 细胞中共同表达¹⁰。参照先前发表的成熟且具有生物活性的单生物素化神经生长因子（mBtNGF）的制备方法¹⁰，使用 Ni-NTA 琼脂糖珠纯化 mBtBDNF。

2. 微流控腔室的制备

微流控神经元培养装置可实现轴突与神经元胞体的流体隔离。每次解剖前，使用新包被的盖玻片组装培养室。本实验方案中使用的微流控培养室为商业购买产品（见材料与设备表）。经手洗后，商业购买的培养室可重复使用5至6次。

1. 用 1% Alconox 手工清洗微流控腔室。每次用 Milli-Q 水冲洗 30 分钟，共冲洗三次。再用 70% 乙醇手工清洗腔室一次。
2. 将腔室平铺在超净台内的 Parafilm 上晾干。在紫外线下双面照射并灭菌 20 分钟。将灭菌后的腔室存放于用 Parafilm 密封的无菌 15 cm 培养皿中，室温保存。
3. 将 24 × 40 mm 的 1 号玻璃盖玻片放入玻璃容器中。在旋转器上用 35% 盐酸浸泡过夜。次日，用去离子水冲洗盖玻片三次，每次 30 分钟。
4. 逐片将盖玻片浸入 100% 乙醇中，再在本生灯火焰上灼烧，以实现灭菌。将干燥的盖玻片存放在无菌培养皿中，室温保存至包被前使用。
5. 将盖玻片平铺于 15 cm 培养皿中。每片盖玻片上加入 0.7 ml 0.01% 多聚-L-赖氨酸（PLL），在超净台中室温孵育。
6. 1 小时后，用无菌水冲洗盖玻片三次，每次 30 分钟。用真空抽干盖玻片，并将每片盖玻片转移至 6 cm 培养皿中。
7. 组装微流控腔室时，将带有微沟槽的一面朝下，小心地放置在已包被 PLL 的盖玻片上，注意避免触碰微沟槽。用移液器吸头轻轻下压腔室，确保腔室密封紧密。

3. 神经元培养物的分离及在培养腔室中的接种

1. 将两个 E17-E18 大鼠海马组织（一个脑）在含有 2 ml 分离缓冲液（HBSS，无钙、无镁，含 1% 青霉素/链霉素和 10 mM HEPES）的 15 ml 圆锥形离心管中进行解剖。每次用 5 ml 分离缓冲液冲洗组织 3 次 。尽可能去除分离缓冲液，并加入 900 μl 新鲜的分离缓冲液。
2. 为消化组织，向分离缓冲液中加入 100 μl 10 倍浓度的胰蛋白酶（2.5%），使其工作浓度为 1 倍。将离心管置于 37 °C 水浴中。消化 10 分钟后，加入 100 μl 10 mg/ml 的 DNase I，终浓度约为 1 mg/ml。
3. 使用火焰抛光的巴斯德玻璃移液管，通过上下吹打 5–10 次轻柔地 triturate（机械分散）组织。trituration 完成后立即加入 2 ml 铺板培养基（Neurobasal 加 10% FBS、2 mM GlutaMax、2% B27）以终止胰蛋白酶反应。
4. 将样品置于超净台中静置 5 分钟，使组织碎片充分沉降到管底。小心吸取 2 ml 上清液转移至一个新的无菌 15 ml 圆锥形离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。将沉淀重悬于 50 μl 铺板培养基中。
5. 用血细胞计数板计数细胞。取 15–20 μl 细胞悬液（约 40,000 个细胞）加入微流控芯片的一个腔室中。将芯片放入培养箱中孵育 10 分钟，使细胞贴附在盖玻片上。10 分钟后，加入更多铺板培养基，使芯片的两个腔室均充满培养基。
6. 在解剖后的第二天，将细胞体室和轴突室中的铺板培养基完全更换为维持培养基（Neurobasal 加 2 mM GlutaMax、2% B27）。海马神经元的轴突通常在第 3 天开始穿过微沟道，并在第 5 至第 7 天到达轴突室。在此期间，每 24～48 小时更换一半的培养基，补充新鲜的维持培养基。

4. QD-BDNF 的轴突运输

1. 在进行QD-BDNF轴突运输的活体成像之前，每隔30分钟用不含BDNF和血清的Neurobasal培养基彻底冲洗微流控装置的胞体室和轴突室，持续2小时，以耗尽细胞体和轴突区室中的BDNF。
2. 在BDNF耗尽期间，制备QD-BDNF偶联物。将50 nM单生物素化BDNF二聚体与50 nM QD655-链霉亲和素偶联物在Neurobasal培养基中混合，并在冰上孵育60分钟。
3. 移除轴突室中的培养基，加入300 μl终浓度为0.25 nM的QD-BDNF，在37 °C下孵育4小时。为尽量减少QD-BDNF向细胞体室的扩散，必须始终保持细胞体室的液面高于轴突室。孵育结束后，在进行活体成像前洗去未结合的QD-BDNF。
4. 使用配备100倍油镜的倒置显微镜进行QD-BDNF运输的活体成像。将显微镜及其附带的环境培养箱预热至恒定温度（37 °C）和CO₂浓度（5%）。使用Texas red激发/发射滤光片组观察QD655信号。
5. 使用CCD相机在中间轴突区域以每秒1帧的速度采集并记录共计2分钟的时间序列图像。以无轴突且无QD信号的微沟道作为对照，用于评估非特异性渗入。
6. 使用任意图像分析软件或NIH ImageJ分析BDNF的运输情况。

结果

生物活性单生物素化BDNF的制备与纯化

根据先前发表的方案¹⁰，构建了与AviTag序列（GGGLNDIFEAQKIEWHE）融合的BDNF表达载体。全长融合蛋白的预测分子质量约为32 kDa（http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html）。在HEK293FT细胞中表达并从条件培养基中纯化得到单生物素化成熟BDNF，其预测分子质量为18 kDa（图1A）¹⁰。

收集不同组分并经15% SDS-PAGE分离。使用兔抗Avi标签抗体进行检测，在第一组分中检测到一条分子量约为18 kDa的条带图1B）。为检测制备样品的纯度，采用SDS-PAGE分离样品，并进行银染染色。如图所示 图1C，18 kDa条带是第一次洗脱中的...

讨论

本研究中，我们报道了一种新型技术的开发，用于制备具有生物活性的单生物素化脑源性神经营养因子（mBtBDNF），可用于追踪BDNF的轴突运输。通过将该蛋白与量子点链霉亲和素偶联，并结合微流控小室，该方法能够以单分子灵敏度、实时且具备空间和时间分辨率的方式，在原代神经元中检测BDNF的轴突运输。本文所使用的工具为研究健康与疾病状态下神经元中介导BDNF/TrkB信号内体轴突运输的分子机器提供了有效手段。

BDNF-GFP 或 BDNF-mCherry 已被用于追踪多种神经元培养中 BDNF 的轴突运输 体外这些试剂为研究顺向运输以及可能研究TrkB的自分泌激活提供了一种选择。然而，在研究逆向运输时存在主要缺陷，其中最突出的问题是GFP或mCherry的荧光强度不足以支持单分子水平的研究。先前的研究表明，在生理浓度的NGF条件下，单个NGF二聚体可被内化¹¹ 并逆向运输⁸重要的是，使用量子点标记的BDNF（QD BDNF）还可确定BDNF与其TrkB受体结合的亚细胞定位。当使用GFP或mCherry标记的蛋白时，胞体表达会导致...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Platinum pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT 细胞	Invitrogen	R70007
DMEM-高葡萄糖培养基	Mediatech	10-013-CV
D-生物素	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
抑肽酶	Sigma	A6279
Ni-NTA 树脂	Qiagen	30250
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	S8820
银染试剂盒	G-Biosciences	786-30
人重组 BDNF	Genentech
微流控小室	Xona	SND450
24 × 40 mm No. 1 玻璃盖玻片	VWR	48393-060
多聚-L-赖氨酸	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
胰蛋白酶	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-链霉亲和素偶联物	Invitrogen	Q10121MP
抗 Avi 标签抗体	GenScript	A00674
链霉亲和素-琼脂糖微珠	Life Technology	SA100-04
三氯乙酸	Sigma	T6399
HRP-链霉亲和素	Thermo Scientific	N100
抗 pTrkB 抗体	由纽约大学 M. Chao 博士惠赠
抗 TrkB 抗体	BD Science	610101