脑源性神经营养因子（BDNF）的轴突运输对多种神经元群体的存活和功能至关重要。某些变性类疾病的特点是轴突结构和功能的破坏。我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中检测QD-BDNF活体运输的技术。
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摘要
摘要
脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元存活、分化和功能的多个方面发挥着重要作用。轴突在结构和功能上的缺陷 increasingly 被认为是神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD））的早期特征。然而，诱导轴突损伤的机制尚不明确。我们报道了一种新型技术的开发，用于制备具有生物活性的单生物素化BDNF（mBtBDNF），可用于追踪BDNF的轴突运输。通过将量子点655与mBtBDNF偶联，制备了量子点标记的BDNF（QD-BDNF）。采用微流控装置将轴突与神经元胞体分离。将QD-BDNF加入轴突区后，可实现对BDNF在轴突中运输的活体成像。我们证实，QD-BDNF几乎完全进行逆向运输，移动过程中极少暂停，速度约为1.06 μm/sec。该系统可用于研究AD或HD以及其他退行性疾病中轴突功能障碍的机制。
引言
神经元是高度极化的细胞，其细长且通常高度分支的突起对于建立和维持神经环路的结构与功能至关重要。轴突在向突触运输物质以及从突触反向运输中发挥关键作用。在胞体中合成的蛋白质和细胞器需要通过轴突运输至突触前终末，以维持神经元功能。相应地，远端轴突接收到的信号也必须被转导并传递回胞体。这些过程对神经元的存活、分化和维持至关重要。由于某些神经元的轴突运输距离可超过胞体直径的1000倍以上，因此即使存在轻微的功能缺陷，也可能显著影响神经元及神经环路的功能。
脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族中的一种生长因子，广泛存在于多种脑区，包括海马、大脑皮层和基底前脑。BDNF 通过支持参与认知环路的神经元的存活、分化及功能，在认知和记忆形成中发挥关键作用。BDNF 在轴突末梢与其受体酪氨酸激酶 TrkB 结合，激活 TrkB 介导的信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）以及磷脂酶 C-γ（PLCγ）。参与这些信号通路的蛋白质被包装到内吞囊泡结构上，形成 BDNF/TrkB 信号内体1-6，随后通过逆行运输至神经元胞体。
微流控培养室是研究正常条件下以及损伤和疾病状态下轴突生物学的非常有用的平台7,8。通过将轴突与胞体分离，该装置使得研究人员能够特异性地研究轴突内的物质运输过程8-10。本研究中使用....
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方案
外科手术和动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行。所有涉及动物使用的实验均经加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机构动物护理和使用委员会批准。
1. 单生物素化BDNF（mBtBDNF）质粒克隆、表达与纯化
注意：将 pre-proBDNFavi 和 BirA cDNA 构建到 pcDNA3.1 载体中，并在 HEK293FT 细胞中共同表达10。参照先前发表的成熟且具有生物活性的单生物素化神经生长因子（mBtNGF）的制备方法10，使用 Ni-NTA 琼脂糖珠纯化 mBtBDNF。
2. 微流控腔室的制备
微流控神经元培养装置可实现轴突与神经元胞体的流体隔离。每次解剖前，使用新包被的盖玻片组装培养室。本实验方案中使用的微流控培养室为商业购买产品（见材料与设备表）。经手洗后，商业购买的培养室可重复使用5至6次。
- 用 1% Alconox 手工清洗微流控腔室。每次用 Milli-Q 水冲洗 30 分钟，共冲洗三次。再用 70% 乙醇手工清洗腔室一次。
- 将腔室平铺在超净台内的 Parafilm 上晾干。在紫外线下双面照射并灭菌 20 分钟。将灭菌后的腔室存放于用 Parafilm 密封的无菌 15 ....
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结果
生物活性单生物素化BDNF的制备与纯化
根据先前发表的方案10，构建了与AviTag序列（GGGLNDIFEAQKIEWHE）融合的BDNF表达载体。全长融合蛋白的预测分子质量约为32 kDa（http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html）。在HEK293FT细胞中表达并从条件培养基中纯化得到单生物素化成熟BDNF，其预测分子质量为18 kDa（图1A）10。
收集不同组分并经15% SDS-PAGE分离。使用兔抗Avi标签抗体进行检测，在第一组分中检测到一条分子量约为18 kDa的条带图1B）。为检测制备样品的纯度，采用SDS-PAGE分离样品，并进行银染染色。如图所示 图1C，18 kDa条带是第一次洗脱中的.......
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讨论
本研究中，我们报道了一种新型技术的开发，用于制备具有生物活性的单生物素化脑源性神经营养因子（mBtBDNF），可用于追踪BDNF的轴突运输。通过将该蛋白与量子点链霉亲和素偶联，并结合微流控小室，该方法能够以单分子灵敏度、实时且具备空间和时间分辨率的方式，在原代神经元中检测BDNF的轴突运输。本文所使用的工具为研究健康与疾病状态下神经元中介导BDNF/TrkB信号内体轴突运输的分子机器提供了有效手段。
BDNF-GFP 或 BDNF-mCherry 已被用于追踪多种神经元培养中 BDNF 的轴突运输 体外这些试剂为研究顺向运输以及可能研究TrkB的自分泌激活提供了一种选择。然而，在研究逆向运输时存在主要缺陷，其中最突出的问题是GFP或mCherry的荧光强度不足以支持单分子水平的研究。先前的研究表明，在生理浓度的NGF条件下，单个NGF二聚体可被内化11 并逆向运输8重要的是，使用量子点标记的BDNF（QD BDNF）还可确定BDNF与其TrkB受体结合的亚细胞定位。当使用GFP或mCherry标记的蛋白时，胞体表达会导致.......
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致谢
我们感谢Yue (Pauline) Hu和Rachel Sinit提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院基金（PN2 EY016525）以及唐氏综合征研究与治疗基金会和Larry L. Hillblom基金会的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Platinum pfx DNA 聚合酶 | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT 细胞 | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-高葡萄糖培养基 | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-生物素 | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| 抑肽酶 | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA 树脂 | Qiagen | 30250 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | S8820 | |
| 银染试剂盒 | G-Biosciences | 786-30 | |
| 人重组 BDNF | Genentech | ||
| 微流控小室 | Xona | SND450 | |
| 24 × 40 mm No. 1 玻璃盖玻片 | VWR | 48393-060 | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-链霉亲和素偶联物 | Invitrogen | Q10121MP | |
| 抗 Avi 标签抗体 | GenScript | A00674 | |
| 链霉亲和素-琼脂糖微珠 | Life Technology | SA100-04 | |
| 三氯乙酸 | Sigma | T6399 | |
| HRP-链霉亲和素 | Thermo Scientific | N100 | |
| 抗 pTrkB 抗体 | 由纽约大学 M. Chao 博士惠赠 | ||
| 抗 TrkB 抗体 | BD Science | 610101 |
参考文献
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular O....
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