小鼠背侧皮肤折叠窗模型展示了一个肌皮瓣急性持续性缺血区域的可视化图像。活体落射荧光显微镜技术可用于对微血管系统进行直接、重复的观察，并实现血流动力学的定量分析。形态学与血流动力学结果还可进一步与组织学及分子生物学分析结果进行关联。
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摘要
摘要
尽管外科医生具备深厚的专长和先进的手术技术，由缺血引起的并发症——从伤口裂开到广泛性组织坏死——仍然时有发生，尤其是在皮瓣重建手术中。为了分析其潜在原因和机制，并探索预防缺血性并发症的治疗策略，研究人员已开发出多种实验性皮瓣模型。大多数模型的局限性在于无法对微血管结构和血流动力学进行直接且重复的可视化观察。本实验方案旨在介绍一种成熟的小鼠模型，该模型弥补了前述缺失的要素。哈德 等 建立了一种具有随机灌注模式的肌皮瓣模型，该模型经历急性持续性缺血后，若不进行治疗，10天后会导致约50%的组织坏死。借助活体荧光显微镜技术，该腔室模型可实现对不同感兴趣区域的形态学和血流动力学进行重复性动态观察。可进一步研究并关联分析凋亡、炎症、微血管渗漏和血管生成等相关过程，并与免疫组织化学及分子蛋白检测结果进行比对。迄今为止，该模型已在多项已发表的实验研究中验证了其可行性和可重复性，用于探究缺血组织在缺血前、围缺血期及缺血后处理干预的效果。
引言
在重建手术中，覆盖暴露的肌腱、骨骼和植入材料依赖于皮瓣的应用。皮瓣是指以血管蒂为支撑转移的一块组织，该血管蒂可保证动脉供血和静脉回流。尽管术者经验丰富且有多种可选择的皮瓣可供转移，但仍会出现由缺血引起的并发症，从伤口裂开到完全组织丧失不等。轻微的组织坏死可期待通过保守治疗和二期愈合来修复，但显著的皮瓣坏死通常需要外科再次干预，包括清创、创面准备和二次重建。这会增加患者病痛、延长住院时间，从而导致医疗成本上升。
远端区域远离动脉流入端、血管分布模式不明确或血流灌注随机的皮瓣特别容易发生缺血性损伤。因此，大量实验和临床研究已对轴型皮瓣（具有明确血供）和随机型皮瓣（血供不明确）中坏死的形成进行了评估1-3。这些研究的主要发现通常基于对坏死区域大小的宏观评估。为了更详细地评估组织坏死的原因和机制，一些研究聚焦于微循环的分析。已有多种技术用于测量组织灌注，包括使用极谱电极分析组织氧张力4-5，以及利用激光多普勒血流仪6-7、染料扩散8和微球法9-10测量血流量。然而，这些技术仅能测量组织灌注的间接参数，无法对皮瓣内特定兴趣区域的微血流动力学过程进行形态学分析。
Sandison 被公认为首位使用透明腔室进行长时间活体研究的学者，他曾在兔子身上开展此类实验11。约20年后的1943年，Algire 首次将这种透明腔室改良并应用于小鼠，以研究肿瘤细胞微移植后的行为特征12。由于小鼠属于皮肤松弛的动物，经过随后数年的技术改进，Lehr 及其同事成功开发出一种更小、更轻的钛制背侧皮肤褶腔室。该腔室可结合活体荧光显微镜技术进行评估，该技术能够在不同生理和病理生理条件下（如缺血-再灌注损伤13），对多种形态学和微循环特征及其随时间的变化进行直接、重复的可视化观察。
在研究正常和病理条件下皮肤、肌肉和骨皮瓣的灌注时，出现了两种趋势：第一种是“急性”皮瓣模型，不使用背侧皮肤折叠小室，例如小鼠的带蒂耳部皮瓣14、仓鼠的侧基岛状皮肤皮瓣15以及大鼠的带蒂复合皮瓣16；第二种是“慢性”皮瓣模型，将皮瓣与背侧皮肤折叠小室结合，从而可在数天内通过活体荧光显微镜进行重复的微循环分析。该模型包括一个随机灌注的肌皮瓣，被整合于小鼠的皮肤折叠小室内17。其宽长比设定为在皮瓣切取后10至14天，持续急性缺血状态可稳定导致约50%的皮瓣组织坏死。这种可重复的组织坏死程度，便于进一步评估对皮瓣病理生理过程具有保护作用（即坏死减少）或不利影响（即坏死加重）的各种因素。近年来，已有若干实验研究发表，证明了不同预处理、围手术期处理和术后处理措施的效果，包括给予组织保护性物质18–24以及局部应用生理应激源（如热刺激25和冲击波26）等。
坏死、微血管形态和微循环参数的定量分析可进一步与免疫组织化学分析和蛋白质检测相关联。多种蛋白质和分子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、一氧化氮合酶（NOS）、核因子κB（NF-κB）以及热休克蛋白（HSP-32：血红素加氧酶1（HO-1）和HSP-70），已被证实参与组织保护过程。基于该皮窗模型，已发展出两种改良方法，用于分析皮肤移植愈合过程中的新生血管形成和微循环27，以及轴型血流灌注皮瓣中的血管生成过程28。我们介绍一种可重复且可靠的模型，该模型包含小鼠皮窗中经历缺血挑战的肌皮瓣。该模型可通过活体表层荧光显微镜实现对微循环和血流动力学的可视化与定量分析。
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方案
注意：在实施本模型之前，必须查阅相应的动物保护法律法规，并获得当地主管部门的许可。本研究中所有实验均遵循涉及动物研究的指导原则以及德国动物保护相关法律。实验已获当地动物护理委员会批准。
1. 动物准备与皮瓣的手术切取
- 将动物单只饲养于室温22–24 °C、相对湿度60–65%、12小时昼夜循环的环境中。小鼠可自由获取饮水和标准实验室饲料。生存手术过程中须始终保持无菌条件。
- 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠麻醉，剂量为每10 g体重0.1 ml生理盐水溶液，其中含90 mg/kg体重的盐酸氯胺酮和25 mg/kg体重的盐酸二羟基利多辛噻嗪。麻醉对于动物准备、手术及后续显微镜检查是必要的。通过检测对疼痛刺激的反应来确认麻醉是否充分。在麻醉期间，需在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
- 充分麻醉后，使用电动剃须刀剃除背部毛发。随后，在剃毛区域涂抹脱毛膏以去除残留毛发。
- 在脱毛膏作用时间（约7–10分钟）内，准备器械，包括皮肤镊、显微镊、剪刀和显微剪、缝合材料及标记笔。通过在钛 chamber 底部安装两枚带螺母的螺钉，并固定自粘泡沫垫，对钛 chamber 进行消毒和准备图 1 A-C) 围绕腔室对应部分的窗口以确保腔室系统的密封性。
- 用温水彻底清洗背部，去除所有脱毛膏。然后用含酒精溶液擦干并消毒皮肤。
- 将小鼠置于俯卧位，确定背部中线。在背部中央抓住皮肤并向上提起，形成一个皱褶（图 2A）。通过透射照明（使用任何类型的光源），确定钛框架的临时放置位置（图 2B）。确保胸外侧动脉（LTA）的远端分支在头侧，以及旋髂深动脉（DCIA）在尾侧穿过腔室窗口的中心图 2B-D). 确定好腔室位置后，在皮肤皱褶最底部同时穿透两层皮肤，以便后续固定钛框。现在取下钛框，将小鼠置于俯卧位，必要时重新确定背部中线。
- 从正中线开始，沿垂直于脊柱的方向设计皮瓣，长宽比为15 mm × 11 mm，形成一个侧向分布且随机血供的皮瓣。随后，再标记出向对侧延伸的额外皮肤区域，宽度为2 mm。图 2C，D用镊子夹取该区域，随后将其缝合至钛框架上，注意不要影响可见瓣膜区域。
- 完成最终标记后，切开皮瓣。操作时需横断外侧胸动脉（LTA）和深部胸廓内动脉（DCIA），并抬起皮瓣。图 2E无需对横断的血管进行凝固或结扎。
- 将腔室的螺钉穿过先前制作的皮肤穿孔（图 2F）并使用固定架上的孔和5-0间断缝线，将皮瓣前后两侧的皮褶固定在抬高皮瓣的固定架背侧部分图 2G).
- 使用5-0间断缝线将皮瓣的垂直边缘与周围皮肤缝合图 2H，I).
- 在2毫米小皮肤条的外侧切除一个半圆形区域的皮肤， 即，观察皮瓣另一侧的血管系统。这可通过观察窗直接观察到腔室内的结构，该观察窗面积为90 mm²2.
- 使用显微外科器械和光学放大镜或显微镜，去除骨骼肌表面胶状的疏松结缔组织，以提高显微镜观察时的成像质量。注意避免损伤肌肉组织层内的血管。
- 最后，将之前已在前部、颅侧和后部贴有自粘泡沫条的框架对应部分安装到位以封闭腔室，用局部应用的双苯并咪唑和生理盐水润湿皮瓣图 2J）。随后，使用卡环将带盖玻片的观察窗固定。注意避免在玻片下残留任何气泡。图 2K、L）。皮肤将通过黏附力附着在盖玻片上。
2. 活体表层荧光显微镜检查
- 手术准备后等待24小时，再进行首次显微分析，以获得理想的光学质量。该分析作为显微成像的基线，并在术后第3、5、7和10天重复进行。每次分析时，按照步骤1.2所述方法麻醉小鼠。将动物置于定制的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）载物架上，呈侧卧位，使皮瓣中贴附于盖玻片的肌层组织朝上。
- 通过尾静脉或眶后静脉丛注射 0.05 ml 的 5% 绿色荧光葡聚糖（分子量 150,000）和 0.05 ml 的 1% 高荧光罗丹明家族染料。绿色荧光葡聚糖经静脉内（i.v.）注射后可标记血液中的非细胞成分。荧光罗丹明可标记白细胞和血小板，使其可与其他细胞及非细胞成分区分开来。最后，双苯并咪唑可染色细胞核组分，其荧光强度随染色质凝集状态的不同而有所变化。
- 随后，将小鼠置于显微镜下。确保显微镜配备LED系统——用于470 nm & 425 纳米，365 & 490 nm 和 540 & 580 nm，以及相应的滤光片组（62 HE BFP/GFP/HcRed，范围1：激发波长350–390 nm，分光片395 nm，发射波长402–448 nm；范围2：460–488 nm，分光片495 nm，发射波长500–557 nm；范围3：567–602 nm，分光片610 nm，发射波长615 nm至无限远；20 Rhodamine，激发波长范围：540–552 nm，分光片560 nm，发射波长575–640 nm）。
- 使用电荷耦合器件摄像机记录静态图像和动态影像，并将其保存在计算机硬盘中，以供后续离线分析。
- 使用不同的物镜（2.5X，数值孔径（NA）= 0.06，用于观察腔室的全景；5X，NA = 0.16；10X，NA = 0.32；20X，NA = 0.50；50X，NA = 0.55）对感兴趣区域进行成像记录。
- 通过观察窗将皮瓣表面虚拟地分为三个等高的区域， 即近端、中央以及距离血管流入最远的远端区域（图 3F）进行图像采集时，在每个观察时间点按以下步骤操作：
- 使用5倍物镜，从近端到远端逐层扫描腔室窗口内的组织图像。
- 在皮瓣的每个区域，选择具有易于识别分支模式的二级或三级小动脉及其伴行的小静脉。使用5X、10X或20X物镜，对小动脉-小静脉束进行打印记录，以便在整个观察期间能够方便地重新定位这些血管束。
- 使用20倍物镜和50倍物镜，分别在皮瓣区域进一步记录5–6个毛细血管视野和“凋亡”视野。所有使用10倍和20倍物镜拍摄的图像均采用蓝光（荧光素标记葡聚糖）和绿光（罗丹明）滤光片，而使用5倍和50倍物镜拍摄的图像则分别采用蓝光（荧光素标记葡聚糖）和白光（双苯并咪唑）滤光片。
3. 记录数据的分析
注意：使用计算机辅助图像分析系统对所有记录的参数进行离线定量分析，步骤如下29。
- 测量无灌注组织和坏死组织的面积（mm2）。
- 使用5倍物镜拍摄的完整腔室窗口扫描图像（来自步骤2.6.1）以及荧光标记葡聚糖，以测量无灌注或坏死组织。使用“AreaBo”功能测量无灌注的暗区：勾勒无灌注区域的边界，并利用软件的面积测量算法计算其面积（单位为mm2）。
- 测量小动脉、毛细血管和小静脉中的微血管直径（µm）。
- 将记录的动静脉束或毛细血管区域的视频或图像载入软件中。为获得最佳效果，请使用放大倍数最高且血管边界清晰可见的静态图像或视频。
- 使用软件的“DiamPe”功能，确保测量方向垂直于血管壁。操作时，在血管壁上标记两点，再通过第三次点击标记血管的垂直直径，软件将自动以µm为单位完成测量。
- 在每次记录的相同位置对同一血管重复测量。测量多个毛细血管以获得平均直径。
- 测量小动脉、毛细血管和小静脉中红细胞（RBC）的流速（mm/sec）。
- 使用软件的“VeloLSD”功能测量小动脉中红细胞（RBC）的流速（mm/s），并选择在荧光葡聚糖图像窗口中已测量直径的相同血管进行分析。
- 使用计算机辅助图像分析系统，采用线移法进行分析，该方法基于单位时间内血管内单个灰度模式位移距离（mm）的测量（单位：秒）。
- 测量血管内的体积血流量（pl/sec）。
- 根据Gross和Aroesty公式，结合红细胞流速和血管横截面积（π * r2）计算小动脉、小静脉和毛细血管中的体积血流量（pl/sec），即Q = V * π * r2，假设血管呈圆柱形30。
- 测量红细胞灌注毛细血管的功能性毛细血管密度（营养性灌注：cm/cm2）。
- 将使用20倍物镜放大拍摄的荧光毛细血管区域图像载入软件中。使用“DensLA”功能测量红细胞灌注微血管的功能性毛细血管密度。
- 用光标追踪灌注的毛细血管并标记灌注血管。不要标记无灌注的毛细血管、小动脉或小静脉。软件将自动计算灌注毛细血管的功能性密度（单位为cm/cm2）。对其他记录的毛细血管区域重复上述步骤。
- 测量微血管的扭曲度（微血管重塑）、血管新生的早期征象（如芽状和出芽结构形成）以及新形成的微血管。
- 将记录的荧光毛细血管区域的视频或帧图像载入软件中。识别弯曲的血管，并使用软件的“TorqIx”功能。沿血管走向用光标追踪，最后用右键结束。软件将绘制一条直线表示最短路径，并将其与实际追踪路径进行比较。
注意：注意观察血管新生的征象，例如从原有毛细血管垂直延伸出的芽状结构、出芽结构和新形成的毛细血管。按照步骤3.5所述方法测量这些新生血管的密度。
- 将记录的荧光毛细血管区域的视频或帧图像载入软件中。识别弯曲的血管，并使用软件的“TorqIx”功能。沿血管走向用光标追踪，最后用右键结束。软件将绘制一条直线表示最短路径，并将其与实际追踪路径进行比较。
- 识别凋亡细胞死亡的特征，如核固缩、核碎裂和/或核边集（细胞数/mm2）。
- 将使用50倍物镜拍摄的Hoechst（双苯并咪唑）染色视频载入软件中。使用“DenseNA”功能，根据上述特征（如核固缩、碎裂和边集）用左键标记凋亡细胞。
- 在整个视频中完成所有典型细胞的标记后，点击软件中的“N/A”按钮，系统将自动统计所有标记的细胞数量并除以总面积，结果以凋亡细胞数/mm2表示。
- 分析白细胞黏附于血管内皮的情况，作为炎症反应的指标。包括白细胞间歇性黏附（滚动白细胞；黏附时间<30秒：滚动细胞数/mm2内皮表面）和牢固黏附（黏附白细胞；黏附时间>30秒：黏附细胞数/mm2内皮表面）。
- 通过计数在后微静脉内皮上黏附时间≥30秒的罗丹明标记白细胞（“黏附细胞”）以及间歇性黏附的白细胞（<30秒，“滚动细胞”）来评估炎症反应。小静脉白细胞黏附率以每mm2内皮表面的细胞数表示。
- 测量血管内和间质灰度值，作为微血管渗漏（大分子外渗，E=E1/E2）的参数。
- 在静脉注射荧光葡聚糖后，通过评估大分子渗漏情况来反映微血管通透性。在紧邻毛细血管壁的组织区域（E1）以及血管内边缘无细胞的血浆区域（E2）中，多点测定灰度值，然后计算大分子外渗率（E）为E1/E2的比值31。
4. 术后护理
- 将动物放回单独的笼子中，以避免与其他动物接触，直至其完全恢复。在动物未恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。每日监测动物是否有出血、局部和全身感染迹象以及观察植入腔室的位置。
- 通过观察动物的运动活动、体重、疼痛迹象、对敷料的耐受性以及是否存在自残行为，评估其总体健康状况。
- 每笼饲养一只小鼠，以防止相互触碰腔室。一旦出现疼痛迹象，应以 0.05–0.1 mg/kg 体重的剂量皮下注射布托啡诺，每 8 小时一次。
5. 安乐死与皮褶腔的取出
- 第10天，使用过量麻醉药物（150 mg/kg 戊巴比妥）处死动物。
- 取出植入腔室，采集皮瓣组织用于免疫组织化学和分子蛋白检测。分别用福尔马林固定组织用于常规组织学检查，以及用液氮或干冰保存组织用于定量蛋白检测。
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结果
坏死
该模型的主要终点是皮瓣切取后发生的组织坏死即， 急性持续性缺血的诱导）被反复测量，并以宏观图像形式展示，如图所示 图3 在10天内。皮瓣坏死的最终分界通常发生在术后第5至7天，其特征为红色边缘， 即，血管扩张和微血管重塑区域，位于皮瓣近端存活区与远端坏死区之间图 3D-F）。未经治疗的对照组小鼠通常在10天后出现约50%的坏死区域，该区域可分为三个不同部分：灌注良好的近端区域、中间的灌注临界中央区域以及远端坏死区域。图 3F如引言中所述，我们课题组先前的研究表明，不同的预处理方案具有保护作用，其特征是皮瓣缺血临界灌注区域从中央区向远端区转移。
血管参数
通过测量不同直径的微动脉和微静脉以及邻近毛细血管的微血管直径和红细胞（RBC）流速，并在离线状态下计算相应的体积...
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讨论
为了减少缺血性并发症，从而改善临床预后，需要更深入地了解灌注临界皮瓣组织中的病理生理过程。因此，建立能够模拟急性持续性缺血的新型动物模型势在必行。基于此，我们成功建立了一种易于重复且可靠的模型，可对肌肉和皮肤血管系统的多种参数进行重复的形态学、动态及功能性实时评估，并可将这些评估结果与所取皮瓣组织的免疫组织化学及分子分析结果进行关联分析。
该手术操作无需特殊的外科技术，但需要一定的练习和手工灵巧性。通常需要完成约25至30只动物的手术学习曲线，才能熟练掌握背侧皮肤折叠窗的安装及皮瓣制备。对于经验丰富的操作者，手术平均耗时35分钟。皮瓣制备的关键步骤包括：利用透射照明准确定位皮瓣在窗 chamber 中央的位置和轮廓，精确确定需横断的主要血管位置，以及在图像放大条件下仔细去除位于肉膜层上方的凝胶样组织，以提高成像质量。
由于皮瓣尺寸以毫米为单位，我们建议使用滑动卡尺进行准确的皮瓣标记。若在将水平走行的优势血管置于观察窗内时遇到困难，应选择较远端而非较近端的位置。正确放置穿过观察窗的这些血管，可确保在从远端向近端切取皮瓣时将其横断...
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致谢
感谢 Katharina Haberland 在图像编辑方面的帮助。 基金信息：高级作者获得了慕尼黑工业大学 KKF 资助，用于建立一个新的研究实验室。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-8 周龄，20-22 克重的 C57Bl/6 小鼠 | Charles River | ||
| 脱毛膏 | Balea | 任意品牌的脱毛膏 | |
| 钛合金固定腔 | Irola | 160001 | Halteblech M |
| 定制有机玻璃安装框架 | 用于固定腔体，防止因动物呼吸导致腔体移动的框架。 | ||
| 开槽圆头螺钉 | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| 六角全螺母 | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| 卡簧 | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1.0 |
| 盖玻片 | Volab | 定制盖玻片，直径 11.8 mm。 | |
| 固定泡沫 | tesamoll | 05559-100 | tesamoll 标准 I 型材 |
| 盐酸氯胺酮 | Parke Davis | Ketavet® | |
| 盐酸二羟甲嗪 | Bayer | Rompun® | |
| 丁丙诺啡 | Essex Pharma | Temgesic® | |
| 0.9% 生理盐水 | |||
| 消毒酒精 | |||
| Vicryl 5-0 缝线 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 缝线 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml 注射器 | |||
| 带柔性尺的外科皮肤标记笔 | Purple surgical | PS3151 | 任意品牌的外科皮肤标记笔和柔性尺 |
| 尖头剪刀 | |||
| 显微剪刀 | |||
| 普通剪刀 | |||
| 2 个止血钳 | |||
| 精细解剖镊 | |||
| 显微镊 | |||
| 六角螺母起子 | wiha | 1018 | |
| 螺丝刀 | wiha | 685 | |
| 卡簧钳 | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| 线缆剪 | Knipex | 70 02 160 | 用于截短螺钉；160 mm |
| 透射照明光源 | IKEA | 501.632.02 | LED 灯 Jansjö；任意光源 |
| 放大镜 | |||
| 活体显微镜 | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED 系统 | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| 365 nm LED 模块 | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| 470 nm LED 模块 | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| 540-580 nm LED 模块 | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| 滤光片组 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | 范围 1：350-390 nm 激发波长，分光 395 nm / 402-448 nm；范围 2：460-488 nm，分光 495 nm / 500-557 nm；范围 3：567-602 nm，分光 610 nm / 615 nm 至无穷。 |
| 滤光片组 20 罗丹明 | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm，分光 560 nm，发射 575-640 nm |
| 2.5X 物镜 NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X 物镜 NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X 物镜 NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X 物镜 NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X 物镜 NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN 成像软件 | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| 三盐酸双苯并咪唑 H 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 吞咽有害；可引起严重皮肤灼伤和眼部损伤，可能引起呼吸道刺激。 |
| 罗丹明 6G 氯化物 | Invitrogen | R634 | 吞咽有害；可能引起遗传缺陷；可能致癌；可能损害生育能力或胎儿。 |
| 戊巴比妥 | Merial | Narcoren® |
参考文献
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