小鼠背侧皮肤折叠窗模型中的缺血性组织损伤：一种用于研究急性持续性缺血的皮瓣模型

摘要

小鼠背侧皮肤折叠窗模型展示了一个肌皮瓣急性持续性缺血区域的可视化图像。活体落射荧光显微镜技术可用于对微血管系统进行直接、重复的观察，并实现血流动力学的定量分析。形态学与血流动力学结果还可进一步与组织学及分子生物学分析结果进行关联。

摘要

尽管外科医生具备深厚的专长和先进的手术技术，由缺血引起的并发症——从伤口裂开到广泛性组织坏死——仍然时有发生，尤其是在皮瓣重建手术中。为了分析其潜在原因和机制，并探索预防缺血性并发症的治疗策略，研究人员已开发出多种实验性皮瓣模型。大多数模型的局限性在于无法对微血管结构和血流动力学进行直接且重复的可视化观察。本实验方案旨在介绍一种成熟的小鼠模型，该模型弥补了前述缺失的要素。哈德 等 建立了一种具有随机灌注模式的肌皮瓣模型，该模型经历急性持续性缺血后，若不进行治疗，10天后会导致约50%的组织坏死。借助活体荧光显微镜技术，该腔室模型可实现对不同感兴趣区域的形态学和血流动力学进行重复性动态观察。可进一步研究并关联分析凋亡、炎症、微血管渗漏和血管生成等相关过程，并与免疫组织化学及分子蛋白检测结果进行比对。迄今为止，该模型已在多项已发表的实验研究中验证了其可行性和可重复性，用于探究缺血组织在缺血前、围缺血期及缺血后处理干预的效果。

引言

在重建手术中，覆盖暴露的肌腱、骨骼和植入材料依赖于皮瓣的应用。皮瓣是指以血管蒂为支撑转移的一块组织，该血管蒂可保证动脉供血和静脉回流。尽管术者经验丰富且有多种可选择的皮瓣可供转移，但仍会出现由缺血引起的并发症，从伤口裂开到完全组织丧失不等。轻微的组织坏死可期待通过保守治疗和二期愈合来修复，但显著的皮瓣坏死通常需要外科再次干预，包括清创、创面准备和二次重建。这会增加患者病痛、延长住院时间，从而导致医疗成本上升。

远端区域远离动脉流入端、血管分布模式不明确或血流灌注随机的皮瓣特别容易发生缺血性损伤。因此，大量实验和临床研究已对轴型皮瓣（具有明确血供）和随机型皮瓣（血供不明确）中坏死的形成进行了评估^1-3。这些研究的主要发现通常基于对坏死区域大小的宏观评估。为了更详细地评估组织坏死的原因和机制，一些研究聚焦于微循环的分析。已有多种技术用于测量组织灌注，包括使用极谱电极分析组织氧张力^4-5，以及利用激光多普勒血流仪^6-7、染料扩散⁸和微球法^9-10测量血流量。然而，这些技术仅能测量组织灌注的间接参数，无法对皮瓣内特定兴趣区域的微血流动力学过程进行形态学分析。

Sandison 被公认为首位使用透明腔室进行长时间活体研究的学者，他曾在兔子身上开展此类实验¹¹。约20年后的1943年，....

方案

注意：在实施本模型之前，必须查阅相应的动物保护法律法规，并获得当地主管部门的许可。本研究中所有实验均遵循涉及动物研究的指导原则以及德国动物保护相关法律。实验已获当地动物护理委员会批准。

1. 动物准备与皮瓣的手术切取

1. 将动物单只饲养于室温22–24 °C、相对湿度60–65%、12小时昼夜循环的环境中。小鼠可自由获取饮水和标准实验室饲料。生存手术过程中须始终保持无菌条件。
2. 通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠麻醉，剂量为每10 g体重0.1 ml生理盐水溶液，其中含90 mg/kg体重的盐酸氯胺酮和25 mg/kg体重的盐酸二羟基利多辛噻嗪。麻醉对于动物准备、手术及后续显微镜检查是必要的。通过检测对疼痛刺激的反应来确认麻醉是否充分。在麻醉期间，需在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
3. 充分麻醉后，使用电动剃须刀剃除背部毛发。随后，在剃毛区域涂抹脱毛膏以去除残留毛发。
4. 在脱毛膏作用时间（约7–10分钟）内，准备器械，包括皮肤镊、显微镊、剪刀和显微剪、缝合材料及标记笔。通过在钛 chamber 底部安装两枚带螺母的螺钉，并固定自粘泡沫垫，对钛 chamber 进行消毒和准备图 1 A-C) 围绕腔室对应部分的窗口以确保腔室系统的密封性。
5. 用温水彻底清洗背部，去除所有脱毛膏。然后用含酒精溶液擦干并....

结果

坏死

该模型的主要终点是皮瓣切取后发生的组织坏死即， 急性持续性缺血的诱导）被反复测量，并以宏观图像形式展示，如图所示 图3 在10天内。皮瓣坏死的最终分界通常发生在术后第5至7天，其特征为红色边缘， 即，血管扩张和微血管重塑区域，位于皮瓣近端存活区与远端坏死区之间图 3D-F）。未经治疗的对照组小鼠通常在10天后出现约50%的坏死区域，该区域可分为三个不同部分：灌注良好的近端区域、中间的灌注临界中央区域以及远端坏死区域。图 3F如引言中所述，我们课题组先前的研究表明，不同的预处理方案具有保护作用，其特征是皮瓣缺血临界灌注区域从中央区向远端区转移。

血管参数

通过测量不同直径的微动脉和微静脉以及邻近毛细血管的微血管直径和红细胞（RBC）流速，并在离线状态下计算相应的体积.......

讨论

为了减少缺血性并发症，从而改善临床预后，需要更深入地了解灌注临界皮瓣组织中的病理生理过程。因此，建立能够模拟急性持续性缺血的新型动物模型势在必行。基于此，我们成功建立了一种易于重复且可靠的模型，可对肌肉和皮肤血管系统的多种参数进行重复的形态学、动态及功能性实时评估，并可将这些评估结果与所取皮瓣组织的免疫组织化学及分子分析结果进行关联分析。

该手术操作无需特殊的外科技术，但需要一定的练习和手工灵巧性。通常需要完成约25至30只动物的手术学习曲线，才能熟练掌握背侧皮肤折叠窗的安装及皮瓣制备。对于经验丰富的操作者，手术平均耗时35分钟。皮瓣制备的关键步骤包括：利用透射照明准确定位皮瓣在窗 chamber 中央的位置和轮廓，精确确定需横断的主要血管位置，以及在图像放大条件下仔细去除位于肉膜层上方的凝胶样组织，以提高成像质量。

由于皮瓣尺寸以毫米为单位，我们建议使用滑动卡尺进行准确的皮瓣标记。若在将水平走行的优势血管置于观察窗内时遇到困难，应选择较远端而非较近端的位置。正确放置穿过观察窗的这些血管，可确保在从远端向近端切取皮瓣时将其横断.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-8 周龄，20-22 克重的 C57Bl/6 小鼠	Charles River
脱毛膏	Balea		任意品牌的脱毛膏
钛合金固定腔	Irola	160001	Halteblech M
定制有机玻璃安装框架			用于固定腔体，防止因动物呼吸导致腔体移动的框架。
开槽圆头螺钉	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
六角全螺母	Screws and More	93422	DIN934 M2
卡簧	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1.0
盖玻片	Volab		定制盖玻片，直径 11.8 mm。
固定泡沫	tesamoll	05559-100	tesamoll 标准 I 型材
盐酸氯胺酮	Parke Davis		Ketavet®
盐酸二羟甲嗪	Bayer		Rompun®
丁丙诺啡	Essex Pharma		Temgesic®
0.9% 生理盐水
消毒酒精
Vicryl 5-0 缝线	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0 缝线	Ethicon	EH 7823 H
1 ml 注射器
带柔性尺的外科皮肤标记笔	Purple surgical	PS3151	任意品牌的外科皮肤标记笔和柔性尺
尖头剪刀
显微剪刀
普通剪刀
2 个止血钳
精细解剖镊
显微镊
六角螺母起子	wiha	1018
螺丝刀	wiha	685
卡簧钳	Knipex	4411J1	12-25 mm
线缆剪	Knipex	70 02 160	用于截短螺钉；160 mm
透射照明光源	IKEA	501.632.02	LED 灯 Jansjö；任意光源
放大镜
活体显微镜	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED 系统	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
365 nm LED 模块	Zeiss	423052-9011-000
470 nm LED 模块	Zeiss	423052-9052-000
540-580 nm LED 模块	Zeiss	423052-9121-000
滤光片组 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	范围 1：350-390 nm 激发波长，分光 395 nm / 402-448 nm；范围 2：460-488 nm，分光 495 nm / 500-557 nm；范围 3：567-602 nm，分光 610 nm / 615 nm 至无穷。
滤光片组 20 罗丹明	Zeiss	485020-0000-000	540-552 nm，分光 560 nm，发射 575-640 nm
2.5X 物镜 NA=0.06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2.5X/0.06
5X 物镜 NA=0.16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27
10X 物镜 NA=0.30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27
20X 物镜 NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27
50X 物镜 NA=0.55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27
ZEN 成像软件	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	Sigma-Aldrich	45946
三盐酸双苯并咪唑 H 33342	Sigma-Aldrich	B2261	吞咽有害；可引起严重皮肤灼伤和眼部损伤，可能引起呼吸道刺激。
罗丹明 6G 氯化物	Invitrogen	R634	吞咽有害；可能引起遗传缺陷；可能致癌；可能损害生育能力或胎儿。
戊巴比妥	Merial		Narcoren®