本文描述了一种用于构建电子舌（eT）的新方法，该方法极大地简化了传感材料的设计与制备过程，并使电子舌能够对液体样品产生连续的演化图谱和轮廓。所获得的电子舌在常见蛋白质分析（如区分鉴别）方面具有高效性。
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本文内容
摘要
摘要
在本方案中，开发了一种组合方法，以简化用于蛋白质分析的电子舌（eT）传感材料的设计与制备。通过将少量具有不同理化性质、简单且易于获取的分子作为构筑单元（BBs），以不同且可控的比例混合，并使其在棱镜的金表面自组装，从而构建出一系列具有适宜蛋白质检测性能的组合表面。通过该方法，可快速高效地获得大量交叉响应型受体。将此类组合交叉响应型受体阵列（CoCRRs）与表面等离子体共振成像（SPRi）等光学检测系统相结合，所构建的电子舌可实时监测液相样品中的结合事件，并生成包括二维连续演化图谱（CEP）和三维连续演化景观（CEL）在内的连续识别模式。该电子舌系统可有效区分常见的纯化蛋白质。
引言
精确且快速的蛋白质检测方法在医学诊断和蛋白质组学中具有重要意义。传统的蛋白质检测阵列（如生物芯片）基于“锁钥”识别原理，需要特定的受体，例如适配体、抗体或模拟物。
近年来，受人类嗅觉和味觉启发的差异传感技术已成为一种替代方法1。这种电子鼻/电子舌（eN/eT）方法基于分析物与一组交叉反应性受体（CRRs）的差异性结合，这些受体无需对目标分子具有高度特异性或选择性，因而能够避免开发高选择性受体所带来的繁琐过程。所有受体的联合响应为每种样品生成独特的响应模式，类似于指纹，从而实现样品的识别。
开发用于有效蛋白质检测的电子鼻/电子舌所面临的两个关键挑战是：制备能够区分结构相似分析物的传感元件，以及为结合事件提供合适的信号转导系统。迄今为止，已有研究报道了多种用于传感器阵列开发的方法2。例如，一项研究利用四羧基苯基卟啉衍生物制备共价受体阵列（CRRs），通过将羧基与各种氨基酸或二肽偶联，形成具有疏水核心（可与蛋白质产生亲和力）和不同电荷外围（实现差异化结合）的差异性受体，从而实现基于阵列的蛋白质识别。利用该系统，通过检测受体与分析物相互作用后荧光的猝灭程度，实现了对不同蛋白质及蛋白质混合物的识别3,4。在另一项研究中，采用组合化学方法在六取代苯骨架上合成了包含三肽和硼酸基团的29种CRRs文库，并结合指示剂摄取比色法用于蛋白质检测5,6。在此....
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方案
1. 各种溶液和蛋白质样品的制备
- 配制含有 50 mM NaH 的 100 ml 磷酸盐缓冲液（PBS-G）2PO4，50 mM NaCl 和 10% 甘油，pH 6.8。
- 配制 250 ml HEPES 缓冲液，含 10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，pH 调至 7.4。
- 配制构筑单元1（BB1）乳糖和构筑单元2（BB2）硫酸化乳糖的储备溶液图1) 在 PBS-G 中浓度为 0.2 mM。
- 在 HEPES 中制备 1 ml 蛋白质溶液：Arachis hypogaea 凝集素（AHL）500 nM，肌红蛋白 1 µM，溶菌酶 500 nM。
- 用超纯水配制20 ml 1% SDS溶液。
2. CoCRR 芯片的制备
- 使用等离子清洗仪在使用前48小时清洁棱镜的金表面，清洗条件如下：75% 氧气，25% 氩气，0.6 mbar，功率40 W，清洗3分钟。
- 在PBS-G缓冲液中，以总BB浓度为0.1 mM，按[BB1]/([BB1]+[BB2])比例从0%到100%以10%为增量，配制十一份纯品及混合溶液。
- 使用非接触式点样仪，在棱镜表面每种比例溶液点样8....
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结果
为了探究电子舌在常见蛋白质分析中的能力，选用了三种蛋白质：AHL、肌红蛋白和溶菌酶。对于每种蛋白质，电子舌均生成了独特的二维连续进化图谱（CEP），如图6所示。
此外，由于 SPRi 能够实时监测吸附和解吸动力学，因此针对每种蛋白质均生成了一种时间依赖性的连续识别模式，称为三维连续演化图谱（CEL）。图7展示了这三种蛋白质的典型 CEL。
图1. 本实验方案中用于制备CoCRR阵.......
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讨论
构建该eT系统最关键的步骤在于确保系统具有良好的可重复性。例如，在使用前采用标准化程序清洁棱镜的金表面，在BB1和BB2的11种纯溶液及混合溶液中添加10%甘油，以消除BB分子在棱镜金表面自组装过程中溶剂的挥发，针对每个[BB1]/([BB1]+[BB2])比例沉积多个重复样本， etc。对于SPRi蛋白检测而言，工作角度的选择至关重要，通常将其设定在反射率曲线斜率最大的位置。此外，每次蛋白检测均需采用标准化的实验条件，如工作温度、流速等， etc。每次蛋白注入后，必须使用适当的溶液对CoCRR阵列进行再生，以实现系统的重复使用，同时确保受体不受任何损伤并完全恢复其活性。
为了证明所开发的 eT 不仅如先前报道的那样9适用于糖结合蛋白的研究，也适用于普通蛋白质，本研究选用了一种凝集素 AHL 以及两种非糖结合蛋白——肌红蛋白和溶菌酶。这些蛋白在 HEPES 缓冲液（pH 7.4）中具有不同的电荷特性：AHL（等电点（pI）为 6.0）、肌红蛋白（pI 为 7.2）和溶菌酶（pI 为 11）。值得注意的是，.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢格勒诺布尔 LANEF 博士项目对 Laurie-Amandine Garçon 的资助支持。本工作由法国国家科研署（ANR 资助号：06-NANO-045）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SPRi 仪器 | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi 仪器置于 25 °C 的温度控制培养箱中。 | |
| 培养箱 | Memmert | ||
| 注射泵 | Cavro 科学仪器公司 | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite 脱气装置 | Alltech | AT590507 | |
| 六通中压进样阀 | Upchurch Scientific | 所用进样环体积为 500 µl。 | |
| Femto 等离子清洗仪（版本 7） | Diener Electronic | 配备双通道在线脱气系统。 | |
| 点样仪 | Siliflow | 为一种非接触式压电点样仪。 | |
| SPRi 生物芯片 | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | 棱镜由高折射率玻璃制成，表面镀有薄金膜（45 nm），专为成像应用而设计。 |
| Erythrina cristagalli 凝集素 | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea 凝集素 | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| 肌红蛋白 | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | 由 Hugues Lortat-Jacob 博士提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息 | ||
| CXCL12γ | 由 Hugues Lortat-Jacob 博士提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息 | ||
| 乳糖 | 由 David Bonnaffé 教授提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息 | ||
| 硫酸化乳糖 | 由 David Bonnaffé 教授提供；制备细节参见参考文献 9 的支持信息 | ||
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 |
参考文献
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general app....
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