电子舌生成连续的识别模式的蛋白质分析

Summary

描述了一种构建电子舌 （eT） 的新方法，该方法大大简化了传感材料的设计和生产，并允许 eT 为液体中的样品生成连续的演化曲线和景观。获得的 eT 对于常见的蛋白质分析（如鉴别）非常有效。

Abstract

在当前的协议中，已经开发了一种组合方法来简化用于构建用于蛋白质分析的电子舌 （eT） 的传感材料的设计和生产。通过将少量具有不同物理化学性质的简单且易于获得的分子混合，用作构建单元 （BB），以不同且受控的比例混合，并允许混合物在棱柱的金表面上自组装，从而创建了一系列具有蛋白质传感适当特性的组合表面。通过这种方式，可以快速有效地获得大量的交叉反应受体。通过将这种组合交叉反应受体 （CoCRR） 阵列与表面等离子体共振成像 （SPRi） 等光学检测系统相结合，获得的 eT 可以实时监测结合事件并生成连续识别模式，包括 2D 连续进化曲线 （CEP） 和 3D 连续进化景观 （CEL） 液体样品。这种 eT 系统对于区分常见的纯化蛋白质是有效的。

Introduction

精确和快速蛋白检测方法是在医学诊断学和蛋白质组学非常重要。经典的蛋白检测阵列，如生物芯片，是基于“锁和钥匙”的识别原则和需要特定的受体，如适体，抗体，或其模拟物。

近年来，差分检测灵感来自于人类的嗅觉和味觉已经成为一种替代^1。这种电子鼻/舌（EN / ET）的方法是基于差分分析物结合到交叉反应的受体（CRR），它们，这并不需要是高度特异性的或选择性的靶标分子的阵列从而允许克服费力开发高选择性受体的过程。这是所有的受体结合反应，创建一个独特的模式为每个样品，就像指纹一样，允许其身份。

在ELEC发展的两个关键挑战tronic的鼻/舌为有效蛋白质检测是生产具有到中间结构上相似的分析物和对于该结合事件的适当的转导系统分辨能力感测元件。到现在为止，研究已经报道的各种方法，以阵列发展^2。例如，在一项研究中的蛋白的基于阵列的识别，使用从四carboxyphenylporphyrin衍生物制备CRRs通过偶联的羧基以不同的氨基酸或二肽，以提供差动受体具有疏水核的蛋白质和不同的带电周边的亲和力开发传授鉴别约束力。使用本系统时，不同的蛋白质和蛋白质的混合物进行鉴定相互作用时测量受体的荧光猝灭与待测物^3,4。在另一项研究中，29 CRRs含三肽和硼酸部分库的组合合成的方式在hexasubstituted苯支架被用于检测蛋白质与指示剂摄取比色检测^5,6研制....

Protocol

1，准备各种解决方案和蛋白样品

1. 制备100毫升含有50mM的NaH ₂ PO _4，50 mM氯化钠的磷酸盐缓冲液（PBS-G）和10％甘油在pH为6.8。
2. 准备加入250ml含有10mM HEPES，150 mM氯化钠，0.005％吐温20，在pH 7.4的HEPES缓冲液等。
3. 制备积木1（BB1），乳糖和积木2（BB2）硫酸化乳糖（ 图1）的储备溶液在0.2 mM的PBS中-G。
4. 准备1毫升蛋白质溶液中的HEPES：一个脊柱。花生凝集素（AHL），在500nm时，肌红蛋白在1微米，溶菌酶在500nm左右。
5. 在超纯水准备20毫升1％的SDS。

2，制备CoCRR阵列

1. 清洁棱镜48小时在这些条件下用等离子清洗机使用3分钟前的金表面：75％氧，25％的氩气，0.6毫巴，功率40瓦。
2. 准备11混交林及纯solutioBB1和BB2与[BB1] /纳秒（[BB1] + [BB2]）由10％的在0.1 mM的PBS中-G共BB浓度增量在0和100％的比率。
3. 存款用一式四份的非接触性去污剂对每个比率为44点总数（ 图2）上的棱镜面这些纯与混合溶液8 NL液滴。
   注：10％甘油的PBS-G加入....

Results

探测电子舌的常见蛋白质分析的能力，三种蛋白分别采用：AHL，肌红蛋白和溶菌酶。对于每种蛋白，明显的二维连续演化信息，CEP，是由ET产生，如示于图6。

此外，由于SPRI，其能够监测实时的吸附和解吸的动力学，对于每个蛋白质与时间相关的连续的识别模式，称为三维连续进化景观（CEL），被生成的。在图7中，示出了这三种蛋白质的特性的CEL。

在这个协议中使用的两个积木的图1的化学结构以制备CoCRR阵列。51901 / 51901fig1highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

Discussion

专用于结构本等的最重要的步骤，以确保良好的系统的再现性。例如，清洁的棱镜的金表面在使用前用标准程序，在BB1和BB2的11纯与混合溶液中加入甘油10％时在棱镜的金表面黑带的自组装，以消除溶剂蒸发，沉积多次重复为每个[BB1] /（[BB1] + [BB2]）的比例， 等等 。作为用于蛋白检测由SPRI，工作角度的选择是至关重要的。通常，它被固定在反射率曲线的最大斜率。此外，它是使用标准化的实验条件下对每个蛋白检测，如工作温度，流量等非常重要。每种蛋白注射后，CoCRR阵列必须再利用再生用适当的解决方案，允许该系统的完全再生，但无受体的任何损害。

e_content“>为了证明开发等，不仅有效于如先前报道⁹糖结合蛋白的研究，而且对于普通的蛋白质，1凝集素AHL连同两个非糖结合蛋白肌红蛋白和溶菌酶被使用，它们被选择为具有各种电荷在HEPES（pH 7.4）中：AHL（等电点（pI）6.0），肌红蛋白（等电点7.2）和溶菌酶（pI值11）值得注意的是， 如图6所示，每个蛋白质具有独特的响应模式。AHL稍微负在HEPES充电。及.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SPRi 仪	Horiba Scientific-GenOptics		SPRi 仪置于 25 &°C 的温度调节培养箱中。
Incubator	Memmert
注射泵	Cavro科学仪器	Cavro XLP 6000
Micro Elite脱气机	Alltech	AT590507
6 端口中压注射阀	Upchurch Scientific		使用的注射回路体积为 500 &μ;l。
Femto 等离子清洗机（7 型）	Diener Electronic		在线脱气系统，带 2 个通道。
点样器	Siliflow		它是一种非接触式压电点样器。
SPRi-Biochip	Horiba Scientific-GenOptics	36000067	棱镜由涂有金薄膜 （45 nm） 的高折射率玻璃棱镜制成，专为成像目的而开发。
Erythrina cristagalli 凝集素	Sigma-Aldrich	L5390
花生低谷凝集素	Sigma-Aldrich	L0881
肌红蛋白	Sigma-Aldrich	M1882
溶菌酶	Sigma-Aldrich	L6876
CXCL12α			由 Hugues Lortat-Jacob 博士提供;有关制备的详细信息，请参阅参考文献 9
CXCL12&gamma 中的支持信息;			由 Hugues Lortat-Jacob 博士提供;有关制备的详细信息，请参阅参考文献 9
Lactose			由 David Bonnaffé 教授提供的支持信息;;有关制备的详细信息，请参阅参考文献 9
Sulfated Lactose			David Bonnaffé 教授提供;;有关制备的详细信息，请参阅参考文献 9
甘油中的支持信息	Sigma-Aldrich	G5150
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
吐温 20	Sigma-Aldrich	274348
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S0751
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014