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方法文章

基于转座酶技术的gDNA富集用于NGS分析BRCA1、BRCA2及9个DNA损伤修复相关基因的全序列

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DOI：

10.3791/51902

⸱

2014年10月6日

 , 
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

本文内容

摘要

用于NGS测序的基因组DNA富集是研究遗传性突变的一种简便而强大的工具。本文介绍了对11个参与DNA损伤修复的基因进行完整序列分析的实验流程。

摘要

下一代测序技术的广泛应用为癌症研究和诊断开辟了新的途径。NGS 将带来海量关于癌症、尤其是癌症遗传学的新数据。当前的知识和未来的发现将要求我们必须研究大量可能与癌症遗传易感性相关的基因。为此，我们开发了一种 Nextera 设计，用于研究 11 个参与 DNA 损伤修复的完整基因。本方案旨在对 24 名患者同时安全地检测 11 个基因（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80 和 TP53）从启动子区到 3'-UTR 的完整序列。该方案基于转座酶技术和基因组 DNA 富集方法，通过样本多重分析显著缩短了遗传诊断所需时间。本方案可安全地用于血液来源的基因组 DNA。

引言

2010年，全球近150万人（几乎均为女性）被诊断出乳腺癌。据估计，其中5%至10%的病例为遗传性。近20年前，BRCA1 和 BRCA2 被确认与遗传性乳腺癌和卵巢癌相关1。大约15年来，BRCA1 和 BRCA2 的编码区已被测序，用于确定乳腺癌和卵巢癌的遗传易感性。在10%至20%的特定家族中可检测到 BRCA1 和 BRCA2 的变异2，这表明仅分析这些区域尚不足以实现有效的筛查。近年来，对 BRCA1 和 BRCA2 非编码序列（启动子、内含子、3'-非翻译区）的分析表明，新的突变或变异可能与更高的乳腺癌风险相关3-6。

BRCA1 和 BRCA2 蛋白参与同源重组修复（Homologous Recombination Repair, HHR），该过程由多个协作因子共同完成7。尽管 BRCA1 或 BRCA2 的变异会导致 DNA 修复功能缺陷，但其他协作因子也可能影响乳腺癌的发病风险。这一假说似乎已得到验证，因为 BRIP18 和 PALB29 分别被证实与宫颈癌和乳腺癌相关。此外，另外两个“中等风险”的乳腺癌易感基因 ATM 和 CHEK2 也可能被常规研究10。

在这些研究的基础上，我们决定开发一种实验方案，利用基于转座酶技术的简便且相对快速的方法，在中等通量测序设备上对24名患者同时分析11个基因（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAP80 和 TP53），并进行富集与测序。得益于该技术，除 RAP80 基因中一段2,500 bp的内含子区域未被覆盖（Chr5: 176,381,588-176,390,180）外，其余基因均实现了从启动子起始端至3’-UTR末端的全长测序。本研究共检测约1,000,300 bp的序列，使用了2,734个探针。通常情况下，BRCA1 和 BRCA2 的外显子序列采用Sanger测序法分析，对少于20名患者完成检测需1.5个月。而采用本实验方案（图1），在相同时间内可完成超过75名患者的11个完整基因的分析。

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方案

1. 基因组DNA（gDNA）得率的评估

  1. 在文库制备前，对新提取的基因组DNA（gDNA）进行定量。采用荧光定量法测定完整gDNA的浓度（避免使用分光光度计进行gDNA定量）。测定（260/280 nm）吸光度比值，并确保其在1.8至2.0之间。注意：本实验需要50 ng的gDNA。

2. 基因组DNA富集：第1天上午

  1. 开始前准备
    1. 从DNA富集试剂盒（见材料/设备表）中，将DNA缓冲液（TD）和DNA酶（TDE1）溶液在冰上解冻。使用前至少30分钟，将纯化磁珠和终止靶向缓冲液（ST）恢复至室温（RT）。每份样本取20 µl浓度为2–2.5 ng/µl的基因组DNA直接加入96孔板中，每样本一孔。重要提示：使用阳性对照以验证实验流程（含已知序列变异的样本）。
  2. 标签化
    1. 将所有试剂颠倒混匀5次，然后短暂离心。室温下，向每孔含50 ng（20 µl）基因组DNA的样品中加入25 µl TD缓冲液，再加入5 µl TDE1缓冲液。将移液器调至50 μl，轻柔地上下吹吸全部液体10次。
    2. 用粘性封板膜覆盖反应板，在20 °C、280 × g条件下离心1分钟。随后将反应板放入热循环仪（盖子加热至100 °C）中，运行以下程序：55 °C孵育5分钟，10 °C保持无限长时间。
    3. 孵育期间，使用 Experiment Manager 软件准备样本表，以定义将要使用的索引。
  3. 标签化片段纯化
    注意：此步骤至关重要，请务必小心谨慎。
    1. 检查纯化磁珠和ST缓冲液中是否存在沉淀。如果出现沉淀，将溶液置于手中温育。将重悬缓冲液（RSB）在冰上解冻。
    2. 室温下涡旋ST溶液，向每孔样品中加入15 µl。将移液器调至65 μl，轻柔地将每孔液体上下吹打10次。室温孵育5分钟。用板盖覆盖板孔，在20 °C、280 × g条件下离心1分钟。
    3. 每孔加入52 µl预先混合好的纯化磁珠。将移液器设为117 μl，轻柔吹打混匀10次。室温孵育10分钟。用封板膜覆盖平板，在20 °C、280 × g条件下离心1分钟。
    4. 移除粘性封膜。将96孔板置于磁力架上，室温静置2分钟。确保上清液完全澄清。
    5. 配制新鲜的80%乙醇溶液（处理24个样品时，向8 ml乙醇中加入2 ml蒸馏水）。小心移除上清液并弃去，注意不要扰动磁珠。
    6. 将微孔板保持在磁力架上，向每孔加入200 µl新鲜配制的80%乙醇，注意不要扰动磁珠，室温孵育至少30秒。弃去上清液，并重复此洗涤步骤一次。确保完全去除乙醇，室温下干燥10分钟或直至乙醇完全蒸发。
    7. 从磁力架上取下反应板，加入22.5 µl RSB缓冲液。将移液器设定为22.5 μl，轻柔吹打混匀10次。将96孔板放回磁力架，静置2分钟。确保上清液完全澄清。轻柔吸取20 µl上清液转移至新的96孔板中。
      注意：可选择使用片段分析仪测定经标签化处理的样本片段大小。也可采用高分辨率丙烯酰胺凝胶电泳代替上述步骤。片段长度应在150 bp至1,000 bp之间。
  4. 1st PCR扩增
    1. 在冰上解冻含有聚合酶（LP-PMM）、Index 1 引物和 Index 2 引物溶液的 PCR 预混液。将索引组合与实验管理器样本表中的信息匹配。对于多重测序，每个样本需使用来自 Index 1（i7，N7xx）的不同 i7 索引。
    2. 在每个孔中加入 20 µl LP-PMM、5 µl Index 1 和 5 µl Index 2。将移液器调至 50 μl，轻柔吹打混匀 10 次。用粘性微孔密封膜封板。在 20 °C、280 × g 条件下离心 1 分钟。
    3. 将培养板放入热循环仪（盖子加热至100 °C）中，运行程序1（表1).
      注意：此步骤可暂停，反应物可置于PCR仪中过夜，或在2至8 °C条件下保存2天。

3. 基因组DNA富集：第1天，下午

  1. 开始前准备
    1. 将寡核苷酸（CSO）、捕获目标缓冲液1（NCT1）和RSB溶液置于冰上融化。在使用前至少30分钟，将纯化磁珠恢复至室温。
  2. PCR纯化
    1. 将步骤2.4中的板在20 °C下以280 × g离心1分钟。
    2. 在室温下，向每个孔中加入45 µl混合好的纯化磁珠。将移液器设定为95 μl，轻柔地上下吹打整个液体10次。在室温下孵育10分钟。将96孔板置于磁力架上，室温放置2分钟。
    3. 确保上清液完全澄清。配制新鲜的80%乙醇溶液（对于24个样本，将2 ml蒸馏水加入8 ml乙醇中）。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
    4. 保持96孔板在磁力架上的同时，向每孔中加入200 µl新配制的80%乙醇，不扰动磁珠，室温孵育30秒。弃去上清液，并重复此洗涤步骤一次。确保完全去除乙醇。在室温下干燥15分钟。
    5. 将96孔板从磁力架上取下，向每孔中加入40 µl RSB缓冲液。将移液器设定为40 μl，轻柔地上下吹打整个液体10次。
    6. 将96孔板放回磁力架，孵育2分钟。上清液应完全澄清。小心转移38 µl上清液至新的96孔板中。
    7. 采用荧光定量法测定每个样本的得率。若测得的得率在30–50 ng/µl之间，则表明本方案的第一部分已通过验证。
  3. 1st 杂交
    1. 在此阶段，通过将每个样本500 ng混合，最多可将12个样本合并为一个池，置于新的96孔板中。确保每个池的最终体积不超过40 µl。
      注意：如有需要，可在室温下使用真空浓缩装置减少池的体积（注意：DNA浓度不能通过加热调节，即使在30 °C下加热也会导致DNA降解）。通过添加RSB溶液将最终体积调整至40 µl。
    2. 充分混匀NCT1溶液。对于每个含有40 µl混合DNA样本的孔，加入50 µl NCT1和10 µl CSO。将移液器设定为100 μl，轻柔地上下吹打整个液体10次。密封板后，在20 °C下以280 × g离心1分钟。
    3. 将板放入热循环仪中（盖子加热至100 °C），运行程序2（表1）。

4. 基因组DNA富集：第2天上午

  1. 开始之前
    1. 从DNA富集试剂盒（见材料/设备表）中取出2 N NaOH（HP3）、目标洗脱缓冲液1（ET1）、目标洗脱缓冲液1（ET2）、链霉亲和素磁珠（SMB）、洗涤液1（WS1）、洗涤液2（WS2）、洗涤液3（WS3）、CSO和NCT1溶液，于室温下解冻。
  2. 1st 杂交洗涤
    1. 从PCR仪中取出96孔板，在20 °C下以280 × g离心1分钟。小心移除粘性封膜。
    2. 将 100 µl 反应混合液从原板转移至新的 MIDI 96 孔板，加入 250 µl 充分涡旋混匀的 SMB 溶液。将移液器设定为 350 µl，轻柔地将每孔液体上下吹打 10 次。密封反应板，在室温下孵育 30 分钟。
    3. 在20 °C下以280 × g离心1分钟，移除粘性密封膜，将板置于磁力架上静置2分钟。确保上清液完全澄清。弃去上清液，从磁力架上取下板。
    4. 向含有珠子的孔中加入 200 µl 充分混匀的 WS1 溶液。将移液器调至 200 µl，轻柔地将全部液体上下移液 15 次，避免产生气泡或泡沫。
    5. 将平板置于磁力架上静置2分钟，确保上清液完全澄清。弃去上清液，将平板从磁力架上取下。
    6. 向含有珠子的孔中加入 200 µl 充分混匀的 WS2 溶液。将移液器调至 200 µl，轻柔地上下吹打全部液体 15 次，避免产生气泡或泡沫。
    7. 将培养板置于磁力架上静置 2 min。确保上清液完全澄清。弃去上清液，并将培养板从磁力架上取下。
    8. 向含有珠子的孔中加入 200 µl 充分混匀的 WS2 溶液。将移液器设定至 200 µl，轻柔地将全部液体上下吹打 15 次。
    9. 将全部体积转移至新的96孔板中。密封孔板并将其放入热循环仪（盖子加热至100 °C）。启动热循环仪，在42 °C下反应30分钟。
    10. 立即将培养板置于磁力架上静置2分钟。确保上清液完全澄清。移除封膜，并立即弃去所有上清液。随后，将培养板从磁力架上取下。
    11. 向含有珠子的孔中加入 200 µl WS2。将移液器设定为 200 µl，轻柔地上下吹打全部液体 15 次，避免产生气泡或泡沫。密封反应板，并将其放入热循环仪中（盖子加热至 100 °C）。启动热循环仪，在 42 °C 下孵育 30 分钟。
    12. 立即将培养板置于磁力架上静置2分钟。确保上清液完全澄清。移去封膜，并立即弃去所有上清液。随后，将培养板从磁力架上取下。
    13. 向含有珠子的孔中加入 200 µl 充分混匀的 WS3 溶液。将移液器调至 200 µl，轻柔地将全部液体上下吹打 15 次。
    14. 将平板置于磁力架上静置2分钟，确保上清液完全澄清。弃去全部上清液，然后将平板从磁力架上取下。
    15. 重复WS3洗涤步骤一次。
    16. 去除上清液后，密封反应板并短暂离心，以收集残留的上清液。将反应板置于磁力架上静置2分钟，弃去残留的上清液。
    17. 在0.2 ml离心管中，加入28.5 µl ET1溶液和1.5 µl HP3溶液。此混合液适用于1个池；若制备多个池，需将上述体积乘以池的数量。
    18. 从磁力架上取下反应板。加入23 µl上述配制好的混合液。将移液器设定为23 µl，轻柔地上下吹打全部液体15次。密封反应板，在室温下静置5分钟。在20 °C条件下，以280 × g离心1分钟。
    19. 将培养板置于磁力架上静置 2 分钟。确保上清液完全澄清。移去粘性封膜，将 21 µl 上清液转移至新的 96 孔板中。
    20. 向每个孔中加入 4 µl ET2 溶液。将移液器调至 25 µl，轻柔地将全部液体上下吹打 10 次，然后密封培养板。
      注意：此步骤可暂停，反应物可在 -15 °C 保存最多 7 天。若平板已冻结，使用前需完全解冻后再进行下一步。nd 杂交
  3. 2nd 杂交
    1. 在20 °C下以280 × g离心96孔板1分钟。移除粘性封膜，向25 µl文库中加入50 µl NCT1、10 µl CSO和15 µl PCR级水。将移液器调至100 µl，轻柔吹打混匀10次。
    2. 用封板膜封板，在20 °C、280 × g条件下离心1分钟。
    3. 将培养板放入热循环仪（盖子加热至100 °C）中，运行程序2（表1).

5. 基因组DNA富集：第2天，下午

  1. 开始之前
    1. 在室温下解冻用于杂交洗涤的ET1、ET2、SMB、WS1、WS2、WS3和HP3溶液。从DNA富集试剂盒中取出用于PCR扩增的PCR预混液（含聚合酶，TC-PMM）、PCR引物混合物（PPC）和RSB溶液，置于冰上解冻。
  2. 2nd 杂交洗涤
    1. 遵循与4.2完全相同的实验方案 – 1st 杂交洗涤
  3. PCR扩增
    1. 在新的96孔板中，加入20 µl第5.2步的洗脱液、25 µl TC-PMM和5 µl PPC。将移液器调至50 µl，轻柔吹打混合全部液体10次。密封反应板，在20 °C、280 × g条件下离心1分钟。
    2. 将培养板放入热循环仪（盖子加热至100 °C）中，运行程序3（表1).

6. 基因组DNA富集：第3天

  1. 开始前准备
    1. 将 RSB 溶液置于冰上解冻。在使用前至少 30 分钟，将纯化磁珠恢复至室温（RT）。
  2. PCR 纯化
    1. 在 20 °C 下以 280 × g 离心步骤 5.3 的板 1 分钟，并移除粘性封膜。
    2. 在室温下，向每孔中加入 90 µl 预先混匀的纯化磁珠。将移液器设定为 140 µl，轻柔地将全部液体上下吹打 10 次。在室温下孵育 15 分钟。将 96 孔板置于磁力架上，室温放置 5 分钟。确保上清液完全澄清。
    3. 配制新鲜的 80% 乙醇溶液（对于 2 个样本，将 200 µl 蒸馏水加入 800 µl 乙醇中）。小心弃除上清液，避免扰动沉淀。
    4. 保持板置于磁力架上，向每孔中加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇，不扰动磁珠，室温孵育 30 秒。弃除上清液，并重复此洗涤步骤一次。确保乙醇已完全去除。将板保留在磁力架上，在室温下干燥 15 分钟或直至乙醇完全蒸发。
    5. 将板从磁力架上取下，向每孔中加入 30 µl RSB 缓冲液。将移液器设定为 30 µl，轻柔地将全部液体上下吹打 10 次。在室温下孵育 2 分钟。
    6. 将 96 孔板放回磁力架，孵育 5 分钟或直至上清液完全澄清。小心转移 28 µl 上清液至新的 96 孔板中（板类型：TCY）。
      注意：本步骤后可暂停操作，反应物可在 -15 °C 保存最多 7 天。
  3. 文库验证与定量
    1. 使用片段分析仪评估文库质量。高分辨率丙烯酰胺凝胶电泳可用于替代上述步骤，但不推荐。片段大小应在 150 bp 至 1,000 bp 之间。
      注意：推荐使用 qPCR 对文库进行定量，以在测序过程中获得最佳簇数。
    2. 作为参考，使用已验证的文库（2 nM）。若为首次制备文库，可使用提供的噬菌体 PhiX DNA（10 nM）对测序仪进行校准。
    3. 对阳性对照进行系列稀释，以在 EBT（EB 洗脱缓冲液 + 0.1% Tween 20）中获得 20、16、8、6、4、2 和 1 pM 共 7 个浓度点。将待测文库稀释至 1/1,000 和 1/2,000。每个浓度点需设三个重复。
    4. 配制以下反应体系（按所用孔数倍增体积）：每孔加入 10 µl 含 SYBR Green 的 qPCR 预混液（2×）、0.2 µl 正向引物（10 µM，AATGATACGGCGACCACCGAGAT）、0.2 µl 反向引物（10 µM，CAAGCAGAAGACGGCATACGA）和 7.6 µl PCR 级水。
    5. 混匀后，向 96 孔板中每孔加入 18 µl 混合液，再加入 2 µl 阳性对照及文库稀释液。密封板后，在 20 °C 下以 280 × g 离心 1 分钟。随后将板放入定量 PCR 仪中，运行程序 4（表 1）。
    6. 按常规绝对定量方法分析结果，以获得各文库的产量。qPCR 的优势在于仅定量能与流动池结合的 DNA。
      注意：由于某试剂中存在 DNA 模拟分子，不得使用荧光法对 DNA 进行定量。该方法会高估文库产量，从而低估簇生成分数。
  4. 测序启动
    1. 将各文库用洗脱缓冲液（EB）稀释至 4 nM，终体积为 30 µl，并混合所有文库，充分混匀。
    2. 在 EB 缓冲液中新鲜配制 0.2 N NaOH 溶液，取 10 µl 该 NaOH 溶液与 10 µl 混合文库混合，充分混匀，在室温下精确孵育 5 分钟。
    3. 5 分钟后，立即加入 980 µl 杂交缓冲液（来自测序试剂盒），充分混匀。随后，取 400 µl 该混合液与 600 µl 杂交缓冲液混合，充分混匀后转移 600 µl 至 300 个循环试剂盒（2 × 150）中，用于 8 pM 的上样。启动测序。

7. 数据分析

  1. 设备完成数据处理后，将 .bam 和 .vcf 文件转移至一台新计算机。
    注意：转座酶片段化会引入印记序列，因此软件会自动对这些数据进行修剪。
  2. 收集通过设备分析获得的遗传变异。
  3. 根据制造商的说明，使用其他软件（Alamut）分析导出的文件（.bam、.vcf），然后比较两种分析方法获得的遗传变异结果。仅当某一变异在两次分析中均被检出时，才认定其存在。

表1. PCR条件

程序温度时间循环次数
172 °C3 分钟1
98 °C30 秒1
98 °C10 秒10
60 °C30 秒
72 °C30 秒
72 °C5 分钟1
10 °C无限
295 °C10 分钟1
93 °C1 分钟1
91 °C1 分钟1
89 °C1 分钟1
87 °C1 分钟1
85 °C1 分钟1
83 °C1 分钟1
81 °C1 分钟1
79 °C1 分钟1
77 °C1 分钟1
75 °C1 分钟1
71 °C1 分钟1
69 °C1 分钟1
67 °C1 分钟1
65 °C1 分钟1
63 °C1 分钟1
61 °C1 分钟1
59 °C1 分钟1
58 °C1 分钟16-18 小时
398 °C30 秒1
98 °C10 秒10
60 °C30 秒
72 °C30 秒
72 °C5 分钟1
10 °C无限
495 °C10 分钟1
95 °C15 秒40
60 °C1 分钟

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结果

样本质控结果

该方法对目标基因进行测序的能力取决于基因组DNA（图2A）的质量以及片段化（tagmentation）步骤的质量。如果片段化不充分（图2B，上图），测序结果将不理想。如上所述，在完成片段化后的纯化步骤中，基因组DNA应被切割为150 bp至1,000 bp的片段，且大多数片段长度约为300 bp（图2B，下图）。

文库构建完成后，需使用生物分析仪检测文库质量。所获得的图谱应与片段化后结果大致相同，但片段数量更多（图2C）。若文库质量与图1C所示结果不符，则不应进行测序。

测序在测序仪上启动后，经过9个循环即可获得簇密度分数，其值应介于800,000至1,100,000簇/mm²之间（图3A）。若该数值过低，测序结果将不理想，尤其会影响测序深度；若过高，则图像会变得...

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讨论

下一代测序（NGS）设备和技术的广泛应用为癌症和遗传性疾病的研究提供了新的机遇。除了全基因组测序或RNA测序外，同时对大量患者中选定的基因组DNA序列进行分析，也为临床诊断带来了广阔前景。本文中，我们开发了一种特定的设计（可按需提供），利用Nextera技术，使用中等通量测序设备（材料/设备表）同时对24名患者的11个完整基因进行分析。该方案能够快速生成数据，从而以较低的错误风险迅速回应患者的临床需求。如图6所示，通过Sanger测序检测到的所有遗传变异，均能使用基于转座酶的文库制备试剂盒检测到。该方法可靠且易于解读，尤其适用于直接分析复杂的插入缺失（indel）变异。然而需要注意的是，对于位于负链上的基因，必须对核苷酸进行互补（不反转）处理。本研究采用的是针对11个完整基因的分析设计，但无论选择何种设计，该实验方案均保持一致。基于转座酶的技术也可用于长片段PCR产物的文库制备12。事实上，用于设计的算法（由制造商开发，参见材料/设备表中的制造商网站工具）是专门为本方案设计的。除了基于转座酶的技术外，在文库制备前进行DNA片段化的另外两种机制也已被采用：机械片段化和酶切片段化。机械...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

感谢科多尔抗癌联盟和乔治-弗朗索瓦·勒克莱尔中心提供的资金支持。感谢Philip Bastable对稿件的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MiSeqIlluminaSY-410-1001测序/中通量设备
Nextera 富集试剂盒IlluminaFC-123-1208基于转座酶的技术
300 个循环的试剂盒Illumina15033624
AMPure 磁珠Beckman CoulterA63881磁性纯化磁珠
磁力架AlpaquaA32782
96 孔板Life Technologies4306737
MIDI 96 孔板BioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001该封膜仅在 PCR 扩增时需要；实验其他步骤可使用其他标准封膜
MiSeqIllumina随测序仪提供
Experiment Manager 软件
网址：http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
厂商网站工具

参考文献

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BRCA1 BRCA2 PCR
基于转座酶技术的gDNA富集用于NGS分析BRCA1、BRCA2及9个DNA损伤修复相关基因的全序列
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