基于转座酶技术的gDNA富集用于NGS分析BRCA1、BRCA2及9个DNA损伤修复相关基因的全序列

摘要

用于NGS测序的基因组DNA富集是研究遗传性突变的一种简便而强大的工具。本文介绍了对11个参与DNA损伤修复的基因进行完整序列分析的实验流程。

摘要

下一代测序技术的广泛应用为癌症研究和诊断开辟了新的途径。NGS 将带来海量关于癌症、尤其是癌症遗传学的新数据。当前的知识和未来的发现将要求我们必须研究大量可能与癌症遗传易感性相关的基因。为此，我们开发了一种 Nextera 设计，用于研究 11 个参与 DNA 损伤修复的完整基因。本方案旨在对 24 名患者同时安全地检测 11 个基因（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80 和 TP53）从启动子区到 3'-UTR 的完整序列。该方案基于转座酶技术和基因组 DNA 富集方法，通过样本多重分析显著缩短了遗传诊断所需时间。本方案可安全地用于血液来源的基因组 DNA。

引言

2010年，全球近150万人（几乎均为女性）被诊断出乳腺癌。据估计，其中5%至10%的病例为遗传性。近20年前，BRCA1 和 BRCA2 被确认与遗传性乳腺癌和卵巢癌相关¹。大约15年来，BRCA1 和 BRCA2 的编码区已被测序，用于确定乳腺癌和卵巢癌的遗传易感性。在10%至20%的特定家族中可检测到 BRCA1 和 BRCA2 的变异²，这表明仅分析这些区域尚不足以实现有效的筛查。近年来，对 BRCA1 和 BRCA2 非编码序列（启动子、内含子、3'-非翻译区）的分析表明，新的突变或变异可能与更高的乳腺癌风险相关^3-6。

BRCA1 和 BRCA2 蛋白参与同源重组修复（Homologous Recombination Repair, HHR），该过程由多个协作因子共同完成⁷。尽管 BRCA1 或 BRCA2 的变异会导致 DNA 修复功能缺陷，但其他协作因子也可能影响乳腺癌的发病风险。这一假说似乎已得到验证，因为 BRIP1⁸ 和 PALB2⁹ 分别被证实与宫颈癌和乳腺癌相关。此外，另外两个“中等风险”的乳腺癌易感基因 ATM 和 ....

方案

1. 基因组DNA（gDNA）得率的评估

1. 在文库制备前，对新提取的基因组DNA（gDNA）进行定量。采用荧光定量法测定完整gDNA的浓度（避免使用分光光度计进行gDNA定量）。测定（260/280 nm）吸光度比值，并确保其在1.8至2.0之间。注意：本实验需要50 ng的gDNA。

2. 基因组DNA富集：第1天上午

1. 开始前准备
   1. 从DNA富集试剂盒（见材料/设备表）中，将DNA缓冲液（TD）和DNA酶（TDE1）溶液在冰上解冻。使用前至少30分钟，将纯化磁珠和终止靶向缓冲液（ST）恢复至室温（RT）。每份样本取20 µl浓度为2–2.5 ng/µl的基因组DNA直接加入96孔板中，每样本一孔。重要提示：使用阳性对照以验证实验流程（含已知序列变异的样本）。
2. 标签化
   1. 将所有试剂颠倒混匀5次，然后短暂离心。室温下，向每孔含50 ng（20 µl）基因组DNA的样品中加入25 µl TD缓冲液，再加入5 µl TDE1缓冲液。将移液器调至50 μl，轻柔地上下吹吸全部液体10次。
   2. 用粘性封板膜覆盖反应板，在20 °C、280 × g条件下离心1分钟。随后将反应板放入热循环仪（盖子加热至100 °C）中，运行以下程序：55 °C孵育5分钟，10 °C保持无限长时间。
   3. 孵育期间，使用 E....

结果

样本质控结果

该方法对目标基因进行测序的能力取决于基因组DNA（图2A）的质量以及片段化（tagmentation）步骤的质量。如果片段化不充分（图2B，上图），测序结果将不理想。如上所述，在完成片段化后的纯化步骤中，基因组DNA应被切割为150 bp至1,000 bp的片段，且大多数片段长度约为300 bp（图2B，下图）。

文库构建完成后，需使用生物分析仪检测文库质量。所获得的图谱应与片段化后结果大致相同，但片段数量更多（图2C）。若文库质量与图1C所示结果不符，则不应进行测序。

测序在测序仪上启动后，经过9个循环即可获得簇密度分数，其值应介于800,000至1,100,000簇/mm²之间（图3A）。若该数值过低，测序结果将不理想，尤其会影响测序深度；若过高，则图像会变得.......

讨论

下一代测序（NGS）设备和技术的广泛应用为癌症和遗传性疾病的研究提供了新的机遇。除了全基因组测序或RNA测序外，同时对大量患者中选定的基因组DNA序列进行分析，也为临床诊断带来了广阔前景。本文中，我们开发了一种特定的设计（可按需提供），利用Nextera技术，使用中等通量测序设备（材料/设备表）同时对24名患者的11个完整基因进行分析。该方案能够快速生成数据，从而以较低的错误风险迅速回应患者的临床需求。如图6所示，通过Sanger测序检测到的所有遗传变异，均能使用基于转座酶的文库制备试剂盒检测到。该方法可靠且易于解读，尤其适用于直接分析复杂的插入缺失（indel）变异。然而需要注意的是，对于位于负链上的基因，必须对核苷酸进行互补（不反转）处理。本研究采用的是针对11个完整基因的分析设计，但无论选择何种设计，该实验方案均保持一致。基于转座酶的技术也可用于长片段PCR产物的文库制备¹²。事实上，用于设计的算法（由制造商开发，参见材料/设备表中的制造商网站工具）是专门为本方案设计的。除了基于转座酶的技术外，在文库制备前进行DNA片段化的另外两种机制也已被采用：机械片段化和酶切片段化。机械.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MiSeq	Illumina	SY-410-1001	测序/中通量设备
Nextera 富集试剂盒	Illumina	FC-123-1208	基于转座酶的技术
300 个循环的试剂盒	Illumina	15033624
AMPure 磁珠	Beckman Coulter	A63881	磁性纯化磁珠
磁力架	Alpaqua	A32782
96 孔板	Life Technologies	4306737
MIDI 96 孔板	Biorad	AB0859
Microseal A	Biorad	MSA-5001	该封膜仅在 PCR 扩增时需要；实验其他步骤可使用其他标准封膜
MiSeq	Illumina		随测序仪提供 Experiment Manager 软件 网址：http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new 厂商网站工具