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方法文章

甲基亚硝基脲诱导的斑马鱼视网膜变性与再生：组织学与功能特征

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DOI：

10.3791/51909

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2014年10月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Inselspital, University of Bern, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Basel, 3Department of Biology, University of Fribourg

本文内容

摘要

本文通过在成年斑马鱼中使用 N-甲基-N-亚硝基脲，展示视网膜退化与再生的定量分析及其对视觉功能的影响。视觉敏锐度下降和感光细胞数量减少后，内核层出现细胞增殖。在初次处理后30天，视网膜实现了完全的形态学和功能学再生。

摘要

视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性，因其导致的感光细胞损伤，是工业化国家视力丧失的主要原因。动物模型对于研究此类疾病具有关键意义。在此背景下，感光细胞特异性毒素N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）已在啮齿类动物中被广泛用于药理学诱导视网膜退行性变。此前，我们已在斑马鱼——视觉研究中的另一种常用模型系统——中建立了MNU诱导的视网膜退行性变模型。

与哺乳动物不同，成年斑马鱼视网膜具有持续的神经发生能力，并在损伤后能够再生，这一现象十分引人注目。为了量化这一现象，我们采用了成年斑马鱼的视觉敏锐度测量方法。通过检测非麻醉状态下鱼类的视动反射，追踪其功能变化。同时结合组织学分析以及凋亡（TUNEL）和增殖（PCNA）的免疫组织化学染色，以关联发育过程中的形态学变化。

综上所述，光感受器细胞在MNU处理后第3天发生凋亡，随之出现外核层（ONL）细胞数量显著减少。此后，可观察到内核层（INL）和ONL细胞的增殖。本文揭示了在30天的时间过程中，不仅发生了完全的组织学再生，还实现了功能上的恢复。本文通过视频形式展示了利用MNU定量分析并追踪斑马鱼视网膜损伤与再生的方法。

引言

视觉是人类最重要的感官，其功能受损具有重大的社会经济影响。在发达国家，视网膜变性疾病是老年人视力丧失和失明的首要原因1。大多数视网膜变性疾病的病因仅被部分阐明，且恢复丧失视力的治疗手段极为有限。视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa）是一种典型的以光感受器细胞原发性丢失为特征的视网膜变性疾病2-3。N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）可诱导视网膜变性，因此在啮齿类动物中被广泛用于模拟以光感受器细胞原发性死亡为特征的疾病4。MNU是一种烷化剂，可导致良性和恶性肿瘤，这些肿瘤通常在暴露后数月内出现5-7。此外，MNU在短期内即可引起特异性的光感受器细胞死亡。研究发现，视网膜层结构的丧失和明显的视网膜变薄呈浓度依赖性。视网膜胶质细胞被激活，但未观察到视网膜色素上皮（RPE）发生改变。内质网（ER）应激相关的凋亡似乎是MNU在视网膜中发挥作用的主要通路8。

我们最近引入了MNU作为一种化学模型，用于诱导斑马鱼中的感光细胞变性9。由于多种原因，斑马鱼（Danio rerio）在视觉研究中变得尤为重要，其视觉系统与其他脊椎动物的视觉系统具有相似性10。外层视网膜包含感光细胞，这些细胞可分为四种不同的视锥细胞类型，其峰值敏感波长分别位于紫外、短波、中波和长波可见光谱范围内，此外还有一种视杆感光细胞类型。在内核层（INL）中，可发现双极细胞、水平细胞和无长突细胞等中间神经元的细胞体，以及Müller胶质细胞的胞体。在外丛状层（OPL）中，感光细胞与内层视网膜之间形成突触连接；而最靠近晶状体的细胞层是神经节细胞层（GC），其细胞成分发出长轴突，构成视神经和视束。神经节细胞与内核层细胞之间的突触连接则形成于内丛状层（IPL）11。视网膜色素上皮（RPE）位于神经感觉性视网膜外侧，通过长长的顶端微绒毛包绕感光细胞的外节段12。此外，斑马鱼具有很强的再生能力，能够再生受损的脑组织、视网膜、脊髓、心脏及其他组织13。当视网膜受损时，内核层中的细胞（被认为是Müller细胞）被激活，并具有分化为多种视网膜细胞类型的潜能。此外，这些细胞还能产生位于外核层（ONL）的视杆前体细胞。成年斑马鱼视网膜另一个新细胞来源是睫状边缘区。该来源对于在持续生长的斑马鱼眼球中维持视杆感光细胞的恒定密度至关重要14。

MNU 模型可作为一种简单且可重复的视网膜组织变性/再生研究方法。由于斑马鱼与人类在某些生物学过程上具有相似性，该模型有望为识别参与的细胞死亡通路以及筛选潜在的神经保护药物提供途径。基于我们课题组此前的一项研究，本文现详细阐述MNU诱导的斑马鱼视网膜变性及随后再生模型的实验方法，包括相应的功能变化及配套的实验视频9。

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方案

所有实验均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》。

1. 动物

  1. 在水温为 26.5 °C、光照周期为 14/10 小时（光/暗）的标准条件下，饲养年龄为 6–12 个月的野生型斑马鱼（Danio rerio）AB（俄勒冈）品系15。
  2. 动物实验须经州兽医办公室批准后，遵循相关机构规定的动物护理指南进行。

2. MNU 处理

  1. 制备含有 150 mg/L 干物质的 N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）水溶液。注意！MNU 有毒，可能致癌、引起遗传性基因损伤或对胎儿造成危害。
  2. 将斑马鱼置于含 MNU 的水溶液中，在室温下孵育 60 分钟。
  3. 用新鲜水快速冲洗斑马鱼，并将其转移至不含 MNU 的新鱼缸中。根据实验需要，在标准条件下长期维持鱼类培养。

3. 视力测量

  1. 启动视动系统，从菜单中选择“testing”，并将选项设置为“Simple Staircase”、“Acuity (Freq)”和“Randomized/Separate”16。
  2. 将一个装有500 ml水的输液瓶安装在视动系统上方约1米处。
  3. 将一条斑马鱼放入检测室，并将其连接至输液瓶。然后将检测室放入视动系统中。
  4. 开始测量，并在计算机屏幕上实时观察眼球运动。其中，阳性反应（“是”）定义为连续的、方向正确的扫视运动，而阴性反应（“否”）则表现为类似于静止光栅刺激下观察到的随机眼动。如果斑马鱼的眼睛表现出三次或更多次连续的视动反应（OKR），则按“是”；否则按“否”。
  5. 在菜单中的“Results”项下提取视觉敏锐度，该数值由软件通过确定视动刺激的空间频率阈值计算得出。

4. 组织学

  1. 通过过量的三卡因甲磺酸盐（200–300 mg/L）处死斑马鱼，并摘除眼球。
  2. 在4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）中4 °C条件下固定完整眼球12小时，随后将样品经梯度酒精脱水。
  3. 将样品包埋于石蜡中，在视神经乳头（ONH）部位切取5 µm厚的切片，并将切片贴附于载玻片上。
  4. 用苏木精对脱蜡后的石蜡切片染色4分钟，将载玻片在蒸馏水中浸洗两次，随后依次浸入0.2%盐酸和0.8%氨水。苏木精染色后，在自来水冲洗至少10分钟显色，再用伊红染色3分钟（H&E）。
  5. 将脱水后的切片用封片介质封固，并在光学显微镜下观察。

5. 免疫组织化学

  1. 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）
    1. 将脱蜡切片在室温下用 20 µg/ml 蛋白酶K孵育 15 分钟。用Tris缓冲盐水（TBS）洗涤切片三次，每次 5 分钟。
    2. 在湿盒中，将切片与 50 µl TUNEL反应混合液（10%标记液和90%酶液）于 37 °C 孵育 60 分钟。用TBS洗涤三次，每次 5 分钟。
    3. 用含DAPI的封片剂封片，并在荧光显微镜下观察切片。
  2. 增殖细胞核抗原（PCNA）染色
    1. 将脱蜡切片在抗原修复缓冲液（Tris-EDTA + 0.05% Tween 20，pH 9.0）中煮沸 3 分钟，用TBS洗涤三次，每次 5 分钟。在室温下用 100 µl 封闭液（TBS + 10% 正常山羊血清 + 1% 牛血清白蛋白，pH 7.6）封闭 1 小时。
    2. 在湿盒中，以1:200稀释的抗PCNA一抗于 4 °C 过夜孵育。用TBS + Tween 20洗涤三次，每次 5 分钟。
    3. 在室温下用1:500稀释的相应二抗孵育 1 小时完成检测。
    4. 用含DAPI的封片剂封片，并在荧光显微镜下观察切片。

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结果

视力：

本研究的实验设置[空间频率：0.042 圆周/度（c/d）；对比度：100%；漂移速度：20 度/秒（d/s）；背光亮度：152 cd/m2]可用于评估成年斑马鱼的视动反应（OKR）。每条斑马鱼的视力测量平均持续约5–10分钟，斑马鱼对该操作耐受良好。MNU暴露前的视觉敏锐度为0.577 ± 0.014 周/度（c/d）。图1显示了应用150 mg/L MNU后视觉敏锐度的变化过程。从第1天开始，测量结果显示视觉敏锐度显著下降，并在第3天达到最低值。从第8天起，视觉敏锐度开始上升，在MNU暴露后30天恢复至基线水平。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Bonferroni多重比较检验。结果显示，在第1、3、5和8天，治疗后的视觉敏锐度与基线相比差异具有统计学意义（p <0.001，每个时间点），而在第15天和第30天则无显著差异。

视网膜变性的组织学评估：

在每个时间点（n...

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讨论

此前，我们的研究团队已将MNU诱导的光感受器变性模型从啮齿类动物成功转移到斑马鱼体系中9。相关后续事件被描述并追踪长达30天。在此期间，初始处理后发生了完全的视网膜形态学变性与再生过程。首先，组织学结果显示，自第3天起视杆细胞数量减少，并在第8天达到最低值。相应地，TUNEL染色显示在MNU处理后第3天出现视杆光感受器的凋亡。再生过程始于第3天的内核层（INL），并在第5天达到高峰。在外核层（ONL）中，可观察到增殖细胞持续至观察期结束，增殖高峰同样出现在第5天。这与内核层不同，在内核层中第15天后未再观察到增殖增加的现象。睫状边缘区是视网膜中唯一在未处理视网膜中亦可发现少量PCNA阳性细胞的区域，表明该区域在整个生命周期中持续存在视网膜神经发生14。本论文并未重点研究参与斑马鱼药理损伤光感受器再生的具体细胞类型。然而，在先前的研究中，该再生过程已被追溯至内核层中具有再生能力的细胞，这些细胞被认为是穆勒细胞（Müller cells）9,17,18。

在本研究中，我们还评估了MNU诱导的斑马鱼模型中的功能变化。为了量...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Monika Kilchenmann、Federica Bisignani和Agathe Duda提供的出色技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士A6283
氨水Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士2949930.80%
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士05470
Dako 笔Dako, Glostrup, 丹麦S2002
DAPI 封片剂Vector Labs, Burlingame, CA, 美国H-1200
伊红Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士45260
乙醇Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士2860100%, 96%, 70%
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士ED
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士E10521Tricaine
EukittSigma-Aldrich, Buchs, 瑞士3989
山羊抗兔 Alexa 594Life Technologies, Zug, 瑞士 A11012
正常山羊血清Dako, Glostrup, 丹麦X0907
盐酸Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士3203310.20%
原位细胞死亡检测试剂盒Roche Applied Sciences, Rotkreuz, 瑞士11684795910TUNEL 试剂盒
迈耶苏木精溶液Merck, Darmstadt, 德国109249
甲基亚硝基脲（MNU）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士N4766有毒
OptoMotryCerebralMechanics, Lethbridge, AB, 加拿大n.a.
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P6148
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P5368
蛋白酶KDako, Glostrup, 丹麦S3004
兔抗PCNA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 美国sc-33756
Superfrost Plus 玻片Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, 德国10149870
Tris缓冲盐水（TBS）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P5912
Trizma 碱Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士T1503
吐温20Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P1379
二甲苯Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士534056
斑马鱼（Danio rerio）AB（俄勒冈）品系弗里堡大学，生物学系n.a.本单位鱼类养殖设施

参考文献

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10(2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).

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