从发展胚胎小鼠心脏瓣膜区蛋白分离

摘要

由于可用组织有限，年轻胚胎小鼠瓣膜中蛋白质表达的分析受到阻碍。本手稿提供了从发育中的胚胎小鼠瓣膜区域制备蛋白质以进行蛋白质印迹分析的方案。

摘要

Western 印迹分析是一种常用的检测和定量蛋白质水平的技术。然而，对于小组织样品，这种分析方法可能不够灵敏，无法检测目标蛋白质。为了克服这些困难，我们检查了从成人心脏瓣膜获取蛋白质的方案，并针对发育中的早期胚胎小鼠修改了这些方案。简而言之，小鼠胚胎主动脉瓣区域，包括主动脉瓣和周围的主动脉壁，被收集在含有蛋白酶抑制剂的基于 Tris 的裂解缓冲液的最小体积中。如果根据育种策略需要，在汇集四个胚胎主动脉瓣区域进行匀浆之前对胚胎进行基因分型。均质化后，使用基于 SDS 的样品缓冲液使样品变性，以便在 SDS-PAGE 凝胶上运行和随后的蛋白质印迹分析。尽管蛋白质浓度仍然太低而无法使用分光光度蛋白质定量测定法进行定量，并且有剩余样品用于后续分析，但该技术可用于通过蛋白质印迹从四个胚胎第 13.5 天小鼠主动脉瓣区域的混合样品中成功检测和半定量磷酸化蛋白质，每个区域产生约 1 μg 蛋白质。该技术将有助于研究早期胚胎小鼠瓣膜发育过程中的细胞信号通路激活和蛋白质表达水平。

引言

能够识别并量化蛋白表达水平是一个标准技术，动物 - 和基于细胞的实验。然而，尽管一个长期的兴趣在早期胚胎心脏瓣膜的开发，在开发过程中评估蛋白表达在这个特定的组织目前仅限于免疫组化在两个小鸡和鼠标^1,2。在大多数模型生物体（ 如小鸡和小鼠）的显影阀定量蛋白表达的难度的部分是阀，从而限制了蛋白质，可以得到的数量的小尺寸。因此，为了定量分析，研究人员通常依靠RNA提取和扩增用于随后定量PCR或微阵列分析^2-5。然而，RNA和蛋白的表达水平是不完全相关^6，所以着眼于RNA的表达不能提供一个严格的帐户中发生的任何给定的信号的许多改变在发展途径，在不同的时间。基于此限制，在目前可用的方法，该方法的目标是开发一种协议，用于可靠地获得足够量的蛋白质从显影小鼠胚胎心脏瓣膜的区域为所发生的各种信号通路是在重要的变化的定量分析这个组织的成熟。

胚胎瓣膜已普遍从老鼠RNA分离和后续基因表达分析^2-5解剖。然而，这些研究已不限于使用基因表达作为一个读出信号通路的激活，它不允许检测翻译后蛋白修饰，其可能会影响下游信号的检测。利用RNA分离技术为出发点，我们开始与解剖感兴趣的区域。因为我们关心的是检测磷酸化蛋白质，都说明信号拍拍在主动脉瓣发展（E13.5-14.5）的一个特定时期hway活性，我们进行的所有解剖在无磷酸盐的Tris缓冲液和收集的阀门与磷酸酶和蛋白酶抑制剂的Tris-基的裂解缓冲液。在我....

方案

注：所有实验均批准的机构动物照顾及使用委员会在北卡罗莱纳大学教堂山分校。

1，消费税主动脉瓣

1. 使用经批准的安乐死技术感兴趣的萌芽阶段，安乐死怀孕小鼠幼崽的发展所需要的胚胎一天（五）。
2. 用70％乙醇消毒的怀孕雌性的腹部。抬起小腹向上并远离内脏器官的皮肤和肌肉，并解剖开女性的下腹腔内，以允许访问的子宫角。
3. 要检索的子宫角，保持宫颈钳，小心切尾的镊子。提起子宫角，切割任何结缔组织，保持号角到位，并通过切割角子宫交界处的输卵管完成删除。
4. 将解剖子宫角中含有培养皿山坳ð的0.1M Tris缓冲液（pH7.6）中，并根据需要冲洗。然后，切开子宫角开口长度明智揭露胚胎囊。
5. 揭露胚胎，剖开胚胎囊，在胎盘和胎儿的交界处剪断脐带的船只来释放胚胎。放置在第二个培养皿用冷的0.1M Tris缓冲液中的解剖胚胎。返回第一个培养皿与其余undissected胚胎至冰上直至准备进行下一次的胚胎。
6. 为了提高胚胎内胸壁访问，杀头的胚胎。如果基因分型是必要的，删除和保存额外的组织片在Eppendorf管置于冰上。
7. 将胚胎在它的后面，切断胸壁垂直沿左肋侧，靠近前肢和水平横膈膜以上的可视化的心脏。然后，打开胸壁暴露心脏。
8. 使用镊子举行沿大血管高，使用产钳提起心脏，减少血管下方。该N，上面剪钳释放的心脏。如果肺血管保持完整无缺，肺部可能与心脏取出，然后再继续应予删除。

结果

采用这种制备技术，我们能够从E13.5胚胎检测磷酸化的Smad ^{1,5,8（pSmad）}在单一主动脉瓣区域。 如图1A所示 ，从甚至一个单一的阀区域分离的蛋白是足以检测微弱pSmad带。信号强度成比例地增大到汇集阀的区域的数量。重要的是，pSmad /β-肌动蛋白的比值保持在不同的样本大小（ 图1C）几乎恒定。由于可用的蛋白质的水平低，同样的印迹无法剥离，并再次探测总Smad蛋白。然而，一个单独的印迹表示总Smad蛋白1和β-肌动蛋白显示了相同的表达模式（ 图1B）。

这些阀​​门的地区几乎完全没有污染的心室肌。组合使用该制备方法与右心室的样品，我们无法检测ventricular心肌标记物的ANP在主动脉瓣的区域，而该标志物是在心室容易地检测到（ 图2）。此外，心室心肌标记物的肌球蛋白轻链2V也容易心室样品中检测到，但是在主动脉瓣区域中几乎检测不到。这些结果支持了夹层的严谨。

讨论

量化蛋白质水平在早期胚胎小鼠和鸡胚心脏瓣膜区域的能力提供了理解的关键细胞信号传递活动阀发展的额外工具。我们这里所描述的协议不从标准蛋白分离方法有很大的不同。然而，通过修改某些关键步骤，我们已经成功地从非常小的样品尺寸相加得到的磷酸化蛋白。为实现这一结果，下面的步骤是特别重要的。以确保得到的优质蛋白，关键的是要保持样品冷却，不论在冰上或用冰冷却的缓冲液，在蛋白酶的存在下，如有必要，磷酸酶抑制剂。此外，同质化与设计处理小样本量的设备是充分破坏细胞膜必不可少的。即使有这些预防措施，将得到的蛋白质的产率可能会太低，通过用分光光度计Bradford分析来检测或蛋白定量试剂盒，仍然有样本可用于后续分析。我们能够确定每个主动脉瓣区域汇集7主动脉瓣区域和使用用于定量整个样品含有约1微克蛋白质。尽管此限制，足以蛋白获得，以检测磷酸化和未磷酸化的蛋白质，虽然缺乏事先定量使得装载控制是必不可少的。我们特别利用β-肌动蛋白，因为它是一种高丰度蛋白，它使我们能够连剥膜过无数次后检测到它;它的分子量不同，从我们感兴趣的蛋白质;并且它广泛表达。试用免疫印迹与不同数量的混合样品的建议，以确定必须有多少组织汇集了两种胚胎心脏瓣膜地区在发展的其他阶段或其他感兴趣的小组织。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定时怀孕小鼠			在感兴趣的胚胎阶段进行解剖
立体显微镜	尼康	SMZ645
0.1 M Tris，pH 7.6
微型剪刀	精细科学工具	15003-08
精细镊子，#5	精细科学工具	11251-30
解剖针持有人	Ted Pella， Inc.	13560
解剖针	Ted Pella Inc.	13561-10
微量移液器，20 &μ;l，带吸头
裂解缓冲液			50 mM Tris-HCl，pH 7.5,150 mM NaCl，5 mM EDTA，1% Triton
PhosSTOP	罗氏	4906845001	将 1 片剂添加到 10 ml 裂解缓冲液
中 TissueLyser LT	Qiagen	85600
不锈钢珠	Qiagen	69989
微量离心机