从小鼠胚胎心脏瓣膜发育区域分离蛋白质

摘要

由于可获取的组织量有限，对早期胚胎小鼠瓣膜中蛋白质表达的分析一直受到阻碍。本论文提供了一种从发育中的胚胎小鼠瓣膜区域提取蛋白质以进行蛋白质印迹分析的实验方案。

摘要

Western blot 分析是一种常用于检测和定量蛋白质水平的技术。然而，对于小组织样本，该方法的灵敏度可能不足以检测到目标蛋白质。为克服这些困难，我们研究了从成人人类心脏瓣膜中提取蛋白质的方案，并将这些方案改进后应用于早期胚胎小鼠的相应组织。简言之，收集小鼠胚胎主动脉瓣区域（包括主动脉瓣及其周围的主动脉壁），将其置于尽可能小体积的含蛋白酶抑制剂的 Tris 基裂解缓冲液中。根据配种策略，若有必要，需在将四个胚胎主动脉瓣区域组织合并之前先进行基因分型。匀浆后，使用基于 SDS 的上样缓冲液对样品进行变性，以便在 SDS-PAGE 凝胶上电泳并进行后续的 Western blot 分析。尽管蛋白质浓度仍过低，无法通过分光光度法蛋白质定量检测进行准确测定，且无剩余样品用于后续分析，但该技术仍可成功地从四个胚胎第 13.5 天的小鼠主动脉瓣区域合并样本中检测并进行磷酸化蛋白的半定量分析，每个样本可获得约 1 μg 蛋白质。该技术将有助于研究早期胚胎小鼠心脏瓣膜发育过程中细胞信号通路的激活及蛋白质表达水平的变化。

引言

能够识别和量化蛋白质表达水平是动物和细胞实验中的常规技术。然而，尽管长期以来对早期胚胎心脏瓣膜发育过程具有研究兴趣，目前在鸡和小鼠中针对发育过程中该特定组织的蛋白质表达评估仍局限于免疫组织化学方法。^1,2量化大多数模式生物发育瓣膜中蛋白质表达的部分困难在于例如，鸡和小鼠）瓣膜尺寸较小，限制了可获取的蛋白质量。因此，对于定量分析，研究人员通常依赖RNA提取和扩增，随后进行定量PCR或微阵列分析^2-5然而，RNA和蛋白质表达水平并不完全相关⁶因此，仅关注RNA表达无法全面反映在发育过程中不同时期特定信号通路中发生的多种变化。鉴于现有方法学的这一局限性，本实验旨在建立一种可靠的技术流程，以从发育中的小鼠胚胎心脏瓣膜区域获取足量蛋白质，用于定量分析在该组织成熟过程中多个重要信号通路中的动态变化。

胚胎瓣膜已常规从小鼠中分离，用于RNA提取及后续的基因表达分析^2-5。然而，这些研究仅限于将基因表达作为信号通路激活的读出指标，无法检测可能影响下游信号传导的翻译后蛋白修饰。以RNA提取技术为起点，我们开始解剖感兴趣的区域。由于我们的研究目标是检测在主动脉瓣发育特定时期（E13.5–14.5）反映信号通路活性的磷酸化蛋白，因此所有解剖操作均在无磷酸盐的Tris缓冲液中进行，并将瓣膜收集至含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的Tris基裂解缓冲液中。在本研究中，仅收集主动脉瓣区域，但肺动脉瓣区域也可在相同操作中轻松获取。随后将瓣膜组织匀浆，并加入目前用于研究成年心脏瓣膜蛋白表达的上样缓冲液⁷。通过使用小体积样品（例如，2 μl），并汇集相同基因型胚胎的瓣膜组织，我们能够在胚胎发育第13.5天检测到磷酸化和非磷酸化蛋白⁸。由于瓣膜组织可在裂解缓冲液中冷冻保存，因此可在汇集前根据需要对胚胎进行基因分型。

该技术拓宽了在发育过程中评估细胞信号通路的可用工具集，为免疫组织化学提供了一种定量补充方法，特别适用于发育中的心脏瓣膜研究。该技术不仅对发育心脏病学研究人员有益，也适用于所有研究早期胚胎、并对组织含量有限区域感兴趣的发育生物学研究者。

方案

注意：所有实验均经北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物照护与使用委员会批准。

1. 切除主动脉瓣

1. 采用针对目标胚胎阶段的批准安乐死方法，对处于所需发育胚胎日（E）的妊娠小鼠实施安乐死。
2. 使用70%乙醇对妊娠雌鼠腹部进行消毒。提起下腹部的皮肤和肌肉，使其远离内脏器官，解剖打开雌鼠下腹腔，以暴露子宫角。
3. 为取出子宫角，用镊子夹住宫颈，并在镊子远端小心剪断。提起子宫角，剪断固定子宫角的结缔组织，最后剪断子宫角与输卵管的连接处，完成子宫角的摘除。
4. 将解剖得到的子宫角置于含有冷0.1 M Tris缓冲液（pH 7.6）的培养皿中，按需冲洗。随后沿纵轴切开子宫角，暴露胚胎囊。
5. 为暴露胚胎，从胎盘与胚胎连接处切开胚胎囊，并剪断脐血管以释放胚胎。将解剖出的胚胎放入第二个含有冷0.1 M Tris缓冲液的培养皿中。将含有其余未解剖胚胎的第一个培养皿放回冰上，待准备处理下一个胚胎时再取出。
6. 为改善胚胎胸壁的暴露，可将胚胎去头。若需进行基因分型，应另取一块组织样本，保存于置于冰上的EP管中。
7. 将胚胎仰卧放置，沿肋骨一侧靠近前肢处垂直切开胸壁，并在膈肌上方水平剪开，以暴露心脏。随后打开胸壁，充分暴露心脏。
8. 用镊子夹住大血管近心端较高位置，提起心脏并剪断其下方血管，再在镊子上方剪断，以完全游离心脏。若肺动脉血管未被完全剪断，肺组织可能随心脏一同被取出，应在继续操作前将其去除。
9. 在瓣膜水平以上剪除并移除肺动脉；在本方案所述的胚胎阶段，肺动脉略呈半透明，有助于与瓣膜区域区分。在肺动脉瓣下方稍作剪切，避免损伤小梁化的心室心肌；若该区域也为研究目标，可按照步骤1.10所述方法收集。在此步骤及下一步中，使用毛细作用在加入裂解缓冲液前，将目标区域多余的Tris缓冲液吸除。
10. 在主动脉瓣水平以上，小心移除主动脉瓣远端的主动脉；与肺动脉类似，在这些胚胎阶段主动脉仍略呈半透明，便于识别和去除。在主动脉瓣下方稍作剪切，再次避免损伤小梁化的心室心肌，并用镊子将瓣膜转移至含有2 μl裂解缓冲液（见材料表）的EP管中，该缓冲液需预先添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并置于冰上。
11. 重复步骤1.6–1.10，直至所有胚胎的心脏瓣膜均被切除，每个瓣膜分别收集于独立的EP管中。若所有胚胎基因型相同，可将所有瓣膜收集于同一EP管中。
12. 若需通过基因分型确定哪些瓣膜可合并处理，请立即将样本置于-80 °C保存，直至后续使用。样本可在完成基因分型（步骤2.1.1）后进行合并。

2. 蛋白质提取

1. 将收集的组织在冰上解冻，于13,100 x g离心1分钟 将组织收集于试管底部的裂解缓冲液中。
   1. 若对胚胎进行了基因分型，使用移液器轻柔地收集并汇集含有瓣膜区域的裂解缓冲液，按相似基因型分组。为确保条带清晰，建议每样本 pooling E13.5 胚胎的 3–4 个瓣膜区域。
   2. 如果所有胚胎均为相同基因型，且在步骤1.10中将所有瓣膜区域合并收集，则按照步骤2.2所述裂解整个样本。
2. 检查合并后样品的体积，并加入裂解缓冲液至总体积为40 μl；然后，在Eppendorf管中使用5 mm不锈钢珠对样品进行破碎和匀浆。按照制造商说明书，以50 Hz频率运行裂解仪2–4分钟。短暂离心管体（约13,100 × g，1分钟），将样品转移至新管中，留下不溶性残渣。
3. 按照 Eslami 等人的方案，制备并分离样品用于 SDS-PAGE，随后进行转膜以用于 Western 印迹分析 等⁹检测上样对照蛋白对于蛋白质定量至关重要。

结果

通过使用这种制备技术，我们能够在 E13.5 胚胎的单个主动脉瓣区域中检测到磷酸化的 Smad^1,5,8（pSmad）。如图 1A所示，即使仅从单个瓣膜区域提取的蛋白质也足以检测到微弱的 pSmad 条带。信号强度随着合并的瓣膜区域数量增加而成比例增强。重要的是，pSmad/β-actin 比值在不同样本量之间几乎保持恒定（图 1C）。由于可获得的蛋白量较低，同一印迹膜无法经剥离后重新杂交检测总 Smad。然而，另一张分别显示总 Smad1 和 β-actin 的印迹膜呈现出相同的表达模式（图 1B）。

这些瓣膜区域几乎完全不含污染性的心室心肌组织。将该制备技术与右心室样本联合使用时，我们在主动脉瓣区域无法检测到心室心肌标志物ANP，而在心室组织中则可明显检测到该标志物（图2）。此外，心室心肌标志物肌球蛋白轻链2V在心室样本中可被明显检测到，但在主动脉瓣区域几乎无法检测到。这些结果证实了分离操作的精确性。

讨论

定量分析小鼠和鸡早期胚胎心脏瓣膜区域中蛋白水平的能力，为理解瓣膜发育过程中的关键细胞信号事件提供了额外工具。本文所述方案与标准的蛋白提取流程并无显著差异。然而，通过对某些关键步骤进行优化，我们已成功从极微量样本中获得了磷酸化蛋白。为实现这一目标，以下步骤尤为重要。为确保获得高质量的蛋白，必须始终保持样本处于低温环境，即置于冰上或使用预冷缓冲液，并在蛋白酶抑制剂（必要时还包括磷酸酶抑制剂）存在下操作。此外，使用专为处理微量样本体积而设计的匀浆设备，对于充分破坏细胞膜至关重要。即便采取了上述措施，所获得的蛋白产量仍可能过低，以致无法通过分光光度计进行Bradford法检测或使用蛋白定量试剂盒检测，同时保留足够样本用于后续分析。我们通过合并7个主动脉瓣区域样本并将全部材料用于定量，确定每个主动脉瓣区域约含有1 μg蛋白。尽管存在这一限制，所提取的蛋白量仍足以检测磷酸化及非磷酸化蛋白，但因缺乏预先定量，上样对照变得必不可少。我们特别选用β-actin作为内参，因其表达丰度高，即使在多次洗脱膜后仍可被检测；其分子量与目标蛋白不同；且为普遍表达蛋白。建议通过预实验进行不同数量合并样本的Western blot检测，以确定在其他发育阶段的胚胎心脏瓣膜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定时妊娠小鼠			用于解剖目标胚胎阶段的组织
体视显微镜	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
显微剪刀	Fine Science Tools	15003-08
精细镊子，#5	Fine Science Tools	11251-30
解剖针持针器	Ted Pella Inc.	13560
解剖针	Ted Pella Inc.	13561-10
微量移液器，20 μl，带吸头
裂解缓冲液			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	每10 ml裂解缓冲液中加入1片
TissueLyser LT	Qiagen	85600
不锈钢研磨珠	Qiagen	69989
微量离心机