研究发育机制和基因调控网络需要能够产生形态异常胚胎的方法。Patiria miniata（海星）是开展此类研究的新兴模式生物。本文介绍了从该物种获取配子、培养胚胎以及快速显微注射受精卵的实验方案。
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摘要
摘要
棘皮动物长期以来一直是研究生殖与发育的首选模式系统，近年来也被广泛用于基因调控以及发育过程进化方面的研究。Patiria miniata（海星）正逐渐成为此类研究的重要模式系统，而此前这类研究几乎 exclusively 在海胆 Strongylocentrotus purpuratus 和 Lytechinus variegatus 中进行。这些模式系统的一大优势在于能够简便地制备经过修饰的胚胎，实现特定基因的上调或下调、标记特定细胞群，或引入报告基因。单一的显微注射方法即可实现多种类型的胚胎修饰。本文中，我们介绍一种从 P. miniata 获取配子、制备受精卵，并通过显微注射引入干扰试剂的方法。随后分离出健康的形态异常胚胎，用于基因功能的定性与定量研究。该生物体的基因组和转录组数据的日益完善，进一步拓展了相关研究的类型，并提高了实验操作的便利性。
引言
海星 Patiria miniata（通常称为蝙蝠海星）正逐渐成为细胞学1-3、发育生物学4,5、进化生物学6-8以及生态学研究9-11中一个有趣且用途广泛的模式系统。成体 P. miniata 分布于从美国阿拉斯加锡特卡到加利福尼亚州下加利福尼亚的太平洋沿岸12，易于在海水水族箱中饲养。其卵母细胞可全年获取，每只雌性个体可排放数万个卵。卵母细胞易于体外成熟并进行体外受精13。所获得的胚胎透明，便于观察；胚胎发育同步，且仅需海水即可完成发育。此外，P. miniata 的全基因组组装序列及多个转录组数据均可在 Echinobase.org（Echinobase.org）获取。这些优势使其成为多种科研与教学应用的理想材料。
近年来， P. miniata 已成为发育基因调控网络分析的模式系统14-16此类研究的目的是鉴定出全部的调控基因，并确定这些基因相互作用的网络。这些工作很大程度上需要通过引入反义寡核苷酸来干扰基因表达 体外 合成的mRNA。此外....
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方案
尽可能将所有海水或人工海水（SW）、成年动物和培养物保持在15 °C。确保卵子和受精卵始终浸没在海水中。
使用蒸馏水或反渗透水配制的市售海盐可作为海水（SW）的良好来源。使用比重计检测盐度，并通过调整盐或水的含量以达到最佳水平。保持比重在1.020至1.025之间。将所有玻璃器皿和塑料器皿与其他实验器材分开存放，以避免化学物质污染。通过去离子水冲洗或偶尔用稀释的次氯酸钠浸泡后，再多次用水冲洗，来清洁胚胎级实验器皿。
1. 从成体紫海星（Patiria miniata）获取并成熟配子
- 选择一只动物以摘除其性腺。由于P. miniata无性别二态性，需在摘除后通过观察是否存在卵巢或精巢来确定性别。
- 用手术刀片在海星腕的一侧切开一个不超过1 cm的小开口（图1A）。使用小型钝头镊子将切口边缘拉开，以暴露性腺组织，并通过切口将性腺组织拉出。
注意：避免拉出肠组织，肠组织呈松散的灰褐色或棕色（图1B）。卵巢通常呈橙色、黄色或浅棕色（图1C），而精巢呈白色或米色，若破裂会使海水呈现乳白色或浑浊状（图1D）。 - 将雌性个体放回水族箱中。将雄性个体单独置于海水容器中1至2小时，因为操作带来的应....
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结果
本实验方案的目的是将试剂导入胚胎中。我们通过注射一种驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达的DNA报告载体来验证该方案的有效性。注射后的胚胎在DNA于早期卵裂阶段整合后，会在克隆区域表达GFP（图4A-B）。许多希望导入胚胎的试剂在高浓度下具有毒性，对胚胎批次不理想时尤其明显。毒性表现包括延缓发育、在早期卵裂阶段或受精卵阶段停止发育，或导致发育异常（图5A-C）。
图1. 从P. miniata成体中获取配子。A) 切除性腺时，需在腕部侧面靠近动.......
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讨论
对于初次使用该技术的研究人员而言，有两个关键步骤较为困难，但对成功获得形态缺陷胚胎至关重要。第一个步骤是选择健康的卵母细胞，以确保其能够正常成熟并受精。培养物中正常发育的比例取决于季节、动物的健康状况以及从同一个体采集卵母细胞的次数。通常，每年4月至10月期间获得的卵母细胞质量较好。在进行后续操作前，必须仔细观察卵母细胞，确保大多数卵母细胞的形态类似于图2A，而非图2B。允许存在少量无法成熟的卵母细胞，特别是当它们足够小、可在处理过程中通过过滤去除时。偶尔会遇到未发育成熟的卵母细胞，其大小几乎与已完全发育、准备成熟的卵母细胞相近，但可通过其颗粒状的棕褐色外观加以区分（图2E）。切勿使用此类卵母细胞批次，因为过滤无法将完全发育的卵母细胞与未发育的卵母细胞有效分离，且此类样本常导致胚胎培养异常，更容易出现如图5所示的发育缺陷。
另一个关键步骤是注射推注量的大小。加入的干扰试剂应足够多以产生效应，但又不能过多而引起非特异性效应。首次使用某种干扰试剂时，建.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到美国国家科学基金会 IOS 0844948 和 IOS 1024811 项目的支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-甲基腺嘌呤 | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 微米 Nitex 尼龙滤膜 | Small Parts (原 Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 微米 Nitex 尼龙滤膜 | Small Parts (原 Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| 聚苯乙烯培养皿，60 mm × 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 毛细玻璃管 | FHC, Inc | 30-30-0 | 用于拉制显微注射针 |
| P-97 型拉针仪 | Sutter Instruments | P-97 | |
| 罗丹明绿葡聚糖 | Life Technologies | D7163 | 若注射 GFP 表达报告基因，建议使用德克萨斯红葡聚糖作为注射示踪剂 |
| Instant Ocean 海盐 | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | 亦可在多数宠物商店购得 |
| 微量加样器吸头（Microloader） | Eppendorf | 5242 956.003 |
参考文献
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L.
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