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方法文章

一种对Patiria minata受精卵进行显微注射的方法

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DOI：

10.3791/51913

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2014年9月1日

 , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

本文内容

摘要

研究发育机制和基因调控网络需要能够产生形态异常胚胎的方法。Patiria miniata（海星）是开展此类研究的新兴模式生物。本文介绍了从该物种获取配子、培养胚胎以及快速显微注射受精卵的实验方案。

摘要

棘皮动物长期以来一直是研究生殖与发育的首选模式系统，近年来也被广泛用于基因调控以及发育过程进化方面的研究。Patiria miniata（海星）正逐渐成为此类研究的重要模式系统，而此前这类研究几乎 exclusively 在海胆 Strongylocentrotus purpuratus 和 Lytechinus variegatus 中进行。这些模式系统的一大优势在于能够简便地制备经过修饰的胚胎，实现特定基因的上调或下调、标记特定细胞群，或引入报告基因。单一的显微注射方法即可实现多种类型的胚胎修饰。本文中，我们介绍一种从 P. miniata 获取配子、制备受精卵，并通过显微注射引入干扰试剂的方法。随后分离出健康的形态异常胚胎，用于基因功能的定性与定量研究。该生物体的基因组和转录组数据的日益完善，进一步拓展了相关研究的类型，并提高了实验操作的便利性。

引言

海星 Patiria miniata（通常称为蝙蝠海星）正逐渐成为细胞学1-3、发育生物学4,5、进化生物学6-8以及生态学研究9-11中一个有趣且用途广泛的模式系统。成体 P. miniata 分布于从美国阿拉斯加锡特卡到加利福尼亚州下加利福尼亚的太平洋沿岸12，易于在海水水族箱中饲养。其卵母细胞可全年获取，每只雌性个体可排放数万个卵。卵母细胞易于体外成熟并进行体外受精13。所获得的胚胎透明，便于观察；胚胎发育同步，且仅需海水即可完成发育。此外，P. miniata 的全基因组组装序列及多个转录组数据均可在 Echinobase.org（Echinobase.org）获取。这些优势使其成为多种科研与教学应用的理想材料。

近年来， P. miniata 已成为发育基因调控网络分析的模式系统14-16此类研究的目的是鉴定出全部的调控基因，并确定这些基因相互作用的网络。这些工作很大程度上需要通过引入反义寡核苷酸来干扰基因表达 体外 合成的mRNA。此外， 顺式 调控分析用于表征调控DNA的功能15这些分析需要将扰动试剂和/或DNA报告基因构建体导入胚胎中。此外，为了表征这些扰动的下游效应，必须检测大量胚胎中潜在靶基因的表达变化。对数百个受精卵进行显微注射的技术是此项工作的核心。

棘皮动物（包括 P. miniata）需要数月时间才能达到性成熟。由于这一特性，通常难以建立并维持用于实验的转基因品系。因此，通过繁殖转基因成体来高效获得基因修饰的胚胎并不可行。取而代之的是，必须通过显微注射实现从头（de novo）扰动。显微注射提供了一种将非细胞膜通透性试剂导入胚胎的机会。以下方案描述了一种在2–3小时内通过显微注射将DNA、mRNA、细胞示踪剂以及吗啉代反义寡核苷酸导入数百个受精卵的方法。该方法可产生足量材料，用于多种后续实验，包括但不限于qPCR、原位杂交、RNA-Seq和蛋白质印迹（western blotting）。

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方案

尽可能将所有海水或人工海水（SW）、成年动物和培养物保持在15 °C。确保卵子和受精卵始终浸没在海水中。

使用蒸馏水或反渗透水配制的市售海盐可作为海水（SW）的良好来源。使用比重计检测盐度，并通过调整盐或水的含量以达到最佳水平。保持比重在1.020至1.025之间。将所有玻璃器皿和塑料器皿与其他实验器材分开存放，以避免化学物质污染。通过去离子水冲洗或偶尔用稀释的次氯酸钠浸泡后，再多次用水冲洗，来清洁胚胎级实验器皿。

1. 从成体紫海星（Patiria miniata）获取并成熟配子

  1. 选择一只动物以摘除其性腺。由于P. miniata无性别二态性，需在摘除后通过观察是否存在卵巢或精巢来确定性别。
  2. 用手术刀片在海星腕的一侧切开一个不超过1 cm的小开口（图1A）。使用小型钝头镊子将切口边缘拉开，以暴露性腺组织，并通过切口将性腺组织拉出。
    注意：避免拉出肠组织，肠组织呈松散的灰褐色或棕色（图1B）。卵巢通常呈橙色、黄色或浅棕色（图1C），而精巢呈白色或米色，若破裂会使海水呈现乳白色或浑浊状（图1D）。
  3. 将雌性个体放回水族箱中。将雄性个体单独置于海水容器中1至2小时，因为操作带来的应激可能诱导其产精。动物在切口处可自行愈合，并在数月内持续提供配子。
  4. 将精巢收集至1.5 ml的Eppendorf管中，尽量减少海水残留，并置于冰上保存待用。未在采集当日使用的精巢可于4 °C保存最多一周。
  5. 将卵巢置于含数毫升海水的小型玻璃培养皿中。为从卵巢组织中释放卵母细胞，使用两对镊子轻轻撕解组织，直至无大块组织残留。
    注意：理想情况下，大多数卵母细胞应为完全发育成熟。这类卵母细胞体积大、呈圆形、透明淡黄色或浅棕色，且卵母细胞内可见明显的生发泡（图2A）；相比之下，未成熟卵母细胞体积较小、呈棕色、颗粒状且不透明（图2B）。若未成熟卵母细胞比例超过约25%，应另选雌性个体获取卵母细胞。
  6. 将卵母细胞及残留组织倒入孔径为200 μm的网筛过滤杯中，收集滤过液。此步骤可保留所有类型的卵母细胞，同时去除卵巢组织。使用滴瓶向滤网上残留的组织喷洒海水，以冲洗下残留的卵母细胞。过滤杯可使用50 ml锥形管制作（图3A-A’）。
  7. 将步骤1.6所得滤过液进一步通过孔径为100 μm的网筛过滤杯过滤。弃去滤过液中的小卵母细胞。完全发育的大卵母细胞将滞留在滤网上，可用于后续成熟实验。将滤网上的卵母细胞冲洗至洁净的200 ml烧杯中。
  8. 向盛有卵母细胞的200 ml玻璃烧杯中加入95 ml海水，再加入5 ml 200 μM 1-甲基腺嘌呤，使终浓度为10 μM。
  9. 将卵母细胞转移至大型浅底培养皿中，并置于15 °C环境中。使用表面积与体积比较高的培养皿有利于气体交换。在此成熟阶段，若卵母细胞密度过高，将影响其成熟或正常发育。应将其分装至多个含海水及10 μM 1-甲基腺嘌呤的培养皿中，使密度低于200个卵母细胞/ml。
  10. 让卵母细胞成熟45–90分钟，但不可超过此时间，否则卵母细胞将失去受精能力。为判断成熟是否完成，可在解剖镜下观察卵母细胞。在成熟过程中，生发泡会向细胞膜移动并融合，随后破裂，因此在成熟卵母细胞中不再可见（图2C）。

2. 成熟卵母细胞的受精

  1. 选取一小簇睾丸组织，大小约如豌豆，置于小型玻璃培养皿中，加入约 1 ml 海水（SW），进行剪碎处理。
  2. 用巴氏吸管吸取约 2–3 滴呈乳白色的精子悬液，转移至含有约 100 ml 成熟卵细胞的培养皿中，轻轻旋转混匀。避免转移睾丸组织碎片。切勿加入过多精子，以免导致多精入卵，进而引起胚胎发育不良。
  3. 数分钟后，在解剖显微镜下观察卵细胞。已受精的卵子（即合子）将出现受精膜，表现为从细胞膜外升起的一圈透明泡状结构（图 2D）。
    注意：若受精率低于约 90%，则不应继续培养，因为低受精率提示培养体系不健康，后续发育也可能不佳。
  4. 完成受精后，将合子通过 100 μm 孔径的滤网过滤，并用新鲜海水（SW）冲洗至新的培养皿中以更换液体。此步骤至关重要，可去除过量精子，防止耗氧导致缺氧。将培养皿置于 15 °C 环境中静置 15–30 分钟。

3. 去除受精卵胶膜并排列卵子

  1. 通过取下直径为 60 × 15 mm 的聚苯乙烯培养皿的盖子来制备注射用培养皿。
    1. 用永久性记号笔在培养皿背面画一条线，围绕与显微注射镜视野相对应的区域。这可确保所有排列的胚胎均位于显微镜视野范围内。
    2. 使用玻璃巴斯德吸管在圆圈上划出一条刻痕线，最好位于圆圈的一侧（图 3B）。后续可用此线折断注射针（步骤 4.5）。
      注意：通常用于黏附海胆胚胎的试剂，例如硫酸鱼精蛋白或聚-L-赖氨酸，此处无需使用。去胶后的 P. miniata 合子能很好地黏附于未包被的塑料表面。请注意，它们在玻璃培养皿上黏附效果不佳。
  2. 向每个培养皿中加入约 10 ml 海水（SW），使液面覆盖皿底，但避免液体剧烈飞溅，以免扰动已排列的胚胎。
  3. 在排列前，使用酸化海水（SW）去除 P. miniata 合子的胶质外套。该胶质层比模式海胆物种更为厚实。
    1. 配制 pH 为 4.0–4.2 的酸化海水（SW）。pH 值至关重要，需在有效去除胶质外套的同时保证胚胎正常发育。
    2. 向 1 L 的海水（SW）储备液中逐滴加入 1 N（1 M）HCl。每加一滴后充分混匀，并在加入下一次前监测 pH。
      注意：通常需加入 1 至数毫升 HCl 即可达到合适 pH，但切勿一次性加入全部体积。
      注意：在通风橱中使用海水（SW）和 12 N（12 M）HCl 配制 1 N HCl。
    3. 将合子倒入 100 μm 网格滤膜上以去除海水（SW）。用尽可能少的海水（SW）（约 10 ml）冲洗至 200 ml 烧杯中。再加入酸化海水（pH 4.0）至总体积达 150 ml，使合子在其中静置 3 分钟。
  4. 通过在两个 200 ml 烧杯之间来回倾倒合子，并每次使其通过 200 μm 网格滤膜，以去除合子上的胶质外套。在约 2 分钟内重复此操作 5–10 次。
  5. 将合子倒入 100 μm 网格滤膜上以去除酸化海水（SW）。用海水（SW）将合子冲洗至小型玻璃培养皿中。去胶后的合子可能黏附于塑料培养皿上。应立即进行排列，因为随着时间推移，它们会重新分泌胶质层，导致在塑料表面黏附能力下降。
  6. 使用口吸管（图 3C–C’）从玻璃培养皿中吸取合子，并将其整齐排列于注射用培养皿上。将巴斯德吸管细端的中部在火焰上加热至玻璃变软，迅速将两端拉开，形成一段极细的玻璃丝。待玻璃冷却后，折断巴斯德吸管的细小末端（有关口吸管制备的更多细节，请参见 Wessel et al. 200417 或 Sweet et al. 200418）。
    1. 制作排列用吸管时，其内径应略大于胚胎直径，以确保每次仅有一个合子进入和离开吸管。这有助于形成单列排列。若吸管内径过小，可能会剥离受精膜并损伤合子，因为 P. miniata 合子缺乏透明层，质地较软。
    2. 若合子无法黏附于塑料培养皿，可将其在酸化海水（SW）中继续孵育更长时间（最多数分钟）。或者，使用更小内径的吸管可能有助于更彻底地去除胶质层，从而增强合子的黏附能力。
    3. 合子略呈正浮力，倾向于漂浮或悬浮在培养皿底部上方。此时，应调整排列吸管的位置，使合子在离开吸管时被轻柔地压向培养皿表面（图 3D）。
      注意：可在这些培养皿上排列多行合子。P. miniata 胚胎膜随时间推移不会变得更难穿透，因此可在单个培养皿上注射数百个合子。

4. 受精卵的注射

  1. 用适当浓度的吗啉代反义寡核苷酸（MASO）、mRNA 或 DNA 配制注射溶液，终浓度为 200 mM KCl。通常使用 400–800 μM MASO 和 2.5 ng/μl DNA 可在最小化毒性的前提下产生形态缺陷表型。卵子内的终浓度为起始浓度的 1/125th14。对于含有 MASO 的注射溶液，使用前应立即在 65 °C 下加热 5 分钟，随后置于室温保存。
    1. 为便于筛选已注射的胚胎，可在注射溶液中加入罗丹明葡聚糖示踪剂，使其终浓度达到 0.1%。
  2. 按照制造商说明，使用拉针仪将玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.75 mm，长度 100 mm）拉制成注射针。适用于海胆注射的针头参数同样适用于海星，因此可采用相似的拉制参数19。
  3. 使用微量移液器吸头将约 2 μl 注射溶液装入注射针中。
  4. 将注射针的钝端插入显微操作仪中。设定脉冲注射仪（pico spritzer）的脉冲时间为 100 毫秒，气压为 40 PSI。
  5. 将盛有成排胚胎的培养皿置于显微镜载物台上，确保所有胚胎均在视野范围内。调整培养皿方向，使刻痕线位于靠近注射针的一侧。将注射针以大约 60° 角度定位，使其针尖接近刻痕线中点，并略高于液面。
  6. 聚焦于刻痕线，缓慢降低注射针直至针尖清晰可见。再略微下移针尖，并轻轻接触刻痕线的凸起部分，使针尖破裂开口。随后将针尖抬离培养皿表面，移至第一排合子的上方，并对焦于合子。
  7. 降低针尖，使其以约 60° 角度刺入合子中心。P. miniata 合子易于被针尖穿透。踩下脚踏开关（或其他驱动注射液释放的装置），将一定体积的注射液注入胚胎内。
  8. 注射体积应控制在胚胎直径的 20–30%，或 25 至 80 pl 之间。若注射体积过大或过小，应调整脉冲注射仪的脉冲时间后注射下一个胚胎。从 100 毫秒开始调节。若所需脉冲时间超过约 200 毫秒，则需重新断裂针尖；若所需时间少于 15–20 毫秒即可达到目标体积，则表明针头过粗，可能干扰正常发育，应弃用该针并更换新针。
  9. 继续对注射皿中其余合子进行注射。可在卵裂开始前对合子注射，也可在第一次卵裂后对单个卵裂球进行注射。定期将针尖抬离液面，以清除粘附在针上的合子。若针尖堵塞，可根据需要重新断裂针尖或更换新针。

5. 收集已注射胚胎用于后续分析

  1. 将胚胎置于SW中，在15 °C下培养。保持培养体系具有较高的表面积与体积比，以利于氧气交换。确保胚胎不被过度拥挤，培养密度应维持在每毫升200个胚胎或更低。根据所需胚胎发育阶段，计划在注射后约20–24小时收集胚胎。 受精后
    注意：此阶段通常是分选和收集的理想时机，因为正常发育的胚胎在形态上易于区分，但尚未开始游动。
  2. 若胚胎已孵化，需轻柔进行盐冲击以防止其游动。在注射皿中，边轻轻摇晃海水（SW）边加入200 μl的5 M NaCl至10 ml海水中。数分钟后，胚胎将沉至皿底。收集这些胚胎并转移至正常盐度的海水中。
  3. 在与注射溶液中示踪剂相匹配的适当荧光光源下收集已注射的胚胎。若未使用示踪剂，则对胚胎进行筛选，选择形态正常的个体。
  4. 使用口吸管将发出荧光的胚胎连同少量SW溶液吸入，然后吹入盛有SW的小型培养皿中。理想的口吸管应具有足够大的开口，以便胚胎能够无损地吸入和排出，但又不能过大，以免吸入不需要的胚胎和多余的SW溶液。
  5. 将所有目标胚胎收集到新培养皿中后，在荧光灯下观察胚胎，剔除未注射的胚胎或发育不良的胚胎。
  6. 将分选后的胚胎在培养箱中培养至所需发育阶段，然后进行成像或其他所需实验操作。

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结果

本实验方案的目的是将试剂导入胚胎中。我们通过注射一种驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达的DNA报告载体来验证该方案的有效性。注射后的胚胎在DNA于早期卵裂阶段整合后，会在克隆区域表达GFP（图4A-B）。许多希望导入胚胎的试剂在高浓度下具有毒性，对胚胎批次不理想时尤其明显。毒性表现包括延缓发育、在早期卵裂阶段或受精卵阶段停止发育，或导致发育异常（图5A-C）。

海星解剖实验，展示实验室环境中海星的外部和内部解剖结构。
图1. 从P. miniata成体中获取配子。A) 切除性腺时，需在腕部侧面靠近动...

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讨论

对于初次使用该技术的研究人员而言，有两个关键步骤较为困难，但对成功获得形态缺陷胚胎至关重要。第一个步骤是选择健康的卵母细胞，以确保其能够正常成熟并受精。培养物中正常发育的比例取决于季节、动物的健康状况以及从同一个体采集卵母细胞的次数。通常，每年4月至10月期间获得的卵母细胞质量较好。在进行后续操作前，必须仔细观察卵母细胞，确保大多数卵母细胞的形态类似于图2A，而非图2B。允许存在少量无法成熟的卵母细胞，特别是当它们足够小、可在处理过程中通过过滤去除时。偶尔会遇到未发育成熟的卵母细胞，其大小几乎与已完全发育、准备成熟的卵母细胞相近，但可通过其颗粒状的棕褐色外观加以区分（图2E）。切勿使用此类卵母细胞批次，因为过滤无法将完全发育的卵母细胞与未发育的卵母细胞有效分离，且此类样本常导致胚胎培养异常，更容易出现如图5所示的发育缺陷。

另一个关键步骤是注射推注量的大小。加入的干扰试剂应足够多以产生效应，但又不能过多而引起非特异性效应。首次使用某种干扰试剂时，建...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到美国国家科学基金会 IOS 0844948 和 IOS 1024811 项目的支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-甲基腺嘌呤Acros Organics (Fisher Scientific)AC20131-1000
190 微米 Nitex 尼龙滤膜Small Parts (原 Sefar)CMN-0185-C/5PK-05
100 微米 Nitex 尼龙滤膜Small Parts (原 Sefar)CMN-0105-C/5PK-05
聚苯乙烯培养皿，60 mm × 15 mmFisher ScientificFB0875713A
毛细玻璃管FHC, Inc30-30-0用于拉制显微注射针
P-97 型拉针仪Sutter InstrumentsP-97
罗丹明绿葡聚糖Life TechnologiesD7163若注射 GFP 表达报告基因，建议使用德克萨斯红葡聚糖作为注射示踪剂
Instant Ocean 海盐Doctors Foster and SmithCD-116528亦可在多数宠物商店购得
微量加样器吸头（Microloader）Eppendorf5242 956.003

参考文献

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