本方法旨在通过颈动脉持续输送药物溶液，以评估新药在小鼠模型中的药代动力学。
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本文内容
摘要
摘要
在提出将某种药物、药物组合或药物递送系统用于新体系时，必须评估该药物在研究模型中的药代动力学。由于小鼠模型在临床前药物发现与药物开发中通常是至关重要的步骤1-8，因此有必要设计一种能够以均一且可重复的方式向小鼠给药的系统。理想情况下，该系统应允许在设定的时间过程中定期采集血液样本。质谱法测定药物浓度的能力，使研究人员能够在单个小鼠体内追踪血浆中药物水平随时间的变化1, 9, 10。在本研究中，紫杉醇通过颈动脉持续输注的方式给予转基因小鼠，持续三小时，同时在预定时间点通过眼后静脉丛采血获取血样。当存在乳腺肿瘤或其他阻碍因素而使颈静脉输注难以实施时，颈动脉输注可作为颈静脉输注的一种潜在替代方法。使用该技术，血浆和组织中的紫杉醇浓度可达到与颈静脉输注相似的水平。在本教程中，我们将演示如何通过为单个小鼠模型制备优化的导管，成功进行颈动脉插管；接着展示如何将导管插入并固定于小鼠颈动脉，将导管末端从小鼠颈部背部引出，并将小鼠连接至泵以实现可控速率的药物输入。多次低体积的眼后静脉丛采血可实现对血浆药物浓度随时间变化的分析。
引言
通过优化设备和技术，可稳定且可重复地经颈动脉进行药物输注。该操作并不复杂，但需要精细的控制和对细节的关注。分离颈动脉并插入导管需要较高的操作技巧和熟练度，通常可通过练习掌握。经验丰富的技术人员完成手术不应超过一小时。手术成功后，小鼠应表现正常且健康（尽管小鼠可能对实际的药物输注产生反应），并可接受可控、均匀的持续剂量给药。血样必须从颈动脉以外的部位采集；经眼后静脉丛采血操作简便，且足以满足药物浓度分析的需求。
选择尺寸和形状合适的导管对于成功进行输注至关重要11。我们发现市售导管通常过大和/或过于柔软，难以方便地进入小鼠颈动脉。相比之下，使用连接小鼠与输注注射器的聚乙烯管自行制作导管更为理想。这样，所有管路、连接器和针头的尺寸保持一致，简化了输注装置的组装。采用该技术时，无需将导管尖端推进至肉眼不可见的深处，且在导管初步固定之前不恢复颈动脉血流。这降低了穿刺动脉或因血流高压将导管冲出的风险。本文所述导管设计未包含用于固定的“凸起”结构，因此必须优先确保使用缝线和外科胶带将导管牢固固定。
输注给药可能优于常见的静脉推注，因其能更好地模拟紫杉烷类药物等在临床上的给药方式3, 12, 13。本文所述技术最初是为了在小鼠模型中实现输注给药而开发的，这些小鼠由于乳腺肿瘤生长和/或插管区域血管过度增生，无法通过颈静脉或股静脉进行操作。即使在无肿瘤的小鼠中，该方法也常常适用：尽管分离和插管颈....
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方案
本方案已获得福克斯蔡斯癌症中心机构动物照护与使用委员会以及实验动物设施的批准，并被认定符合机构关于动物人道待遇的指导方针。
1. 初步准备
- 导管制备：使用一段较短的聚乙烯管制作导管，将其末端加工成变细且钝化的形式（图3A）。可预先制作多个导管，并可长期保存。
- 点燃本生灯，调节至产生低而稳定的火焰。将聚乙烯管靠近火焰以软化材料。当管材开始熔化时，缓慢将两端拉开，形成一段变细的管段，外径约为0.25 mm。
- 在变细段约0.75 cm处切割出一个斜面末端。这样可确保有足够的管长固定于动脉内，同时避免导管过长。
注意：导管末端过长且纤细容易发生堵塞。过长的末端还可能残留较多液体，显著改变导管的液体容量。 - 将斜面末端快速通过火焰以使其钝化——当加热适当时，末端会略微变圆并略微膨大。尖端轻微回钩，有助于在插入动脉时固定导管。
- 从管材开始变细的位置起，量取6.0 cm处切断。这样制成的导管长度适中，既足够长以便穿过颈部并方便操作，又足够短以防止小鼠啃咬多余管材或需要过多额外灌注体积来排空初始的生理盐水。
- 准备一支含有约0.2 ml肝素溶液的注射器，前端安装钝化针头。将针头插入导管的宽端（图3B）。用肝素充满导管，注意确保管内无气泡。将装有肝素的注射器和导管置于无菌区域备用。....
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结果
在15分钟高速输注后接165分钟低速输注的3小时给药方案中，紫杉醇的分布遵循可预测的模式。
图1展示了经颈静脉输注后血浆中紫杉醇浓度与颈动脉输注的比较。在初始大剂量输注后，紫杉醇浓度在前15分钟内迅速下降，随后在接下来的150分钟内趋于平稳。相比之下，输注效果较差的情况中，紫杉醇浓度起始水平相对较低，并在整个检测过程中上下波动。这很可能是因为输注早期导管出现阻塞所致。检测记录显示，小鼠对输注过程几乎没有或完全没有外部反应，进一步支持了药物给药效果不佳的判断。图2显示了在3小时输注结束时，肝脏和脑组织以及血浆中紫杉醇的相对水平。
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讨论
颈动脉灌注是本研究紫杉醇药代动力学的重要技术。颈动脉灌注是一种可将药物快速分布至整个循环系统的方法14。与快速静脉推注相比，持续3小时的灌注更接近临床上紫杉烷类药物的实际给药方式。该手术可由单人可靠完成，手术时间相对较短，成功率>75%。样本采集后，必须采用适当的方法进行分析。我们采用质谱法测定血浆和组织样本中的紫杉醇浓度。为进一步验证该技术的可靠性，我们将血液和组织样本送至独立实验室进行分析。这些数据被绘制成每只实验动物个体的血浆紫杉醇浓度-时间曲线（图1），并比较了紫杉醇在不同组织中的分布情况（图2）。在每种情况下，应根据所研究的药物和系统，选择最合适的分析方法来评估药物的分布和/或代谢。针对其他不同类型药物的检测，可选方法还包括高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）或免疫分析法2。
成功进行颈动脉插管的两个主要因素是制作精良的导管和出色的动脉分离。根据小鼠模型的大小制作导管至关重要。如果导管直径过粗，插入动脉将过于困难；而导管过细则难以固定，且在输注前或输.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢FCCC实验动物设施中心在本项目中提供的支持。感谢Wolfe Laboratories, Inc.在血浆和组织中紫杉醇水平分析方面提供的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院基金资助，项目编号为E.H.B.获得的K01CA120091，以及Fox Chase癌症中心获得的CA06927。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乙烯管 0.024” 外径 × 0.011” 内径 | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 个钝头针头（30 号） | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| 不锈钢端口塞（28 号） | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | 略大于聚乙烯管内径，以紧密贴合并保持良好密封。 |
| 2 个不锈钢连接塞（30 号） | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| 三个 1 cc 注射器 | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| 无菌 0.9% 生理盐水溶液 | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS 肝素/甘油溶液 | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| 丝线缝合线 | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna 剪刀（显微剪刀） | World Precision Instruments | 14122 | 此型号具有弯曲尖端，但直尖剪刀同样适用。 |
| Hartman Mesquito 止血钳 | World Precision Instruments | 501705 | |
| 碘伏棉签棒 | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| 布比卡因 | Hospira | 0409-1160-01 | 可用利多卡因或其他类似局部麻醉剂替代。 |
| 紫杉醇 | LC Laboratories | P-9600 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| 微量血细胞比容毛细管，肝素化 | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| 微量毛细管密封剂 | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J 小鼠 | Fox Chase 癌症研究中心 实验动物设施 自繁 | ||
| API 4000 Q-Trap 质谱仪 | Applied Biosystems |
参考文献
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V. Clinical Pharmacokinetics of Paclitaxel. Clinical Pharmaco....
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重印与许可
