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方法文章

小鼠中紫杉烷类药物药代动力学与药效学分析的颈动脉灌注

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DOI：

10.3791/51917

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2014年10月27日

 , 
1Program in Developmental Therapeutics, Fox Chase Cancer Center

本文内容

摘要

本方法旨在通过颈动脉持续输送药物溶液，以评估新药在小鼠模型中的药代动力学。

摘要

在提出将某种药物、药物组合或药物递送系统用于新体系时，必须评估该药物在研究模型中的药代动力学。由于小鼠模型在临床前药物发现与药物开发中通常是至关重要的步骤1-8，因此有必要设计一种能够以均一且可重复的方式向小鼠给药的系统。理想情况下，该系统应允许在设定的时间过程中定期采集血液样本。质谱法测定药物浓度的能力，使研究人员能够在单个小鼠体内追踪血浆中药物水平随时间的变化1, 9, 10。在本研究中，紫杉醇通过颈动脉持续输注的方式给予转基因小鼠，持续三小时，同时在预定时间点通过眼后静脉丛采血获取血样。当存在乳腺肿瘤或其他阻碍因素而使颈静脉输注难以实施时，颈动脉输注可作为颈静脉输注的一种潜在替代方法。使用该技术，血浆和组织中的紫杉醇浓度可达到与颈静脉输注相似的水平。在本教程中，我们将演示如何通过为单个小鼠模型制备优化的导管，成功进行颈动脉插管；接着展示如何将导管插入并固定于小鼠颈动脉，将导管末端从小鼠颈部背部引出，并将小鼠连接至泵以实现可控速率的药物输入。多次低体积的眼后静脉丛采血可实现对血浆药物浓度随时间变化的分析。

引言

通过优化设备和技术，可稳定且可重复地经颈动脉进行药物输注。该操作并不复杂，但需要精细的控制和对细节的关注。分离颈动脉并插入导管需要较高的操作技巧和熟练度，通常可通过练习掌握。经验丰富的技术人员完成手术不应超过一小时。手术成功后，小鼠应表现正常且健康（尽管小鼠可能对实际的药物输注产生反应），并可接受可控、均匀的持续剂量给药。血样必须从颈动脉以外的部位采集；经眼后静脉丛采血操作简便，且足以满足药物浓度分析的需求。

选择尺寸和形状合适的导管对于成功进行输注至关重要11。我们发现市售导管通常过大和/或过于柔软，难以方便地进入小鼠颈动脉。相比之下，使用连接小鼠与输注注射器的聚乙烯管自行制作导管更为理想。这样，所有管路、连接器和针头的尺寸保持一致，简化了输注装置的组装。采用该技术时，无需将导管尖端推进至肉眼不可见的深处，且在导管初步固定之前不恢复颈动脉血流。这降低了穿刺动脉或因血流高压将导管冲出的风险。本文所述导管设计未包含用于固定的“凸起”结构，因此必须优先确保使用缝线和外科胶带将导管牢固固定。

输注给药可能优于常见的静脉推注，因其能更好地模拟紫杉烷类药物等在临床上的给药方式3, 12, 13。本文所述技术最初是为了在小鼠模型中实现输注给药而开发的，这些小鼠由于乳腺肿瘤生长和/或插管区域血管过度增生，无法通过颈静脉或股静脉进行操作。即使在无肿瘤的小鼠中，该方法也常常适用：尽管分离和插管颈动脉的侵入性略高，但我们发现其优于颈静脉，因为颈静脉壁容易撕裂，导致插管失败率更高，且难以完成3小时的给药过程。

尽管此处展示的结果来自C57BL/6J（本实验室繁育）小鼠，但我们已成功将该技术用于多种小鼠品系（包括FVB品系和混合品系）的紫杉醇输注，以研究在转基因调控下细胞转运蛋白功能被下调的小鼠模型中的药代动力学。所采集的血液和组织样本中紫杉醇水平处于预期范围内，与经颈静脉输注后观察到的水平相当1。该技术预计也可在其他小鼠模型及其他输注溶液中同样有效。

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方案

本方案已获得福克斯蔡斯癌症中心机构动物照护与使用委员会以及实验动物设施的批准，并被认定符合机构关于动物人道待遇的指导方针。

1. 初步准备

  1. 导管制备：使用一段较短的聚乙烯管制作导管，将其末端加工成变细且钝化的形式（图3A）。可预先制作多个导管，并可长期保存。
    1. 点燃本生灯，调节至产生低而稳定的火焰。将聚乙烯管靠近火焰以软化材料。当管材开始熔化时，缓慢将两端拉开，形成一段变细的管段，外径约为0.25 mm。
    2. 在变细段约0.75 cm处切割出一个斜面末端。这样可确保有足够的管长固定于动脉内，同时避免导管过长。
      注意：导管末端过长且纤细容易发生堵塞。过长的末端还可能残留较多液体，显著改变导管的液体容量。
    3. 将斜面末端快速通过火焰以使其钝化——当加热适当时，末端会略微变圆并略微膨大。尖端轻微回钩，有助于在插入动脉时固定导管。
    4. 从管材开始变细的位置起，量取6.0 cm处切断。这样制成的导管长度适中，既足够长以便穿过颈部并方便操作，又足够短以防止小鼠啃咬多余管材或需要过多额外灌注体积来排空初始的生理盐水。
    5. 准备一支含有约0.2 ml肝素溶液的注射器，前端安装钝化针头。将针头插入导管的宽端（图3B）。用肝素充满导管，注意确保管内无气泡。将装有肝素的注射器和导管置于无菌区域备用。 通过将导管置于培养皿中并接受20 Gy伽马射线辐照进行灭菌 。若无伽马辐射源，可咨询动物设施以探讨其他灭菌方式，例如气体或化学灭菌。 切勿使用高压蒸汽灭菌（autoclave），因为聚乙烯不能耐受高温灭菌。
  2. 制备生理盐水引导管（图3B）。
    1. 准备第二支注射器，装入约0.5 ml无菌生理盐水，注意确保管路中无气泡。
    2. 取另一段长约15 cm的管材，套在钝化针头上。在管材的自由端连接一个连接端口。
    3. 通过平稳推动少量生理盐水，测试引导管的流通是否通畅。在导管插入后使用此生理盐水引导管检查导管通畅性，并用于冲洗血液。将生理盐水注射器置于无菌区域备用。
  3. 手术前，通过高压蒸汽灭菌、气体灭菌或玻璃珠灭菌等方式对器械进行灭菌处理。
  4. 准备无菌手术区域。
    1. 使用70%乙醇或二氧化氯等消毒剂擦拭实验台和显微镜表面。在实验台和显微镜底座上覆盖清洁的一次性吸水垫。
    2. 准备手术板：在其表面覆盖两层清洁的吸水纸，并用胶带牢固固定。
  5. 将所有手术用品（参见材料清单）摆放整齐，确保易于取用。
    1. 剪取三段无菌缝线，每段8 cm，与其他用品一起放置备用。将连接端口放在便于取用的位置（图3B）。

2. 手术

  1. 动物准备
    1. 将小鼠置于连接精密挥发器的麻醉舱中，通过吸入2-3%异氟烷进行麻醉。 从小鼠颈部/上躯干及右耳下方（导管出口位置）剃除毛发，取出小鼠，并在眼睛上涂抹兽用凡士林眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。确保在手术准备过程中动物不会苏醒：可在麻醉舱中给予足够时间（至少2分钟），或在准备过程中通过鼻罩持续给予异氟烷。 将小鼠放回麻醉舱。
    2. 当小鼠达到充分无反应状态后，转移至无菌手术区域，将麻醉鼻罩覆盖于小鼠口鼻部，并将异氟烷气流切换至鼻罩。用镊子轻夹小鼠足爪以确认麻醉深度；若无反应，则进行下一步操作。
    3. 将小鼠仰卧位固定，头部朝向操作者。使用胶带或其他固定装置将耳朵、前肢和后肢固定于手术板上，以保持小鼠稳定。用聚维酮碘和70%乙醇清洁切口区域。
  2. 颈动脉分离
    1. 在颈部中线右侧稍偏处做一约1 cm的纵向切口。使用镊子分离脂肪和肌肉组织，暴露气管（图4A）。找到与气管平行走行的颈动脉（图4B）。
    2. 小心使用镊子分离覆盖在动脉表面的筋膜（图4C）。轻轻将迷走神经从颈动脉旁拨开，并将镊子插入其间隙。轻柔张开镊子以在筋膜中形成间隙，从靠近喉部（前段）的动脉分叉处开始，向后（远端）尽可能分离迷走神经与动脉（至少3 mm）（图4D）。
    3. 清除残留筋膜，直至动脉完全游离（图4E）。手术过程中可间歇性滴加生理盐水以保持组织湿润，减少组织脆性，防止意外撕裂。
  3. 缝线放置及导管插入前的动脉准备（图4、5）。
    1. 用镊子将丝线从动脉下方穿过。打结牢固结扎，尽可能向前（近端）闭塞动脉（图4F）。
    2. 在动脉下方穿入第二根缝线。打一个可松解的结，尽可能向后（远端）暂时闭塞动脉（图4F）。
    3. 在动脉下方穿入第三根缝线。在前两根缝线之间打一个非常松的结，用于导管置入后快速固定导管（图4G）。
    4. 用少量70%乙醇润湿各缝线末端，将其移至操作区域外侧备用。
  4. 导管插入
    1. 持缝线轻拉下方结扎线，使动脉略为绷紧。在前段结扎线稍上方但非常接近处切开动脉（图4H）。注意不要切得过深，并检查切口确保通畅无阻。
    2. 将充满肝素的导管从注射器针头上取下，尽量避免在导管两端形成大气泡。调整导管方向，使斜面处于合适角度，通常朝下并略向右偏（适用于右手操作者）。
    3. 在持缝线保持动脉轻微张力的同时，轻柔地将导管插入切口（图4I）。用镊子夹住前段缝线，将动脉向下拉过导管（避免过度上推导管，以防斜面刺破动脉壁）。小心松开导管和前段缝线。
  5. 导管固定及血流启动（图4J、5B）。
    1. 通过收紧中间缝线的结扎线来固定导管，结扎位置应靠近导管进入动脉的入口处。打一个牢固的三重结，但注意不要过紧，以免阻塞导管内血流。再用前段缝线在动脉入口下方将导管进一步固定。
    2. 通过连接插头将生理盐水导管与导管相连，注意避免引入气泡。
    3. 握住后段缝线两端，轻柔牵拉以松解结扎。将缝线沿动脉向远端滑动，越过导管末端（不要移除缝线）。血液应流入导管；若无血流，可轻柔晃动导管以解除可能的阻塞。
    4. 当血流确认通畅后，使用后段缝线的末端在中间缝线上方稍远处再打一个附加结。
  6. 导管临时封闭。用生理盐水冲洗导管内的血液，然后用止血钳夹闭导管末端靠近连接插头处。取下连接插头，更换为端口塞以封闭导管末端，随后移除止血钳。
  7. 重新定位导管使其从颈背部穿出。
    1. 双手各持一把镊子，用其中一把镊子夹住前段缝线下方的导管，另一把在导管上压出一个折弯，使其易于侧向弯曲。重复操作形成第二个折弯。此操作可使导管自由端顺利向小鼠头部后方牵拉，而不会迫使导管尖端在动脉壁内侧横向扭转。
    2. 将小鼠翻转至（左侧）侧卧位，保持鼻罩覆盖口鼻，用70%乙醇和聚维酮碘清洁切口区域。 在右耳下方及后方做一小切口（约4 mm）。
    3. 用镊子夹住皮肤切口的游离缘，将钝头空心探针在皮下穿行，从颊部建立通道至颈部术区。建议绕过唾液腺进行穿行，而非尝试在腺体与皮肤之间穿行。用镊子小心开辟探针出口空间。
    4. 将带端口塞的导管经探针引导穿出至颈部。操作时勿用力过猛，确保导管未压迫或阻塞血管或器官。
  8. 伤口闭合与术后恢复。在肩部切口处给予局部镇痛药（例如布比卡因），并用防水外科胶带覆盖伤口。再用第二条胶带进一步固定导管。
    1. 在胸部切口处给予局部镇痛药，并用丝线或缝合钉闭合切口。
    2. 将小鼠移出麻醉状态，置于清洁、加温的环境中恢复（将笼子放在加热垫上或加热灯下），至少恢复30分钟。

3. 灌注

  1. 制备5 mg/ml的紫杉醇/甲醇溶液分装样品。
    1. 将50 mg紫杉醇称量至15 ml离心管中，加入10 ml无菌甲醇。盖紧管盖，在室温下手动旋转或使用旋转摇床振荡，直至粉末完全溶解。
    2. 将溶液以每管500 µl分装至20个耐冷冻小管中，于-20 °C保存。
    3. 在输注前，于室温或37 °C水浴中解冻单份分装样品。
  2. 准备输液泵（图6）。
    1. 剪取一段长约40 cm的聚乙烯管。在一端连接钝针，另一端连接接头端口。
    2. 使用已知内径的注射器抽取药物（大多数可编程泵需要输入注射器筒的直径，以便计算泵推杆的推进速度）。将针头连接至注射器，并通过针头和管道将药物装入。
    3. 根据制造商说明将注射器安装到泵中。启动泵进行预冲，使药物平稳地从连接插头流出，确保系统已准备好进行输注。
  3. 将小鼠连接至输液泵。
    1. 固定小鼠，使用止血钳夹闭导管，位置靠近端口塞。取下塞子，并替换为连接注射器和管道的接头。
      注意：血液可能开始回流进入管道。
    2. 迅速启动快速泵注，以清除导管内的残留体积（该体积通过观察6 cm管道内的液体体积经验性确定），随后立即切换至所需的输注速率。
  4. 持续进行为期三小时的紫杉醇输注。
    1. 定期检查管道，观察连接处是否有泄漏，这通常是流向小鼠的液体出现阻塞的征兆。同时观察小鼠对输注的预期或非预期反应（如嗜睡或过度活跃、不适表现）。
    2. 根据输注的持续时间和性质，小鼠可能不会进食或饮水，但应按照机构既定政策确保其能够获得食物和水。注意因采集大量血液可能导致小鼠脱水的风险。
    3. 持续使用加热垫或加热灯保持笼内温暖，除非小鼠表现出远离热源的意愿。若手术后数小时内未实施安乐死，应执行术后动物护理方案，包括无菌饲养条件及术后镇痛治疗。
    4. 密切观察小鼠，尤其是在最初几分钟内，确保其不会因过度活跃或管道刺激而拔出管道（后者可能是插入不当的表现）。若小鼠未表现出过度活动，可能无需持续监控，但仍需定期检查，防止动物被管道缠绕。市面上有商用的背心式固定装置和连接系统，但其使用不在本方案范围内。
  5. 样品采集。
    1. 通过下颌下采血或眶后静脉丛采血定期采集血液样本（如果您的实验方案未使用乳腺肿瘤模型，可考虑在插入颈动脉导管的同时插入颈静脉导管以采集血液）。  注意避免牵拉输液管。若采用眶后静脉丛采血，可使用吸入性麻醉剂（例如甲氧氟烷）对小鼠进行轻度麻醉，从而无需抓握颈部皮肤即可固定小鼠。
    2. 将血液在微量压积离心机中离心，分离血细胞与血浆。使用锉刀或金刚石笔在相分离界面处标记离心管。折断管体，仅收集血浆至耐冷冻小管中。于-80 °C保存直至分析。
      注意：若无微量压积离心机，可将血液样本转移至微量离心管中，高速离心以分离血细胞与血浆。将血浆转移至另一管中，于-80 °C保存。
    3. 采用CO2窒息法对小鼠实施安乐死。从目标器官采集组织样本（约20–50 mg），并立即在液氮中速冻。于-80 °C保存直至分析。

4. 样品分析

注意：本方案的所有样品均通过外部实验室采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行分析，紫杉醇浓度由该实验室按如下方法计算得出：

  1. 从样品中提取紫杉醇。在提取前，将组织样品在含0.1%乙酸的50%甲醇溶液中匀浆。采用含内标类似物（多西他赛）的甲基叔丁基醚（MTBE）进行液-液萃取以提取紫杉醇。去除MTBE并干燥样品。用50%乙腈、0.1%乙酸溶液重悬。
  2. 制备校准标准品。将已知浓度的紫杉醇加入适当的C57BL/6基质中，获得最终的标准品浓度范围（血浆样品为1–20,000 ng/mL，组织样品为0.1–5,000 ng/mL）。采用与上述研究样品相同的方法，对标准品进行双重复提取。通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC/MS/MS）结合电喷雾电离检测样品中紫杉醇的色谱峰。
  3. 根据紫杉醇与内标峰面积比计算浓度。利用校准标准品绘制标准曲线，并将研究样品的检测值通过曲线拟合进行插值计算。根据匀浆前样品的初始重量对研究样品的浓度进行归一化处理。

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结果

在15分钟高速输注后接165分钟低速输注的3小时给药方案中，紫杉醇的分布遵循可预测的模式。

图1展示了经颈静脉输注后血浆中紫杉醇浓度与颈动脉输注的比较。在初始大剂量输注后，紫杉醇浓度在前15分钟内迅速下降，随后在接下来的150分钟内趋于平稳。相比之下，输注效果较差的情况中，紫杉醇浓度起始水平相对较低，并在整个检测过程中上下波动。这很可能是因为输注早期导管出现阻塞所致。检测记录显示，小鼠对输注过程几乎没有或完全没有外部反应，进一步支持了药物给药效果不佳的判断。图2显示了在3小时输注结束时，肝脏和脑组织以及血浆中紫杉醇的相对水平。

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讨论

颈动脉灌注是本研究紫杉醇药代动力学的重要技术。颈动脉灌注是一种可将药物快速分布至整个循环系统的方法14。与快速静脉推注相比，持续3小时的灌注更接近临床上紫杉烷类药物的实际给药方式。该手术可由单人可靠完成，手术时间相对较短，成功率>75%。样本采集后，必须采用适当的方法进行分析。我们采用质谱法测定血浆和组织样本中的紫杉醇浓度。为进一步验证该技术的可靠性，我们将血液和组织样本送至独立实验室进行分析。这些数据被绘制成每只实验动物个体的血浆紫杉醇浓度-时间曲线（图1），并比较了紫杉醇在不同组织中的分布情况（图2）。在每种情况下，应根据所研究的药物和系统，选择最合适的分析方法来评估药物的分布和/或代谢。针对其他不同类型药物的检测，可选方法还包括高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）或免疫分析法2。

成功进行颈动脉插管的两个主要因素是制作精良的导管和出色的动脉分离。根据小鼠模型的大小制作导管至关重要。如果导管直径过粗，插入动脉将过于困难；而导管过细则难以固定，且在输注前或输...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢FCCC实验动物设施中心在本项目中提供的支持。感谢Wolfe Laboratories, Inc.在血浆和组织中紫杉醇水平分析方面提供的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院基金资助，项目编号为E.H.B.获得的K01CA120091，以及Fox Chase癌症中心获得的CA06927。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚乙烯管 0.024” 外径 × 0.011” 内径 Braintree Scientific, Inc.PE10
3 个钝头针头（30 号）Braintree Scientific, Inc.NB-30
不锈钢端口塞（28 号）Braintree Scientific, Inc.PP-28略大于聚乙烯管内径，以紧密贴合并保持良好密封。
2 个不锈钢连接塞（30 号）Braintree Scientific, Inc.C-30
三个 1 cc 注射器Becton, Dickinson and Co.309659
无菌 0.9% 生理盐水溶液Hospira0409-7984-37
Cath-Loc HGS 肝素/甘油溶液 Braintree Scientific, Inc.HGS
丝线缝合线Braintree Scientific, Inc.SUT-S 113
Vanna 剪刀（显微剪刀）World Precision Instruments14122此型号具有弯曲尖端，但直尖剪刀同样适用。
Hartman Mesquito 止血钳World Precision Instruments501705
碘伏棉签棒Perdue Products L.P.BSWS1S
布比卡因Hospira0409-1160-01可用利多卡因或其他类似局部麻醉剂替代。
紫杉醇LC LaboratoriesP-9600
甲醇Sigma-Aldrich32213
微量血细胞比容毛细管，肝素化Fisher Scientific22-362-566
微量毛细管密封剂 Fisher Scientific02-678
C57BL/6J 小鼠Fox Chase 癌症研究中心 实验动物设施 自繁
API 4000 Q-Trap 质谱仪Applied Biosystems

参考文献

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