用于后弹力层内皮角膜移植术的角膜供体组织制备

摘要

内皮角膜移植术是一种不断发展的外科技术，随着技术进步，每一代移植的移植物都变得更薄¹。本文介绍一种可控的手动组织分离技术，可安全、可重复地将供体角巩膜瓣中的内皮细胞层和后弹力层分离用于移植²。

摘要

后弹力膜内皮角膜移植术（DMEK）是一种角膜移植形式，仅将单层细胞——角膜内皮细胞及其基底膜（即后弹力膜）——移植到受体角膜的后部基质上³。与后弹力膜剥离自动内皮角膜移植术（DSAEK）不同，DSAEK会额外引入供体基质组织，因而会产生非自然的基质-基质界面；而DMEK不形成此类界面。因此，角膜的自然解剖结构得以最大程度保留，从而促进更快的恢复速度和更高的视觉敏锐度⁴。内皮角膜移植术（EK）是治疗内皮功能障碍的首选手术方式。EK的优势包括视力快速恢复、保持眼球结构完整性，以及由于采用小的周边切口而引起的屈光变化极小¹。DSAEK使用包含部分厚度基质层和内皮层的供体组织。该手术能够迅速获得广泛应用，主要归功于眼库预先切割好的供体组织的可获得性。眼库制备供体组织的优势包括：无需在手术室配备特殊设备，以及在组织制备过程中发生穿孔时可提供备用供体组织。此外，眼库技术人员进行大批量供体组织制备，可能有助于提高供体组织的质量。由于DSAEK在供体与受体角膜之间形成了基质界面，其最佳矫正视力可能受到一定限制。而在DMEK中，仅移植供体的后弹力膜和内皮层，消除了这一界面，可能改善视力预后并减少EK术后并发症⁵。与DSAEK类似，DMEK的长期成功和临床接受程度也依赖于眼库能否方便地提供预先切割好的供体组织。本文介绍一种逐步进行供体组织制备的方法，可能有助于降低眼库在提供DMEK移植物过程中面临的一些障碍。

引言

内皮角膜移植术（EK）已迅速取代穿透性角膜移植术（PKP），成为治疗内皮细胞疾病的首选手术方式，2012年在美国开展的所有角膜移植手术中，EK占比超过50%⁶。PKP存在诸多局限性，包括视力恢复期长、散光程度高、屈光状态不稳定、眼球完整性受损以及缝线相关并发症。早期的EK手术，如深板层内皮角膜移植术（DLEK），需手动剥离角膜基质，并移植部分厚度的供体角膜组织。此类手术虽成功实现了供体内皮组织的移植并保持了角膜表面的完整性，但技术难度较高，且由于角膜板层界面不规则，最佳矫正视力受限¹。目前首选的EK手术为后弹力层剥离内皮角膜移植术（DSEK），该术式可保持角膜透明性，实现更快的视力恢复，减少术后屈光误差和散光，降低外伤性切口裂开的风险，同时保留角膜表面完整性⁷。该手术通过切除病变的后弹力层和内皮层，并以包含新内皮细胞层的部分厚度供体角膜组织进行替代。供体角膜通常使用微型角膜刀进行切割，以制备待移植的后部组织⁸。眼库对供体组织的预先处理在该手术的快速发展中起到了关键作用，甚至可说是其成功的重要因素。2005年至2012年间，美国DSEK手术数量增长近16倍，与此相应，目前几乎有一半的供体角膜组织由眼库预先制备完成⁶。

尽管DSEK可将视力提高至20/40或更好，但由于基质界面混浊以及供体基质组织增加导致的光散射增强，大多数患者无法达到20/20视力⁷。内皮角膜移植术（EK）已发展为仅移植供体后弹力膜（DM）和内皮细胞的后弹力膜内皮角膜移植术（DMEK）。该手术使更多患者达到20/20视力，视力恢复更快，且内皮排斥风险更低⁹。然而，由于移植物更薄，供体组织的制备更具挑战性。

方案

1. 无菌区域的设置

1. 穿戴适当的防护服装，包括帽子和口罩。进入处理室时需佩戴眼部防护装备。
2. 准备处理区域。若使用处理室，应持续开启风扇，以在室内维持正压环境。
3. 准备所有所需物品。检查有效期、包装完整性及灭菌指示剂。
4. 洗手并佩戴非无菌手套。
5. 打开无菌器械包以建立无菌区域。若在处理室内操作，将器械包放置于台面，并以无菌方式打开外层包裹。外层包裹边缘1½英寸范围不得作为无菌区域使用，因其被视为非无菌区域。
6. 采用无菌技术，将无菌物品打开并放入无菌区域内，但预先已包含在无菌包内的物品除外。
7. 移动显微镜，使其位于无菌区域上方，打开显微镜光源，并根据需要调节目镜。
8. 获取待剥离的角膜组织（置于保存液中），放置于已准备好的无菌处理区旁。松开观察室盖帽，使其无螺纹连接地放置于观察室底座上。丢弃非无菌手套。
9. 打开一副无菌手套、无菌手术衣及毛巾。
10. 执行外科手部消毒。先穿上无菌手术衣，再佩戴无菌手套。
11. 打开器械盒，确保所有物品易于取用。展开防湿无菌巾以建立操作区域。
12. 将针头连接至5 cc注射器。使用止血钳，在30 G针头斜面近端1 mm处弯折一次，再于基部近端1 mm处进行第二次弯折，形成“S”形。
13. 组装台盼蓝染色用玻璃注射器：将活塞插入注射器筒内，并用手指旋紧活塞。连接套管。
14. 将套管连接至平衡盐溶液（BSS）瓶。
15. 将角膜环钻从真空固定块上分离并放置一旁。将真空固定块置于显微镜视野中央。
16. 调节显微镜设置，使真空固定块处于清晰对焦状态。

2. 供体组织制备的操作步骤

1. 使用铝箔片作为屏障，掀开观察室的盖子。用另一只手持镊子，轻轻夹住角膜的巩膜边缘以取出角膜。随后重新盖上观察室的盖子。
2. 完全压下抽吸注射器的活塞，然后将角膜上皮面朝下放置在真空台上，并确保其居中。（图1）
3. 利用导柱轻轻将定位环放至真空台上。通过缓慢释放抽吸注射器的活塞来启动真空。取下定位环并放置一旁。（图2）
4. 进行部分角膜环钻，划透后弹力层（Descemet’s膜）。
5. 调整显微镜的变倍和焦距，使组织清晰可见。
6. 倾斜真空台，并在角膜缘处使用无菌棉签尖端去除多余的培养基。（图3）
7. 在角膜缘处滴加适量染色剂，以染色已划痕的后弹力层边缘。让染色剂在内皮表面停留60–90秒。（图4）
8. 去除染色剂：
   1. 倾斜真空台，将染色剂从角膜表面倒入纱布垫上。
   2. 使用手术尖头工具清除角膜缘区域的多余染色剂，注意避免接触内皮层。（图5）
9. 使用数滴BSS冲洗角膜上的染色液，并用无菌棉签尖端去除多余的BSS。（图6）
10. 在巩膜边缘滴加1–2滴BSS，防止组织干燥。在整个操作过程中根据需要重复此步骤。
11. 进行后弹力层的部分剥离：
    1. 从连接管与真空台的连接处开始，使用张开的镊子，将一端置于划痕边缘，轻轻将后弹力层和内皮层从基质层分离。（图7）
    2. 将后弹力层和内皮层从划痕边缘分离不超过1 mm，并沿360°方向继续剥离。（图8）
    3. 若发现微小撕裂，可用皮肤标记笔在真空台上对应位置标记一个点。
       注意：如果环钻未完全穿透后弹力层，可在需要的位置使用预处理的30 G针头斜面完成划痕，必要时再次染色。如果后弹力层黏附性阻碍了部分剥离，可根据需要去除环钻区域外的内皮层。
12. 使用镊子去除任何重叠在划痕线上的内皮组织残余。
13. 参考先前标记的微小撕裂位置，旋转真空台，使最大的撕裂位于6点钟方向。该位置将作为瓣膜的铰链。
14. 使用镊子在12点钟方向夹住后弹力层。通过向铰链方向剥离，轻轻将后弹力层从基质层分离。在距离划痕线2 mm处停止分离，形成铰链。
    注意：瓣膜的周边边缘在分离过程中会开始卷曲。（图9）
15. 轻柔地将瓣膜复位至基质层上。使用BSS和棉签尖端展开卷曲的内皮层，并使其恢复至原始位置。（图10A-C）
16. 使用无菌棉签尖端清除后弹力层与基质层之间的残留液体，以确保瓣膜保持原位。（图11）
17. 使用无菌棉签尖端吸干铰链附近巩膜上的多余水分。用皮肤标记笔在巩膜边缘画一个箭头，指向铰链中心，并用无菌棉签尖端擦去多余的墨迹。（图12）
18. 通过按压连接至真空台的注射器活塞释放真空。在真空解除后，使用镊子将角膜从真空台上取下。
19. 使用铝箔片作为屏障，掀开观察室的盖子。将角膜放入观察室，内皮面朝上，然后重新盖上观察室的盖子。
20. 如有配对角膜，重复上述操作步骤。处理第二份组织前，使用纱布清洁真空台。
21. 拧紧观察室的盖子，并将组织移出操作区域。
22. 按照《生物危害废物管理计划》处置相关物品，拆除无菌区域。脱去污染的手套和防护服，洗手后戴上非无菌手套。
23. 对角膜（或角膜样本）进行术后裂隙灯评估和角膜内皮显微镜检查，并记录结果。

结果

在DMEK手术中，正确分离Descemet膜（DM）与内皮层和基质层对于制备预切组织至关重要。本研究使用了50例供体角膜，供体平均年龄为65 ± 6岁（范围55-75岁），死亡至处理时间为5.9 ± 2.3天（范围1-10天），内皮细胞密度（ECD）为2,616 ± 321个细胞/mm²（范围2,049-3,247）。由两名眼库技术人员评估该手术制备技术的可行性与可重复性。前25例的成功率为72%，后25例提高至80%，总体成功率为76%。采用点双列相关（Rpb）分析术前组织因素与成功率之间的相关性。供体年龄（Rpb = 0.18）、死亡至处理时间（Rpb = 0.07）和ECD（Rpb = -0.11）均与组织成功制备无显著相关性。制备后ECD（n = 37）为2,676 ± 284（范围2,041-3,205），与制备前ECD相比无显著差异（p = 0.72）。制备失败的原因包括DM撕裂（10%）和严重细胞丢失（14%）。这些病例还伴有组织重新装片困难以及DM边缘染色不全。

眼库对患者预后的评估为DMEK手术的临床成功及不良事件提供了关键数据，这些信息有助...

讨论

角膜内皮细胞层通过脱水作用在维持角膜透明性方面发挥关键作用。内皮细胞疾病可导致显著的视力损害。DMEK旨在用供体移植物替代病变的内皮细胞，该移植物包含后弹力层（Descemet’s membrane）和内皮细胞层。供体组织制备过程中保持后弹力层完整并具备足够的内皮细胞数量，对移植物存活至关重要。供体组织制备期间后弹力层撕裂可能导致组织丢失和供体材料浪费。由于移植物制备困难以及手术技术复杂，DMEK的广泛应用受到限制。随着器械的改进以及眼库预先切割组织的可获得性提高，该手术有望成为角膜内皮疾病的标准化治疗方法。

目前供体组织制备的技术包括使用气泡将基质膜（DM）与基质层分离，以促进从供体角膜上移除移植物组织¹⁰。DMEK移植物制备中的SCUBA（在背景远离条件下浸没角膜）技术，是指在Optisol或平衡盐溶液（BSS）下获取供体组织，从而降低表面张力并减少撕裂风险¹¹。另一种DMEK移植物制备技术是保留周边的基质环，所得移植物更易于操作和植入¹²。供体组织也可使用定制的角膜刀进行制备，在用BSS抬起移植物时保留完整的D...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
视觉蓝（VisionBlue）	D.O.R.C.，祖伊兰，荷兰	NA
巴伦真空穿孔器（Barron vacuum punch）	Katena，丹维尔，新泽西州，美国	K20-2112