急性分离七鳃鳗网状脊髓轴突以实现对单个功能性突触前终末释放面膜的记录

摘要

在突触前释放面膜上记录 Ca²⁺ 电流，对于精确理解 Ca²⁺ 内流与神经递质释放至关重要。我们介绍一种急性分离七鳃鳗脊髓的方法，可获得具有功能的分离网状脊髓轴突，从而能够直接对单个突触前末梢的释放面膜进行记录。

摘要

突触传递是一个极其迅速的过程。动作电位引发的Ca²⁺ 通过位于释放面膜上的电压门控钙通道（VGCCs）流入突触前末梢，是囊泡融合和神经递质释放的触发因素。突触传递快速性的关键在于动作电位到达、VGCCs以及神经递质释放机制之间在空间和时间上的同步性。能够直接记录单个突触前末梢释放面膜上的Ca²⁺ 电流，对于精确理解突触前Ca²⁺ 与神经递质释放之间的关系至关重要。在大多数实验体系中，无法接触到突触前释放面膜进行电生理记录，因此突触前Ca²⁺ 内流通常通过成像技术和宏观电流测量来表征——这些技术的时间分辨率不足以清晰观察Ca²⁺内流过程。直接在单个突触前末梢上对VGCCs进行表征，在中枢突触中一直未能实现，迄今为止仅在鸡睫状神经节的壶腹型突触以及大鼠的壶腹结构中成功完成。我们通过建立一种急性分离的脊髓制备方法，成功解决了这一问题，该制备可获得带有功能性突触前末梢但无突触后结构的分离网状脊髓轴突，来源于八目鳗脊髓中的巨大网状脊髓突触。我们可以对单个突触前末梢进行荧光标记和识别，并靶向其进行记录。利用该制备，我们结合免疫组织化学和电生理学方法，直接在单个突触前末梢的释放面膜上对VGCCs进行了表征。我们首次在中枢突触中直接记录到了单个突触前末梢释放面膜上的Ca²⁺电流，这是此类记录在中枢突触中的首次实现。

引言

突触传递是一个极其快速且精确的过程。动作电位侵入突触前终末，导致位于释放面膜上的电压门控钙通道（VGCCs）开放，由此引起的突触前Ca²⁺浓度升高作为囊泡融合和神经递质释放的触发信号¹。所有这些步骤均在数百微秒内完成²，因此需要VGCCs与囊泡融合机制之间存在紧密的空间耦合³。突触前Ca²⁺流主要通过使用Ca²⁺敏感染料的成像技术进行表征⁴。通过引入可调节突触前神经元内Ca²⁺的Ca²⁺缓冲剂，已被用于间接研究突触前钙离子与神经传递之间的关系³。此外，通过Ca²⁺解笼释放技术调节突触前游离Ca²⁺浓度，或记录宏观Ca²⁺电流，并结合囊泡融合和/或释放的测量方法（如电容测量⁶或突触后反应²），也被用于探讨相同问题。然而，直接在释放面——即突触前膜中将膜去极化转化为触发突触囊泡融合和神经递质释放的Ca²⁺电流的特化区域——对Ca²⁺电流进行表征，对于精确测定突触囊泡融合所需的Ca²⁺水平至关重要。此外，能够在单个突触前终末直接表征Ca²⁺电流，并同时精确测量囊泡融合与释放，有助于清晰阐明动作电位时程、突触前Ca^2+....

方案

1. 聚-D-赖氨酸盐酸盐的制备

1. 在0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）中配制1 mg/ml的聚-D-赖氨酸氢溴酸盐溶液。
2. 分装后于-20 °C保存。

2. 盖玻片的多聚赖氨酸包被

注意：所有清洗和包被步骤均须在层流室中进行。

1. 将盖玻片放入含有 1 N 盐酸（HCl）的培养皿中，处理 2 小时。
2. 吸除全部 HCl，并用 70% 乙醇（EtOH）冲洗 2–3 次。
3. 在 70% EtOH 中静置 1 小时。
4. 吸除全部 70% EtOH，并用 100% EtOH 冲洗 2–3 次。
5. 在 100% EtOH 中静置 2 小时，然后吸除所有 EtOH。
6. 用滤纸吸干，并在空气中干燥数秒钟。
7. 将盖玻片置于 1 mg/ml 多聚赖氨酸溶液中过夜。
8. 次日用 Millipore 水冲洗盖玻片 4–5 次。
9. 将涂有多聚赖氨酸的盖玻片置于洁净培养皿中的玻璃滚轴上，自然晾干。
10. 进行免疫组织化学实验时，使用 35 × 10 mm 培养皿盖。制备硅胶（聚二甲基硅氧烷，PDMS）包被的培养皿：将 PDMS（弹性体与固化剂按重量比 10:1 混合）倒入培养皿中，厚度约为 0.3 cm，在 30 ....

结果

该解离方案可获得健康且功能完整的分离性网状脊髓轴突，其不含突触后投射图2f，但仍保留功能性的突触前终末，能够进行诱发的突触小泡胞吐和内吞作用图4c和图4d。在光学显微镜下可清晰辨认分离的网状脊髓轴突区域，该区域无其他神经元突起干扰，从而可无阻碍地接触网状脊髓轴突膜图2f。轴突在解离后仍保持结构完整性。采用全细胞膜片钳技术对分离轴突进行记录，并灌注Alexa Fluor 488 肼。染料在轴突内均匀分布，且未观察到染料从轴突泄漏图4a。

讨论

我们的解离方案具有重要意义，能够获得孤立的网状脊髓轴突，这些轴突不含突触后投射图2f，但仍保留功能性的突触前终末图4c 和图4d。由于不存在突触后结构与突触前终末相对，因此可直接记录单个突触前终末的突触前释放面膜，这在此前的中枢突触中无法实现，仅在两种杯状突触前终末中成功实现：鸡睫状神经节的杯状突触^7-10和大鼠的杯状终末^11,12。通过使用FM 1-43标记再循环囊泡簇，可识别出在电镜水平上已被证实具有简单单活性区的单个突触前终末²¹，并可对其进行靶向记录图4c 和图4d。可在单个突触前终末的释放面膜上记录到Ca²⁺电流图4f。直接从单个突触前终末的释放面膜记录Ca²⁺电流具有重要意义，因为这是首次在中枢突触上实现此类记录。该制备方法的生理相关性体现在轴突在解离后仍保持功能，使得所记录的突触前终末具有与完整.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 注射器滤膜	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm 盖玻片	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 标记的山羊抗兔二抗	Invitrogen/Life Technologies	A21070
防冻液	Prestone
硼酸	Sigma-Aldrich	B7660
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
明场光源	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
氯化钙	Sigma Aldrich	C4901
来自溶组织梭菌的 I 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C9891
盖玻片	Fisher-Scientific	12-545-J
右旋糖	Sigma-Aldrich	D9559
数字 CCD 相机	Hamamatsu	C8484-03G01
解剖精细镊子	Fine Science Tools	91150-20
解剖镊子	Fine Science Tools	11251-20
解剖显微镜	Leica Biosystems	Leica MZ 12
解剖剪刀	Fine Science Tools	15025-10
精细解剖剪刀	Fine Science Tools	91500-09
超精细解剖剪刀	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
高真空润滑脂	Dow-Corning
盐酸	Fisherbrand	SA-56-500
浸油	Fisher-Scientific	M2000
工业级氮气罐	Praxair	UN1066
昆虫针	Fine Science Tools	26002-10
液体缝合胶	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	本实验所用缝合胶由其他实验室提供，目前已停产。我们已从 Aesculap（Ts1050071FP）采购 Histoacryl 缝合胶用于后续实验
氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
甲醇	Sigma-Aldrich	154903
脱脂干奶粉	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
灌流泵	Cole-Palmer	Masterflex C/L
培养皿 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
培养皿 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P1024	分子量 > 300,000
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5379
一抗 R 型钙通道抗体	Alomone Labs	ACC-006
来自灰色链霉菌的蛋白酶 XIV 型	Sigma-Aldrich	P5147
手术刀片	World Precision Instruments	500240
Schott Duran 加压瓶	Fisher-Scientific	09-841-006
用于涂抹胶水的硅胶管	Cole-Palmer	07625-26
切片底板	Leica Biosystems	14046327404
切片室	Leica Biosystems	14046230132
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
氢氧化钠		S8045
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763
四硼酸钠	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 硅胶弹性体试剂盒	Dow Corning	SYLGARD® 160	制备方法：按重量比 10:1 混合弹性体 A 和弹性体 B
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	Dow Corning	SYLGARD® 184	制备方法：按重量比 10:1 混合弹性体与固化剂
聚四氟乙烯涂层镊子	Fine Science Tools	11626-11
三卡因甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	A5040
振动切片机刀片	World Precision Instruments	BLADES
氙灯	Nikon